CN103380211A - 有高的产生角鲨烯的能的新颖微生物及由此的角鲨烯的制造方法 - Google Patents

有高的产生角鲨烯的能的新颖微生物及由此的角鲨烯的制造方法 Download PDF

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Abstract

提供特征在于是属于橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株，在所述菌株产生的全脂质中，角鲨烯是10质量%以上，并且形成呈橙色～红色的集落的菌株。

Description

有高的产生角鲨烯的能的新颖微生物及由此的角鲨烯的制造方法
【技术领域】
本发明涉及有高的角鲨烯（squalene）产生能的新颖微生物、及使用所述微生物的角鲨烯的制造方法。
【背景技术】
角鲨烯是甾醇类的合成中间体，一直以来作为健康食品在世界使用。近年发现、对角鲨烯自体有生理活性，放射线障碍防止效果、细胞的癌化防止效果，成为话题。另外，还原角鲨烯的角鲨烷除了作为化妆品的保湿剂被广泛利用之外、还作为机械的润滑油、及热交换介质利用。
角鲨烯的主要的供给源是深海鲨，以往的角鲨烯提取纯化法是收集深海鲨的肝脏，通过在热水中将细胞破碎来游离而收集油状油脂，并用吸附剂等纯化。但是，鲨由于自然界的捕获而其渔产量极其不稳定，供给不稳的价格的变动成为问题。另外近年、深海鲨被指定为灭绝濒危种而捕获受限制，即便从自然环境保护的观点看，也期待从深海鲨提取的以外的代替的角鲨烯制造方法的开发。
作为角鲨烯的代替制造方法，也已知小麦胚芽、米糠油、橄榄油等的植物原料的角鲨烯，例如，在橄榄油的情况中，不仅角鲨烯的含有量少，与角鲨烯近似的杂质的比例多，品质的评价也相比鲨角鲨烯更劣，被认为在商业生产中问题较多。
从而期望不以天然物作为原料而可提供稳定的角鲨烯的角鲨烯制造方法，想到了由微生物的角鲨烯的生产。例如，有报告从属于眼虫的原生动物每培养液1L产生最大49.4mg的角鲨烯（专利文献1：特开平7-115981）。其中虽然不清楚每干燥重量的产生量，在产生最高含量的脂质的条件下的全产生脂质类中的角鲨烯的含量停留在30%左右。另外，有报告称由镰孢菌（Fusarium）属的微生物最大得到29.176mg/g（干燥细胞）的角鲨烯，有必要对特定的微生物诱导变异（专利文献2：特开平5-90）。再者，有报告称从酵母等得到最多155.3mg/g（干燥细胞）的角鲨烯，但有必要进行变异诱导至将角鲨烯在体内蓄积，并且向培养基添加甾醇类（专利文献3：专利第2663039号）。
但是，在工业化之时，优选无需严密的控制，可用廉价的培养基及装置大量生产角鲨烯。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开平7-115981
专利文献2:特开平5-90
专利文献3:专利第2663039号
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明的课题是无需在特别的条件下的变异诱导或培养，并且以高收量提供角鲨烯。
【解决课题的技术方案】
本发明人等鉴于上述需求重复研究的结果，发现大量地产生角鲨烯，增殖性优良的微生物。再者发现，利用所述微生物，可有效生成角鲨烯，从而完成本发明。
本发明提供特征在于有产生角鲨烯的能力的，网粘菌（Labyrinthula）类、破囊壶菌（Thraustochytrid）科、属于橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株，所述菌株产生的全脂质中，角鲨烯是10质量%以上，并且形成呈橙色～红色的集落的菌株。另外，本发明提供角鲨烯的制造方法，其特征在于，将上述橙壶菌（Aurantiochytrium）新菌株在培养基中培养，采集增殖的所述菌株产生的角鲨烯。还有，本发明提供用于角鲨烯的制造的，上述橙壶菌（Aurantiochytrium）新菌株的用途。
【附图说明】
【图1】图1是在琼脂培养基中培养的本发明的筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株的照片。
【图2】图2是本发明的筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株的细胞的照片。
【图3】图3示将本发明的筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3产生的脂质用氧化硅胶纯化之后的，在薄层氧化硅胶的分析照片。
【实施方式】
本发明的有高的产生角鲨烯的能的微生物只要是属于橙壶菌（Aurantiochytrium）属的有产生角鲨烯的能力，并且呈橙色～红色（极大吸收波长在590～750nm左右）的微生物，任何均可。具体而言，例如，可使用作为本发明的新颖微生物的，筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株。
1.本发明的新菌株
本发明的新菌株从在冲绳县的海岸生息的红树的叶采集及分离。所述菌株有以下的特征。
本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株通常不形成明显的集落。
外观的形状的特征：在琼脂培养基培养的本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株可呈橙色～红色（图1）。
细胞的形状的特征：形状是球形，大小是5～15μm左右（图2）。
