CN104293874A

CN104293874A - 一种制备游离虾青素的方法

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Publication number: CN104293874A
Application number: CN201410490556.3A
Authority: CN
Inventors: 薛长湖; 周庆新; 毛相朝; 王静凤; 薛勇; 王玉明; 杨鲁
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN104293874B

Abstract

本发明公开了一种制备游离虾青素的方法。是通过根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌协同作用来发酵雨生红球藻，充分利用发酵过程中产生的复合酶系，使雨生红球藻中的虾青素酯定向转化生成游离虾青素，在发酵过程中无需添加任何酸碱，该工艺克服了传统皂化法制备虾青素过程易产生副产物虾红素和酶解法制备虾青素转化率低的弊端，为天然游离虾青素的绿色规模化生产提供一条途径。

Description

一种制备游离虾青素的方法

技术领域

本发明属于虾青素制备技术领域，具体涉及一种制备游离虾青素的方法，即一种以雨生红球藻为原料，经多菌种发酵制备游离虾青素的方法。

背景技术

虾青素(英文Astaxanthin，简称ASTA)，是从虾蟹外壳、牡蛎、鲑鱼及藻类、真菌中发现的一种红色类脂溶性胡萝卜素，也是类胡萝素合成的最高级别产物，是迄今为止人类发现的自然界最强的抗氧化剂。近年研究表明，虾青素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和增强免疫力等许多重要的生理和生物学功能，因此虾青素及其制品备受消费者的喜爱和重视，尤其是用高科技手段加工生产的产品的需求呈快速上升的势头。

据文献报道，雨生红球藻是天然虾青素的良好来源，在自然状态下，虾青素主要以虾青素酯的形式存在于雨生红球藻中，其中虾青素的存在形态主要有三种(图1)，分别为游离虾青素(约占5％)，虾青素单酯(约占70％)，虾青素双酯(25％)。目前，主要通过化学皂化法和生物酶解法从雨生红球藻中制备游离虾青素，其中工业应用主要以化学皂化法为主，而生物酶解法主要用于研究和分析定量检测。化学皂化法是利用皂化反应原理，在强碱环境下使虾青素酯水解转化为游离的虾青素，该方法能完全转化虾青素酯，但是存在一个难以克服的弊端，在皂化反应过程中，水解生成的虾青素在碱性条件下极易被氧化生成副产物虾红素和/或半虾红素(图2)，对生产极为不利，发明人曾尝试通过除氧、避光、控制皂化温度和碱液浓度来降低虾红素和或半虾红素的产生，但效果不甚理想。生物酶解法主要是利用脂肪酶对虾青素酯进行酶解，使其酶解生成游离的虾青素和脂肪酸，例如，申请号为201010239982.1的中国发明专利公开了一种制备虾青素单体的方法，其是将虾青素酯用脂肪酶水解得到游离虾青素单体，采用该方法虾青素单体回收率达63.2％，具有一定的适用性。但由于虾青素酯的水不溶特性，酶解转化率低，产物不易分离，生物酶的专一性强，价格昂贵等问题，使得其在大规模的工业化生产应用中受到一定限制。因此，有必要探索一条定向转化率高、副产物少、经济、便于规模化生产的天然游离虾青素制备工艺，对推动虾青素产业的发展，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以雨生红球藻为原料，通过多菌种协同混合发酵、浸提、浓缩等工艺，制备游离虾青素的方法，可解决传统虾青素制备工艺中副产物虾红素/半虾红素的产生，以及单纯酶法制备虾青素转化率低等难题，弥补现有技术的不足，为高纯度虾青素的生产和应用奠定基础。

本发明的方法，包括有如下的步骤：

1)向雨生红球藻粉加入2～50倍雨生红球藻质量的水，搅拌均匀；

2)向步骤1)搅拌均匀的雨生红球藻液中加入葡萄糖搅拌均匀后灭菌制成发酵基料；

3)将活化好的混合菌液中接种到灭菌的发酵基料中，然后在30℃～45℃下发酵6～96h，发酵过程中进行连续或间断搅拌；

4)发酵结束后，调节发酵液至pH1.0～3.0，静止0.1～12h，离心或过滤，收集沉淀物；

5)向步骤4)得到的沉淀物中加入乙醇溶液进行浸提，浸提次数1～3次，每次提取时间0.5～12h；浸提结束后，通过离心或过滤除去残渣，收集浸提液；

6)将浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物。

其中步骤2)中葡萄糖添加的浓度质量分数为0.1％～20％，

其中步骤5)中的乙醇添加的质量体积比为1:2～20。

其中步骤(3)所述的混合菌液为根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌中的任两种或三种的混合菌悬液；优选为根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的混合菌液。

