CN108004149A

CN108004149A - 一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法

Info

Publication number: CN108004149A
Application number: CN201711337450.XA
Authority: CN
Inventors: 路延笃
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN108004149B

Abstract

本发明公开了一种裂殖壶菌，分类命名为裂殖壶菌Aurantiochytrium sp,于2017年11月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCC No：14849，所述的裂殖壶菌可用于制备二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸油脂以及角鲨烯。本发明的菌株能耐受较高的发酵温度，能有效降低发酵成本；该菌株能在33℃‑37℃条件下快速生长，并大量积累多不饱和脂肪酸（二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸）和角鲨烯油脂。生长速度快，多不饱和脂肪酸油脂产量高。

Description

一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法。

背景技术

海洋占地球表面积的71%，蕴藏着丰富的特色海洋生物资源，这些特色生物资源产生独特新颖的生物活性成分，是新功能保健食品、生物制品和药物研发的重要战略新资源。多不饱和脂肪酸、虾青素、角鲨烯等主要来源于海洋的天然活性脂质，由于其独特的生理活性，对人体健康具有诸多生理功能，例如：促进神经系统和视觉系统的发育，防治心血管疾病，抗癌作用，抗炎作用，抗氧化作用等，具有广泛的应用市场。然而传统来源，如海洋鱼类捕捞等由于过度开发导致资源耗竭，难以满足社会日益增长的巨大需求。海洋微生物以其独特的生产环境而具有生产的各种活性物质的潜在基因，具有生产时间短、成本低、产量稳定、可实现大规模持续发展等明显优势，可以向社会提供物美价廉的包括二十二碳六稀酸（DHA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五稀酸（EPA）系列膳食补充剂、医药中间体、化妆品原料等。因此，利用海洋微生物进行多不饱和脂肪酸、虾青素、角鲨烯等天然活性脂质的绿色高效生产，以部分或完全取代传统动植物中的天然活性物质成分，已经成为各国研发人员的热门课题，有广阔的市场前景。

目前从通过微生物生产包括多不饱和脂肪酸等各种活性物质的研究多集中于培养条件的优化，这在一定程度上能提高产量，但总体上并不明显。如Peng等通过往高山被孢霉ME-1发酵培养基中添加前体化合物正十六烷，使ARA的含量提高28.9%。温少红等研究发现，高光强培养的紫球藻细胞中类脂的含量是低光强培养下的2.1倍，在弱光下有利于ARA的合成，中等光强则对EPA的积累有利。Chang等从分离自海洋的一株产角鲨烯和多种不饱和脂肪酸的酵母菌株，在葡萄糖和酵母提取物比例为4.5时为产角鲨烯的最佳比率，产角鲨烯的最佳葡萄糖浓度为4g/L，最佳氮为硝酸钠，此时菌体生物量为5.20g/L，角鲨烯产量340.52mg/L，高于以往报道的产角鲨烯菌株，显示出海洋微生物在这方面的挖掘潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐受高温发酵、生长速度快、并高产多不饱和脂肪酸特别是二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸油脂以及角鲨烯的裂殖壶菌菌株，以及利用其高密度发酵生产高附加值脂质产品的方法。

本发明的技术方案为：

从海南省海口市红树林水域中筛选得到了一株可高产高附加值脂类物质，特别是二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸油脂及角鲨烯的海洋原生生物裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌Aurantiochytrium sp，实验室命名为裂殖壶菌 HNL104菌株，已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为 CGMCC No：14849，保藏日期 2017年11月2日。

本发明涉及到的菌种有如下特征：

所述裂殖壶菌菌株是从海南省海口市红树林水域收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。在光学显微镜下观察：细胞呈圆球形，直径在15微米左右，在营养较好的培养条件下主要采用连续二分裂的方式实现快速增殖，有侧生鞭毛。其细胞内脂肪酸组成主要为软脂酸、二十二碳五烯酸（DPA) 和二十二碳六烯酸（DHA)，其中多不饱和脂肪酸（DPA和DHA）含量占总脂肪酸的60%以上，此外细胞中还含有大量角鲨烯，角鲨烯含量大于细胞内总脂质含量的7%。利用分子生物学研究方法对其18S rDNA 序列进行比对分析，发现该菌株与裂殖壶菌的18S rDNA 序列的同源性大于99%，因此判定本菌株属于裂殖壶菌，该序列记作SEQ IDNO.1。

本发明的菌株可利用的碳源包括淀粉，纤维二糖，葡萄糖，甘油等。可利用的氮源广泛，包括有机氮源和无机氮源均可利用，其中包括酵母提取物，尿素，玉米浆，蛋白胨，铵盐与硝酸盐。