基本上营养细胞是球形，可不动。在培养的初期对数增殖期中，依稀可见具有鞭毛的游送子，在静止期完全观察不到此游送子，变成球形的仅营养细胞。
本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株属于网粘菌（Labyrinthula）类、破囊壶菌（Thraustochytrid）科、橙壶菌（Aurantiochytrium）属，是从属营养性，在细胞内蓄积大量的角鲨烯的菌株。网粘菌（Labyrinthula）类属于卵菌类，在系统上其他菌类不同，是与褐藻类或硅藻类等的不等鞭毛植物近亲的系统，与不等鞭毛植物一同构成不等鞭毛类系统。至今已知的本科的菌株有具有大量地蓄积二十二碳六烯酸（DHA）或二十碳五烯酸（EPA）等的高度不饱和脂肪酸的性质的菌株（SR21株、专利第2764572号）。另外也存在有产生角鲨烯的能力的菌株，但其产生能力最大也已知不过约0.3～0.6mg/g（干燥细胞）（G.Chen.et al.New Biotechnology27,382-289（2010）；Q.Li et al.，J.Agric.Food Chem.57（10），4267-4272（2009）；及K.W.Fan et al.,WorldJ.Microbiol.Biotechnol.26,1303-1309（2010））。
再有，本发明的筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株在2010年12月9日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6（邮政编码305-8566））进行国内保藏，得到保藏号FERM P-22047。其后在同研究所基于布达佩斯条约转为国际保藏，在2011年12月8日进行国际保藏，被赋予保藏号FERMBP-11442。
另外，本发明的角鲨烯的制造方法中使用的微生物不限于上述筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株，只要是有与上述的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株实质上相同的菌学性质的菌株，任何的菌株均可使用。将这样的微生物进行培养，在其培养细胞中高浓度蓄积含有角鲨烯的脂质之后，采集该含有角鲨烯的脂质等，用已知的方法提取角鲨烯而可制造角鲨烯。
【2.培养条件】
本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株的增殖是通过将所述菌株接种到用天然水或人工海水制备的适当的培养基中，根据定法培养来进行。作为培养基，可使用任意的公知的培养基，例如，作为碳源，除了葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等的碳水化物之外，有油酸、大豆油等的油脂类或，甘油、醋酸钠等。将这些的碳源以，例如，每1L培养基20～120g的浓度使用。作为氮源，有酵母提取物、玉米浸渍液、聚胨、谷氨酸钠、尿素等的有机氮、或者醋酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸铵等的无机氮、或者蛋白质消化物等。作为无机盐，可将磷酸钾等适宜组合使用。另外，上述培养基也可含适宜维生素类，或蛋白酶胨、酵母提取物等。培养液中，天然水或人工海水的比例是约50质量%。上述的培养基可在制备后，通过加适当的酸或碱基来适宜调节pH。培养基的pH是pH2.0～11.0、优选为pH3.0～10.0、更优选为pH4.0～9.0、更优选为pH4.5～9.0，通常是使用pH6.5。向所述培养基添加含有橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株的溶液前，将所述培养基用灭菌锅杀菌。培养在培养温度5～40℃、优选为10～35℃、更优选为10～30℃，通常进行1～10天、优选为3～7天培养。培养可用通气搅拌培养、振荡培养或静置培养进行，优选为用通气搅拌培养或振荡培养进行培养。
【3.角鲨烯的提取及分析】
本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株产生的含有角鲨烯的脂质可用本领域技术人员已知的方法提取及分析。例如，如上所述培养增殖，将从得到的培养液由离心分离或过滤等回收的湿藻体由冷冻干燥或由加温的干燥等进行干燥。或者，将培养后的培养基直接用于含有角鲨烯的脂质的提取步骤也可。
可从得到的细胞干燥物、或者含有培养后的细胞的培养基，使用有机溶剂提取脂质。提取使用不同的有机溶剂进行2次以上也可。作为有机溶剂，可使用氯仿－甲醇混合溶剂（例如，1:1、1：（2）、或者乙醇－二乙基醚混合溶剂等的极性溶剂和弱极性溶剂的混合液。上述提取后，例如从在氮气流下浓缩干燥的样品，使用n-己烷进行提取。将得到的提取液用本领域技术人员已知的方法纯化。例如，可通过使用氧化硅胶或酸性白土吸附极性脂质来纯化。另外，将纯化的角鲨烯由NMR，IR、气相层析、GC/MS等分析。
由上述的顺序得到的本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株以每培养基1L干燥细胞质量，至少1g以上、优选为至少3g以上、优选为5g～7g的生物质量产生。另外，至达所述生物质量需要的期间是1～10天、优选为2～8天、更优选为3～7天。