本发明一种多菌种混合发酵雨生红球藻制备游离虾青素的方法，游离虾青素的提取率≥70％，同时避免了化学法中副产物虾红素和/或半虾红素的产生；本发明方法制备的最终产品中虾青素含量≥10％，其中游离态虾青素含量占总虾青素(游离虾青素+虾青素单酯+虾青素双酯)80％，提高了虾青素酯的转化率。本发明制备得到的虾青素可用于水产、畜禽等饲料添加剂；可以作为食品着色剂用于粮食、肉制品、水产品等行业加工的着色；可以用于医药品和化妆品等行业的加工着色；可作为功能性成分用于保健食品的开发。

附图说明

图1：虾青素、虾青素单酯及虾青素双酯的结构图；

图2：虾青素皂化反应过程中产物变化图；

图3：本发明方法的工艺流程图；

图4：本发明原料雨生红球藻中虾青素形态分析图；

图5：化学皂化法制备虾青素产品HPLC分析图；

图6：本发明方法制备的虾青素产品HPLC分析图。

具体实施方式

本发明以雨生红球藻作为主要的发酵基质，通过接种根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌的混合菌液，利用其发酵过程中产生的复杂酶系，一方面破坏雨生红球藻的细胞壁，使其中的虾青素充分的暴露，另一方面，对虾青素酯分子中的脂肪酸链进行酶切，产生游离的虾青素。在相对温和的环境中高效转化虾青素酯制备游离虾青素，然后再通过分离、浸提、浓缩制备低副产物的虾青素浸膏，其流程如图3所示。

检测方法：

采用HPLC-DAD方法对发酵过程产物进行分析，确定游离虾青素的转化率以及虾青素的形态分布。结合虾青素与虾青素酯具有相似的光谱特性，根据HPLC-DAD色谱图，对游离虾青素和虾青素酯相应保留时间的色谱峰进行面积归一化和定量分析，确定游离虾青素在总虾青素类物质中的百分含量，以及虾青素的转化率。

HPLC分析色谱条件：美国Agilent1100系列高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；色谱柱为Develosil C30-UG(4.6mm×250mm,5μm)；流动相A：甲醇；流动相B：甲基叔丁基醚；线性梯度洗脱：0-15min：B为0％；15-22min：B由0％升至22％；22-48min：B维持在22％；48-56min：B由22％升至40％；56-76min：B为40％。流速为1.0ml/min；检测波长：476nm；柱温：35℃；DAD全波长扫描范围：200～800nm；进样量为20μL。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的说明。

实施例1：

(1)原料：雨生红球藻干粉1Kg(荆州市天然虾青素厂，虾青素含量2.0％)加入30kg的水搅拌均匀。使用的雨生红球藻粉中含有碳水化合物38％，脂肪24％，蛋白质24％，灰分2％，矿物质1％，生物素1％，色素类(包括：叶绿素，类胡萝卜素等)10％。

通过HPLC-DAD法对雨生红球藻原料中的虾青素进行分析，得到的结果如图4所示，从图4中可以看出，雨生红球藻中虾青素的存在形态主要以虾青素酯为主，其中虾青素酯中又以虾青素单酯居多，通过积分峰面积计算得到，雨生红球藻中游离虾青素、虾青素单酯、虾青素双酯的相对百分含量分别为：4.2％、75.6％、20.2％。

(2)配料：向步骤(1)搅拌均匀的混合体系中加入质量分数为5％的葡萄糖，搅拌均匀后灭菌，得到发酵基料。

(3)发酵：将活化好的根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的菌悬液按照体积比为1：2：1的比例混合(即根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的类似菌的数量比)，制成混合菌悬液，然后将菌悬液以10％的接种量接种到灭菌的发酵基料中，然后在35℃下发酵48h，过程中进行连续或间断搅拌。

