CN105331572A - 一种发酵高产dha的方法 - Google Patents
一种发酵高产dha的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105331572A CN105331572A CN201510897600.7A CN201510897600A CN105331572A CN 105331572 A CN105331572 A CN 105331572A CN 201510897600 A CN201510897600 A CN 201510897600A CN 105331572 A CN105331572 A CN 105331572A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strong oxidizer
- dha
- domestication
- strain
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 23
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 title description 88
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 title description 43
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 title description 43
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 45
- 241000003595 Aurantiochytrium limacinum Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 28
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 9
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 6
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 claims description 5
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 5
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 claims description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241001467333 Thraustochytriaceae Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000020978 long-chain polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种发酵高产DHA的方法，该方法包括利用含强氧化剂的培养基驯化裂殖壶菌菌种，利用发酵培养基培养经驯化的菌种，以此发酵高产DHA。其中，驯化后的菌种经发酵，DHA含量到达57.9%，产油效率达到0.492g/L/h，分别比对照提高了约20%，55%。本驯化方法不涉及基因工程方法，不危害环境，不增加人力物力，简单、方便且具有经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及裂殖壶菌菌种的驯化以及利用驯化的菌种进行DHA生产的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(22:6n-3)，简称DHA，是ω-3系列中一种重要的多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)。DHA不仅是婴幼儿大脑、视觉正常发育的必需物质，而且还具有延缓老年人大脑和视觉功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反应、抑制肿瘤等功效，因此被誉为“脑黄金”。目前，DHA已广泛用于婴幼儿食品、保健食品和辅助治疗剂等产品。
目前，传统鱼油来源的DHA油脂由于易受环境、季节等的影响，导致DHA产量有限；而且，鱼油具有胆固醇和其它不饱和脂肪酸含量高，分离纯化困难的缺点。因此，利用微生物发酵制备DHA油脂越来越受到关注。能够合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壶菌、裂殖壶菌、隐甲藻等。而裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)作为海洋真菌，因其具有发酵周期短，生产DHA油脂能力强等的优点，而成为当前微生物发酵产DHA的常用菌种。裂殖壶菌合成的脂肪酸组分较为单一，总脂含量达20％，其中DHA占45％左右，其它不饱和脂肪酸百分率小于1％，因此利用裂殖壶菌生产DHA具有广大的市场前景。
目前，关于微生物发酵产DHA的现有技术主要包括两个方面：1、DHA生产菌株的诱变筛选方法，如中国海洋大学的(海洋真菌裂殖壶菌0UC88的工业应用)(中国专利申请CN200410075426.X)；南京工业大学的一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法及其应用(中国专利申请CN200910033493.8)等；2、关于培养基的组成，如南京工业大学的一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法(200910033869.5)等。传统的发酵调控过程难以稳定控制，并且发酵调控主要针对油脂含量的提高，没有从根本上提高DHA含量。而菌种的传统改造主要都通过诱变筛选的方法，此方法由于缺乏针对高DHA含量菌种的筛选培养基，造成筛选工作盲目，因此，菌种筛选工作量较大，而筛选效果却往往不够理想。因此新的菌种选育方法，对提高裂殖壶菌中DHA含量具有重要意义。
发明内容
针对现有方法中，菌种选育过程相对盲目的技术问题。本发明通过提供一种驯化裂殖壶菌的方法，来实现DHA的高产。
具体的，本发明的技术方案为：
一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其中，在驯化培养基中添加了强氧化剂。本发明中，可以理解为，驯化裂殖壶菌的方法通过将裂殖壶菌在含有强氧化剂的培养基中培养驯化实现。
本发明所述的方法，其中，所述驯化培养基配方包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素；其中，碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉；无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种；微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