本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株产生的全脂质含量是每干燥细胞质量1g，至少5质量%、优选为至少25质量%、更优选为至少30质量%。其中，作为脂质，包括角鲨烯及甾醇类、及/或含色素等的染料的三甘油酯；或者混合脂质。另外，本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株产生的全脂质中，角鲨烯是，至少10质量%以上、至少30质量%以上、至少50质量%以上、优选为，10～100质量%、30～95质量%、更优选为50～90质量%、最优选是60质量%～85质量%。
从而，作为每1L的角鲨烯的产生量成为1.0～2.0g。
在使用本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株时，在产生的脂质中，以高浓度含有角鲨烯。这已知相比已报道的产生角鲨烯的橙壶菌（Aurantiochytrium）属产生角鲨烯的能力是500倍以上。
另外，本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株的特征在于增殖速度非常地快。观察到1天分裂3～12次，这是相比眼虫或小球藻更极快的增殖速度，再者相比产生烃的葡萄藻时，有10～30倍以上的增殖速度。
如上所述，本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株无需在特别的条件的变异诱导或培养，并且可以高收量并且短期间提供角鲨烯，是适宜于大量生产的菌株。
接下来，将本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的新菌株的分离及产生的角鲨烯的分析作为实施例示出，本申请发明的权利要求不限于这些的实施例。
【实施例】
【1.培养及分离】
向GPY培养基（每培养基1L葡萄糖20g、聚胨10g、及酵母提取物5g）添加海水（每培养基1L500ml）、及蒸馏水，将含本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株的溶液合计1L（pH6.5）。将其于120℃高压灭菌20分钟之后，于25℃、在通气条件下振荡培养4天。
【2.产生的脂质的分析】
向得到的含本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株的培养液加氯仿－甲醇（2：1,V/V）而提取脂质，浓缩干燥后，再提取n-己烷。
将此样品用柱层析纯化。条件是，柱内径：
Figure BDA00003314981600072
氧化硅胶：20ml（柱填充量）、溶剂：（1）n-己烷、（2）n-己烷/氯仿（9/1）、（3）n-己烷/氯仿（1/1）、（4）氯仿、（5）氯仿/甲醇（1/1）、（6）氯仿/甲醇（1/4）。将得到的溶出液使用氧化硅胶G板，由溶剂n-己烷/氯仿（9/1）确认，对应于上述溶出的（1）的n-己烷溶出液中含单一的物质（图2）。将所述物质供于TOF/MS解析。
由TOF/MS解析确认，上述的单一的物质是分子式C30H50（不饱和度6）的烃（（M+H）观察到的精确质量：411.3987、式（M+H）：C30H51,calcd for C30H51，411.3985，0.2mmu）。另外，由NMR确认是有以下的结构的角鲨烯。
【化1】
Figure BDA00003314981600071
将此菌株作为筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株在保藏机关：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6（邮政编码305-8566））保藏（保藏号：FERM P-22047）。其后在同一研究所基于布达佩斯条约转为国际保藏，在2011年12月8日进行国际保藏，被赋予保藏号FERMBP-11442。
从筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株得到的脂质的组成示于表1。作为另外比较例，也示用属于本发明的橙壶菌（Aurantiochytrium）属，与筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株同样地形成呈橙～红色的集落的其他菌株（A、B）、不属于本发明的，形成呈白色、乳白色或黄色的集落的橙壶菌（Aurantiochytrium）属的其他菌株（C、D及E）及裂殖壶菌（Schizochytrium）属SR21株的分析结果。
【表1】
Figure BDA00003314981600081
※三甘油酯含甾醇酯及色素。
【保藏号】
筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）3FERM BP-11442

Claims (3)

1.菌株，其特征在于，是属于橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株，所述菌株产生的全脂质中，角鲨烯是10质量%以上，并且形成呈橙色～红色的集落。
2.权利要求1所述的菌株，其中上述菌株是筑波橙壶菌（Aurantiochytrium tsukuba）-3株（保藏号：FERMN BP-11442）。
3.角鲨烯的制造方法，其使用权利要求1或2之任一项所述的属于橙壶菌（Aurantiochytrium）属的菌株。
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