本发明的菌株最适温度高、生长速度快，具有广泛的温度耐受性，从20℃-40℃均可正常生长，在25℃下可正常保种，但其最适生长温度为33℃-37℃，发酵90小时后能获得最大的生物量与多不饱和脂肪酸（PUFAs）及角鲨烯油脂产量。

本发明所述的高密度发酵工艺包括如下方面:

发酵培养基中包含：葡萄糖30-60 g/L，酵母膏1-10 g/L，玉米浆1-20 g/L，豆粕水解液10-40 g/L，磷酸二氢钾0.5-8 g/L，酒石酸钠0.2-2 g/L，海盐3-20 g/L，维生素B₁ 30-100mg/L，生物素2-20 mg/L，泛酸钙 2-10 mg/L。

发酵过程中，每隔4-6小时取样测量葡萄糖浓度并进行补糖操作以控制体系中葡萄糖浓度在10-15 g/L之间，发酵时间为80-90 h，发酵结束时葡萄糖浓度不高于5 g/L。发酵结束前10-15小时内，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.01%-0.1%。

发酵过程中，温度控制为33℃-37℃，发酵时间为80-90小时。

本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：

本发明从海南省海口市红树林水域中筛选得到了一株可高产高附加值脂类物质，特别是多不饱和脂肪酸（主要包括二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸）和角鲨烯的海洋原生生物裂殖壶菌Aurantiochytrium sp，随后并阐明了其最佳的培养条件，显示其具有很好的工业应用潜力。

（1）能耐受较高的发酵温度，能有效降低发酵成本。该菌株能在33℃-37℃条件下快速生长，并大量积累多不饱和脂肪酸（二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸）和角鲨烯油脂。

（2）生长速度快，多不饱和脂肪酸油脂产量高。在上述发酵条件下，在33℃-37℃下，在80-90小时内细胞干重达到220 g/L，多不饱和脂肪酸（PUFAs）油脂产量为80-90 g/L，角鲨烯产量为8-10 g/L。

（3）利用豆粕水解液作为发酵氮源，有效降低发酵成本。

（4）在发酵结束前10-15小时内加入双氧水，有效提高角鲨烯产量。

附图说明

图1是本发明的菌株在显微镜下的形态，a为光学显微镜下观察，b为扫描电镜观察。

图2是利用MEGA5软件得到的菌株18S rRNA基因的进化树。

具体实施方式

实施例1

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在33℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24 h，获得一级种子；将一级种子接入装有100 ml 种子培养基的500 ml摇瓶中，在35℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12 h，获得二级种子；向3L生物反应器中加入1.2 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在35℃。发酵过程中，采用了补氮操作，发酵的24-48小时内流加20%（w/v）的酵母膏溶液。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2M NaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。在发酵65小时后，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.1%。总体发酵时间80小时。

离心收集菌体，冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的氯仿-甲醇法提取油脂并甲脂化，通过GC-MS测定菌体中脂肪酸的百分含量。采用Agilent-GC7890 A气相色谱仪，色谱柱为HP-INNOWax （30m × 250μm × 0.25μm），载气为高纯氮，设定程序升温为100℃保持1 min，然后每分钟升温15℃至240℃，240℃保持10 min，氢离子火焰检测器（FID）温度为260℃。恒流控制，氮气流量为30 mL/min，氢气流量为30 mL/min，空气流量为400 mL/min。进样量为1μL。角鲨烯测定方法为：采用HP- 5色谱柱(30 m ×0. 25 mm ×0.25 μm);载气为氮气，恒流模式，流速 1. 0 mL/min; 不分流进样1 μL。进样口温度为300℃; 检测器温度为300℃; 程序升温为初始温度100 ℃，以20 ℃ /min 升至300℃，保持15.33 min。

多不饱和脂肪酸和角鲨烯产量结果见表1。

发酵培养基配方为：葡萄糖30 g/L，酵母膏10 g/L，玉米浆1 g/L，豆粕水解液40g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，酒石酸钠0.2 g/L，海盐20 g/L，维生素B₁ 100 mg/L，生物素20mg/L，泛酸钙 10 mg/L。

发酵结束后，3L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为217 g/L，获得生物油脂143 g/L，PUFAs产量为92.3 g/L，角鲨烯产量为11.0 g/L。