本发明所述的方法，其中，驯化的具体步骤为：
(1)在活化培养基中活化菌种；
(2)在添加强氧化剂的驯化培养基中，接种经活化的菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
(3)将步骤(2)得到的驯化菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(4)提高驯化培养中强氧化剂的浓度，接种经步骤(3)得到的驯化菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
(5)循环步骤(2)、(3)和步骤(4)，直至驯化菌种能够在含有强氧化剂质量浓度为0.1％的驯化培养基中正常生长至细胞干重25g/L。
本发明所述的方法，其中，循环步骤(2)、(3)和步骤(4)的次数为2次以上。对于该循环此次的定义，应理解为，每循环操作培养一次，驯化培养基中强氧化剂的浓度提高一次，直至到最高的强氧化剂浓度。优选为3次，4次，5次，6次。
本发明所述的方法，其中，步骤(2)中第一次添加强氧化剂的初始质量浓度含量为0.01％。
本发明所述的方法，其中，步骤(4)所述循环步骤中，强氧化剂的质量浓度优选依次控制为：0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％。
本发明所述的方法，其中，步骤(2)、(3)和步骤(4)中，所述接种的接种量为培养基体积的0.2～2％。
本发明所述的方法，其中，所述强氧化剂为高锰酸钾或过氧化氢。
本发明所述的方法，其中，所述强氧化剂的除菌方式为膜过滤。其中膜过滤的方式即为，将强氧化剂配制为相应浓度要求的溶液，然后通过膜过滤可以去除污染细菌，使得过滤后的溶液符合裂殖壶菌培养的要求。
一种发酵高产DHA的方法，其中，采用上述任一权利所述方法获得的菌株进行DHA发酵、提取，获得含DHA的油脂。即，利用驯化的菌种进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌菌体，并提取油脂。对于菌株的选择，可以是能够耐受质量含量0.1％强氧化剂且在培养时，生长细胞干重已经超过25g/L的菌株；也可以是耐受更低强氧化剂质量含量浓度的菌株。
更进一步的，在一个整体优选的方案中，方法包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌菌种的活化
(2)在强氧化剂质量浓度为0.01％的过氧化氢溶液的驯化培养基中，接入活化后的裂殖壶菌菌种；驯化数天，待裂殖壶菌生物量生长至25g/l以上。
(3)将步骤(2)获得的菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(4)将步骤(3)获得的菌种接入强氧化剂质量浓度为0.02％的过氧化氢溶液的驯化培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(5)如此不断逐步提高强氧化剂添加浓度，重复2,3步骤长期驯化，直到驯化菌种能够在含有0.1％强氧化剂培养基中正常生长，其中，驯化培养基中的强氧化剂浓度依次控制为0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％。。
(6)利用能够耐受质量含量0.1％强氧化剂且在培养时，生长细胞干重已经超过25g/L的菌株进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌菌体，并提取油脂。
步骤(1)中，原始菌种的活化方法为：将具有合成DHA能力的微生物接种于种子培养基中，25℃培养24小时，待种子生长至对数期。其中，所述的种子培养基包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素，其中碳源为葡萄糖，氮源为酵母粉，无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种，微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
步骤(2)中，将活化的种子接入含有0.02％强氧化剂培养基中，接种量为1％-3％(v/v)，25℃培养24小时，过氧化氢的除菌方式为膜过滤。
步骤(4)中，菌种适应强氧化剂环境的指标为种子液干重达到25g/L,
步骤(5)中，发酵方法为：将种子液接种于发酵培养基中，
发酵培养基配比为：葡萄糖80～100g/L、酵母膏4～6g/L、MgSO4·7H2O3～5g/L、Na2SO46～9g/L、(NH4)2SO42～4g/L、KCl0.1～0.5g/L、谷氨酸钠17～20g/L、KH2PO42～4g/L。接种量为10％(v/v)，培养条件为25℃～28℃，150rpm～170rpm。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供一种全新的驯化改造菌种的方法，目的性强，效率高。通过驯化得到的菌株生长活力旺盛，耗糖耗氮速率加快，发酵周期短，产油率高，DHA含量比原始菌株提高18.75％，并且驯化后菌株的生理生化稳定，具有稳定的遗传性能，是生产天然DHA的优良藻株。
(2)在实现本发明的过程中，发明人发现，在添加了强氧化剂的培养基中进行裂殖壶菌的培养，其DHA的含量会明显提高，基于此发现，发明人提供了本发明方案。
(3)本发明的技术原理可能在于，在生物体内，DHA作为一种长链多不饱和脂肪酸，具有抗氧化保护细胞的功能。在培养基中添加了强氧化剂后，细胞会主动合成DHA以适应恶劣的环境；同时，只有DHA合成能力强的菌株才能在含有强氧化剂的环境下存活，因此同时达到了筛选高产DHA菌株的目的。
具体实施方式
实施例1本实施例说明菌株的来源以及使用的培养基
菌种为裂殖壶菌HX-308，CCTCCNo:M209059，由南京工业大学分离保藏。
活化培养基和种子培养基：葡萄糖20～60g/L、酵母膏2～4g/L、MgCl23～6g/L、CaCl2·2H2O1～4g/L、KH2PO42～4g/L、谷氨酸钠8～12g/L、KCl1～4g/L、NaCl15～20g/L、FeCl30.1～0.3g/L、MgSO4·7H2O1～5g/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
驯化种子培养基：葡萄糖20～60g/L、酵母膏2～4g/L、MgCl23～6g/L、CaCl2·2H2O1～4g/L、KH2PO42～4g/L、谷氨酸钠8～12g/L、KCl1～4g/L、NaCl15～20g/L、FeCl30.1～0.3g/L、MgSO4·7H2O1～5g/L，不同浓度的过氧化氢或高锰酸钾。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，选定与本实施例种子培养基一致的配方，但需要另外加入过氧化氢或者高锰酸钾。