表1 发酵后裂殖壶菌HNL104胞内脂肪酸组成情况及角鲨烯产量

脂肪酸	占总脂中的含量(%)
		C16:0	20.78
C18:0	2.15
		C18:2 n-6	0.32
C18:3 n-3	0.71
		C18:3 n-6	0.78
C20:5 n-3	0.45
		C22:5 n-6	17.36
C22:6 n-3	57.45
		Squalene	7.7

实施例2

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在25℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24 h，获得一级种子；将一级种子接入装有100 ml 种子培养基的500 ml摇瓶中，在30℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12 h，获得二级种子；向3L生物反应器中加入1.2 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在33℃。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2MNaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。发酵时间90小时，在发酵结束前10小时，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.05%。

发酵培养基中包含：葡萄糖60 g/L，酵母膏1 g/L，玉米浆20 g/L，豆粕水解液10g/L，磷酸二氢钾8 g/L，酒石酸钠2 g/L，海盐3 g/L，维生素B₁ 30 mg/L，生物素2 mg/L，泛酸钙 2 mg/L。

油脂，多不饱和脂肪酸及角鲨烯含量检测方法同实施例1。

发酵结束后，3L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为205 g/L，获得生物油脂123 g/L，PUFAs（DHA和DPA）产量为80.1 g/L，角鲨烯产量为11.2 g/L。

实施例3

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在33℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入装有100 ml 种子培养基的500ml摇瓶中，在35℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12h，获得二级种子；向5L生物反应器中加入3 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在37℃。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2M NaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。发酵时间90小时，在发酵结束前10小时，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.01%。

发酵培养基中包含：葡萄糖60 g/L，酵母膏10 g/L，玉米浆15 g/L，豆粕水解液30g/L，磷酸二氢钾7 g/L，酒石酸钠1 g/L，海盐15 g/L，维生素B₁ 30 mg/L，生物素2 mg/L，泛酸钙 10 mg/L。

油脂，多不饱和脂肪酸及角鲨烯含量检测方法同实施例1。

发酵结束后，5L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为195 g/L，获得生物油脂112 g/L，PUFAs产量为69.3 g/L，角鲨烯产量为8.1g/L。

实施例4

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在35℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入装有100 ml 种子培养基的500ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12h，获得二级种子；向5L生物反应器中加入3 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在40℃。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2M NaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。发酵时间100小时，在发酵结束前15小时，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.1%。

发酵培养基中包含：葡萄糖50 g/L，酵母膏8 g/L，玉米浆10 g/L，豆粕水解液40g/L，磷酸二氢钾8 g/L，酒石酸钠2 g/L，海盐20 g/L，维生素B₁ 30 mg/L，生物素20 mg/L，泛酸钙 10 mg/L。

油脂，多不饱和脂肪酸及角鲨烯含量检测方法同实施例1。

发酵结束后，5L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为153 g/L，获得生物油脂78 g/L，PUFAs产量为40.8 g/L，角鲨烯产量为6.1 g/L。

实施例5

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在33℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入装有150 ml 种子培养基的500ml摇瓶中，在35℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12h，获得二级种子；向10L生物反应器中加入6 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在35℃。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2M NaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。发酵时间75小时，在发酵结束前12小时，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.03%。

发酵培养基中包含：葡萄糖60 g/L，酵母膏10 g/L，玉米浆20 g/L，豆粕水解液40g/L，磷酸二氢钾8 g/L，酒石酸钠0.2 g/L，海盐15 g/L，维生素B₁ 30 mg/L，生物素2 mg/L，泛酸钙 10 mg/L。

油脂，多不饱和脂肪酸及角鲨烯含量检测方法同实施例1。

发酵结束后，10L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为210 g/L，获得生物油脂136 g/L，PUFAs产量为89.7 g/L，角鲨烯产量为11.6 g/L。

实施例6

将保存在甘油管的菌株接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，在20℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养24 h，获得一级种子；将一级种子接入装有100 ml 种子培养基的500 ml摇瓶中，在20℃的摇床中，以200 rpm的转速，培养12 h，获得二级种子；向3L生物反应器中加入1.2 L发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在20℃。发酵过程中通过流加80%的葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。自动添加2MNaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。发酵时间100小时，在发酵结束前15小时，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.01%。

发酵培养基中包含：葡萄糖60 g/L，酵母膏10 g/L，玉米浆20 g/L，豆粕水解液40g/L，磷酸二氢钾8 g/L，酒石酸钠2 g/L，海盐15 g/L，维生素B₁ 30 mg/L，生物素2 mg/L，泛酸钙 10 mg/L。

油脂，多不饱和脂肪酸及角鲨烯含量检测方法同实施例1。

发酵结束后，3L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为155 g/L，获得生物油脂84 g/L，PUFAs产量为62.8 g/L，角鲨烯产量为5.9 g/L。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种海洋原生生物及利用其发酵生产高附加值脂质产品的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1758