发酵培养基：葡萄糖80～100g/L、酵母膏4～6g/L、MgSO4·7H2O3～5g/L、Na2SO46～9g/L、(NH4)2SO42～4g/L、KCl0.1～0.5g/L、谷氨酸钠17～20g/L、KH2PO42～4g/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
实施例2本实施例说明裂殖壶菌驯化的具体步骤
将具有二十二碳六烯酸产生能力的裂殖壶菌活化一代，活化的方法为：
接种于含有0.02％过氧化氢或高锰酸钾的培养基中，接种量为1％(v/v)，25℃条件下培养24小时。驯化3天，当裂殖壶菌适应了0.02％强氧化剂环境，接入正常培养基中培养一代。再将驯化菌种接入含有0.03％强氧化剂的培养基中，驯化5天，当裂殖壶菌适应了0.03％强氧化剂环境，接入正常培养基中培养一代。再将驯化菌种接入含有0.04％强氧化剂的培养基中，驯化5天。如此不断重复，逐渐提高强氧化剂浓度为0.05％，0.06％,0.07％,0.08％,0.09％,0.1％。当驯化菌种能够在含有0.1％强氧化剂培养基中正常生长时，将驯化菌种接入正常不含强氧化剂的培养基中生长一代，保藏驯化菌株。
实施例3不同驯化浓度的驯化菌株与原始菌种的发酵性能对比
每提高一个过氧化氢或者高锰酸钾浓度，就对驯化菌种进行发酵验证考察驯化菌种产生DHA能力的变化。将上述种子液以10％(v/v)接种量接入到经过121℃灭菌30min的100mL发酵培养基中，发酵培养条件为：温度25℃、转速150rpm，待培养基中90g/L葡萄糖耗尽终止发酵，分别测定细胞干重，脂肪酸含量以及DHA含量。与原始菌种同样条件下发酵参数进行对比。
表1：不同驯化浓度的过氧化氢驯化菌株及原始菌株发酵结果对比
如表1所示，最终能够在含有0.1％浓度的过氧化氢培养基中正常生长的驯化菌种发酵时间比原始菌种缩短了15％，DHA产量提高了65.48％。
表2：不同驯化浓度的高锰酸钾驯化菌株及原始菌株发酵结果对比
如表2所示，最终能够在含有0.1％浓度的高锰酸钾培养基中正常生长的驯化菌种发酵时间比原始菌种缩短了15％，DHA产量提高了51.07％。
实施例4最终驯化菌种的5L发酵罐补料发酵
将最终适应0.1％过氧化氢，高锰酸钾的驯化菌种种子液以10％(v/v)的接种量接入以及灭菌的装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵过程中以植物油为消泡剂，于25℃、1vvm的通气比率、150rpm的搅拌转速下发酵培养3-4天。结果见表3：最终利用过氧化氢驯化的菌种DHA生产能力最高，与原始菌种相比，油含量提高了20％，DHA含量提高了14.76％，DHA产量达到38.07g/L。
表3：添加强氧化剂最终驯化菌株驯化前后发酵对比
Claims (10)
1.一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其特征在于：在驯化培养基中添加了强氧化剂。
2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述驯化培养基配方包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素；
其中，碳源为葡萄糖；
氮源为酵母粉、谷氨酸钠、硫酸铵中的一种或者多种；
无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种；
微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
3.一种驯化裂殖壶菌的方法，其特征在于，驯化的具体步骤为：
（1）在活化培养基中活化菌种；
（2）在添加强氧化剂的驯化培养基中，接种经活化的菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
（3）将步骤（2）得到的驯化菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
（4）提高驯化培养中强氧化剂的浓度，接种经步骤（3）得到的驯化菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
（5）循环步骤（2）、（3）和步骤（4），直至驯化菌种能够在含有强氧化剂质量浓度为0.1%的驯化培养基中正常生长至细胞干重25g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，循环（3）和步骤（4）的次数为2次以上。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中第一次添加强氧化剂的初始质量浓度含量为0.01%。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述循环步骤中，强氧化剂的质量浓度依次控制为：0.02%，0.03%，0.04%，0.05%，0.06%，0.07%，0.08%，0.09%，0.1%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）、（3）和步骤（4）中，所述接种的接种量为培养基体积的0.2~2%。
8.上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述强氧化剂为高锰酸钾或过氧化氢。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述强氧化剂的除菌方式为膜过滤。
10.一种发酵高产DHA的方法，其特征在于，采用上述任一权利所述方法获得的菌株进行DHA发酵、提取，获得含DHA的油脂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510897600.7A CN105331572B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种发酵高产dha的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510897600.7A CN105331572B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种发酵高产dha的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105331572A true CN105331572A (zh) | 2016-02-17 |
| CN105331572B CN105331572B (zh) | 2018-11-20 |
Family
ID=55282340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510897600.7A Active CN105331572B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种发酵高产dha的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105331572B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106987528A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-07-28 | 厦门汇盛生物有限公司 | 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用 |
| CN108004149A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-08 | 海南大学 | 一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法 |
| CN109504646A (zh) * | 2017-09-15 | 2019-03-22 | 武汉藻优生物科技有限公司 | 一种获得高dha含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐 |
| CN110846232A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-28 | 南京工业大学 | 一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用 |
| US10941185B2 (en) | 2017-05-31 | 2021-03-09 | Xiamen Huison Biotech Co., Ltd. | Strain of bacteria producing DHA and EPA, six gene fragments in the bacterial genome and their applications |
| CN112481189A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-12 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用 |
| CN114009625A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-02-08 | 南京师范大学 | 水产养殖饲料及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575584A (zh) * | 2009-06-18 | 2009-11-11 | 南京工业大学 | 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法 |
| CN101591617A (zh) * | 2009-06-15 | 2009-12-02 | 南京工业大学 | 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用 |
| JP2015149912A (ja) * | 2014-02-10 | 2015-08-24 | 国立大学法人 宮崎大学 | ヤブレツボカビ類を用いたカタラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法 |
-
2015
- 2015-12-08 CN CN201510897600.7A patent/CN105331572B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101591617A (zh) * | 2009-06-15 | 2009-12-02 | 南京工业大学 | 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用 |
| CN101575584A (zh) * | 2009-06-18 | 2009-11-11 | 南京工业大学 | 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法 |
| JP2015149912A (ja) * | 2014-02-10 | 2015-08-24 | 国立大学法人 宮崎大学 | ヤブレツボカビ類を用いたカタラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王成涛等: "《天然食品配料--生产及应用》", 30 June 2010, 化学工业出版社 * |
| 魏萍等: "裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展", 《食品工业科技》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106987528A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-07-28 | 厦门汇盛生物有限公司 | 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用 |
| CN106987528B (zh) * | 2017-05-31 | 2020-05-05 | 厦门汇盛生物有限公司 | 一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用 |
| US10941185B2 (en) | 2017-05-31 | 2021-03-09 | Xiamen Huison Biotech Co., Ltd. | Strain of bacteria producing DHA and EPA, six gene fragments in the bacterial genome and their applications |
| CN109504646A (zh) * | 2017-09-15 | 2019-03-22 | 武汉藻优生物科技有限公司 | 一种获得高dha含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐 |
| CN108004149A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-08 | 海南大学 | 一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法 |
| CN108004149B (zh) * | 2017-12-14 | 2020-11-03 | 青岛洪邦生物技术有限公司 | 一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法 |