<212> DNA

<213> 裂殖壶菌 (Aurantiochytrium sp)

<400> 1

ccaacctggt tgatcctgcc agtagtcata tgctcgtctc aaagattaag ccatgcatgt 60

gtaagtataa gcgattgtac tgtgagattg cgaacggctc attatatcag taataatttc 120

ttcggtagtt tcttttatat ggatacctgc agtaattctg gaaataatac atgctgtaag 180

agccctgtat ggggctgcac ttattagatt gaagccgatt ttattggtga atcatgataa 240

ttgagcagat tgactatttt tggtcgatga atcgtttgag tttctgcccc atcagttgtc 300

gacggtagtg tattggacta cggtgactat aacgggtgac ggagagttag ggctcgactc 360

cggagaggga gcctgagaga cggctaccat atccaaggat agcagcaggc gcgtaaatta 420

cccactgtgg actccacgag gtagtgacga gaaatatcga tgcgaagcgt gtatgcgttt 480

tgctatcgga atgagagcaa tgtaaaaccc tcatcgagga tcaactggag ggcaagtctg 540

gtgccagcag ccgtggtaat tccagctcca gaagcatatg ctaaagttgt tgcagttaaa 600

aagctcgtag ttgaatttct ggcatgggcg accggtgctt tccctgaatg gggattgatt 660

gtctgtgttg ccttggccat ctttttcttt tctttttagg ggagaagtct ttcactgtaa 720

tcaaagcaga gtgttccaag caggtcgtat gaccggtatg tttattatgg gatgataaga 780

taggacttgg gtgctatttt gttggtttgc acgcctgagt aatgggttaa taggaacagt 840

tgggggtatt cgtatttagg agctagaggt gaaattcttg gatttccgaa agacgaacta 900

gagcgaaggc atttaccaag catgttttca ttaatcaaga acgaaagtct ggggatcgaa 960

gatgattaga taccatcgta gtctagaccg taaacgatgc cgacttgcga ttgttgggtg 1020

ctttattaat gggcctcagc agcagcacat gagaaatcaa agtctttggg ttccgggggg 1080

agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc aggagtggag 1140

cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat aggtaggatt 1200

gacagattga gagctctttc atgattctat gggtggtggt gcatggccgt tcttagttgg 1260

tggagtgatt tgtctggtta attccgttaa cgaacgagac ctcggcctac taaatagtgc 1320

gtggtatggc aacatagtac gttttaactt cttagaggga catgtccggt ttacgggcag 1380

gaagttcgag gcaataacag gtctgtgatg cccttagatg ttctgggccg cacgcgcgct 1440

acactgatgg gttcatcggg ttttaatttc aatttatgga attgagtgct tggtcggaag 1500

gcctggctaa tccttggaac gctcatcgtg ctggggctag atttttgcaa ttattaatct 1560

ccaacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgaatacg tccctgccct 1620

ttgtacacac cgcccgtcgc acctaccgat tgaacggtcc gatgaaacca tgggatgttt 1680

ctgtttggat taatttttgg acagaggcag aactcgggtg aatcttattg tttagaggaa 1740

ggtgaagtcg taacaagg 1758

Claims

1.一种裂殖壶菌，分类命名为裂殖壶菌 Aurantiochytrium sp,于2017年11月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为 CGMCC No：14849。

2.权利要求1所述的裂殖壶菌在制备二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸油脂以及角鲨烯上的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以所述裂殖壶菌为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵获得制备二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸油脂以及角鲨烯。

4.一种利用高密度发酵同时制备二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸油脂以及角鲨烯的方法，其特征在于，包括下列步骤：

发酵培养基中包含：葡萄糖30-60 g/L，酵母膏1-10 g/L，玉米浆1-20 g/L，豆粕水解液10-40 g/L，磷酸二氢钾0.5-8 g/L，酒石酸钠0.2-2 g/L，海盐3-20 g/L，维生素B₁ 30-100mg/L，生物素2-20 mg/L，泛酸钙 2-10 mg/L；

发酵过程中，每隔4-6小时取样测量葡萄糖浓度并进行补糖操作以控制体系中葡萄糖浓度在10-15 g/L之间，发酵时间为80-90 h，发酵结束时葡萄糖浓度不高于5 g/L；发酵结束前10-15小时内，加入双氧水使发酵体系内双氧水浓度为0.01%-0.1%；

发酵过程中，温度控制为33℃-37℃，发酵时间为80-90小时。