| CN110846232A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-28 | 南京工业大学 | 一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用 |
| CN110846232B (zh) * | 2019-12-04 | 2021-08-03 | 南京工业大学 | 一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用 |
| CN112481189A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-12 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用 |
| CN112481189B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-08-09 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用 |
| CN114009625A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-02-08 | 南京师范大学 | 水产养殖饲料及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105331572B (zh) | 2018-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105331572A (zh) | 一种发酵高产dha的方法 | |
| CN102888348B (zh) | 一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法 | |
| CN102888347B (zh) | 小球藻突变株及其应用 | |
| CN107523504A (zh) | 裂殖壶菌突变株 | |
| CN102465098B (zh) | 一种用于培养小球藻的培养基组合物 | |
| KR20220088912A (ko) | 스키조키트리움 및 그 응용, Sn-2 DHA가 풍부한 미생물 유지 및 그것의 제조 방법과 응용 | |
| WO2014091718A1 (ja) | 微細藻類の培養方法及び培養システム | |
| CN113308387B (zh) | 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 | |
| CN114907988B (zh) | 一株裂殖壶菌、其发酵液及应用 | |
| CN106916747A (zh) | 索罗金小球藻藻株及其培养方法和用途 | |
| CN104450529A (zh) | 一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用 | |
| CN105349588B (zh) | 利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法 | |
| CN104278107A (zh) | 一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法 | |
| CN103509832B (zh) | 一种以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐的发酵生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN103966271A (zh) | 发酵生产dha的方法 | |
| EP4036217A1 (en) | Method for producing astaxanthin by heterotrophic culture of haematococcus pluvialis | |
| CN102703321A (zh) | 一种筛选功能菌群的方法 | |
| CN107841464A (zh) | 一种藻类的培养方法 | |
| KR20120110295A (ko) | 조류 배양용 배지 조성물 및 조류 배양 방법 | |
| CN105087688A (zh) | 一种微生物油脂的生产方法 | |
| CN103099162A (zh) | L-乳酸酸菜的制作方法 | |
| CN103911292B (zh) | 一株耐受低盐的裂殖壶菌及其应用 | |
| CN104178446A (zh) | 一种乙酰胆碱及其类似物在促进微藻生长及微藻油脂积累中的应用 | |
| CN116376718B (zh) | 裂殖壶菌突变株及其在dha和ara联产方面的应用 | |
| CN103320331B (zh) | 一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230109 Address after: Room 207 and 208, building D6, Jiangsu Life Science Park, No. 9, Weidi Road, Xianlin street, Qixia District, Nanjing, Jiangsu 210000 Patentee after: Nanjing Zhihe Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 30, Puzhu South Road, Pukou District, Nanjing City, Jiangsu Province 211186 Patentee before: Nanjing Tech University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 207 and 208, building D6, Jiangsu Life Science Park, No. 9, Weidi Road, Xianlin street, Qixia District, Nanjing, Jiangsu 210000 Patentee after: Zhihe Biotechnology (Changzhou) Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 207 and 208, building D6, Jiangsu Life Science Park, No. 9, Weidi Road, Xianlin street, Qixia District, Nanjing, Jiangsu 210000 Patentee before: Nanjing Zhihe Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| CP03 | Change of name, title or address |