根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，通过将菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(配方：马铃薯粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L；琼脂20.0g/L；pH值5.6±0.2，25℃；使用前于115℃高压灭菌20分钟)斜面上，30℃条件下培养5d，完成对菌种的活化，，然后将活化好的菌种从斜面转接到液体培养基(配方：马铃薯粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L；pH值5.6±0.2，25℃；使用前于115℃高压灭菌20分钟)，在30℃条件下培养26h，制得活化好的菌悬液，下同。

(4)分离：发酵结束后，调节发酵液至pH3.0，静止1h，过滤，收集沉淀物。

(5)浸提：向步骤(4)得到的沉淀物中加入质量体积比为1:3的乙醇溶液进行浸提，浸提次数3次，每次提取时间0.5h；浸提结束后，通过过滤除去残渣，收集浸提液。

(6)浓缩：浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物，称得质量为0.08kg，测得其中游离虾青素的含量约为20％，酯转化率约为81％。

利用HPLC-DAD法对该实施例1得到的产品分析，结果如附图6所示。由图6可知，经过本发明的一种多菌种混合发酵雨生红球藻制备的产品中，主要以游离态的虾青素为主，其中游离的虾青素占总虾青素类化合物的相对含量为84％，并且避免了副产物虾红素和半虾红素的大量产生。

另外，对本实施例制备的产品与利用化学皂化法制备的产品进行分析比较，结果如图5，图6所示。经质谱鉴定，图5中峰1、峰2、峰4为虾青素同分异构体，峰3为半虾红素，峰5为虾红素。因此，图5结果表明，通过化学皂化法制备游离虾青素过程中，虾青素酯几乎被完全转化，但是伴随皂化过程，产品中出现大量的副产物虾红素和半虾红素；而本发明的一种多菌种混合发酵雨生红球藻制备的产品中并无大量虾红素或半虾红素产生。

因此，本发明的一种多菌种混合发酵雨生红球藻制备游离虾青素的工艺方法具有较好的适用性。

实施例2

(1)原料：雨生红球藻1Kg(荆州市天然虾青素厂，虾青素含量2.0％)，加入10倍雨生红球藻质量(W/V)的水，搅拌均匀。

(2)配料：向步骤(1)搅拌均匀的混合体系中加入质量分数为10％的葡萄糖，搅拌均匀后灭菌，得到发酵基料。

(3)发酵：将活化好的黑曲霉菌和假丝酵母菌两种菌的菌悬液按照体积比为2:1的比例混合，制成混合菌液，然后将菌悬液以12％的接种量，接种到灭菌的发酵基料中，然后在40℃下发酵12h，过程中进行连续或间断搅拌。

(4)分离：发酵结束后，调节发酵液至pH2.0，静止0.5h，8000r/min离心，收集沉淀物。

(5)浸提：向步骤(4)得到的沉淀物中加入质量体积比为1:5的乙醇溶液进行浸提，浸提次数2次，每次提取时间1h；浸提结束后，通过8000r/min离心，收集上清液，即为浸提液。

(6)浓缩：浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物，称得最终虾青素膏状物质量为0.07Kg，测得游离虾青素的含量约为12％，酯转化率约为66％。

实施例3

(1)原料：雨生红球藻10Kg(荆州市天然虾青素厂，虾青素含量2.0％)，加入20倍雨生红球藻质量(W/V)的水，搅拌均匀。

(2)配料：向步骤(1)搅拌均匀的混合体系中加入质量分数为8％的葡萄糖，搅拌均匀后灭菌，得到发酵基料。

(3)发酵：将活化好的根霉菌和假丝酵母菌两种菌的菌悬液按照体积比1:1的比例混合，制成混合菌悬液，然后将菌悬液以15％的接种量，接种到灭菌的发酵基料中，然后在38℃下发酵20h，过程中进行连续或间断搅拌。

(4)分离：发酵结束后，调节发酵液至pH3.0，静止2h，过滤，收集沉淀物。

(5)浸提：向步骤(4)得到的沉淀物中加入质量体积比为1:8的乙醇溶液进行浸提，浸提次数2次，每次提取时间2h；浸提结束后，过滤，收集浸提液。

(6)浓缩：浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物，称得最终虾青素膏状物质量为1.1Kg，测得游离虾青素的含量约为15％，酯转化率约为68％。

实施例4

(3)发酵：将活化好的根霉菌和黑曲霉菌两种菌的菌悬液按照体积比1:2的比例混合，制成混合菌悬液，然后将菌悬液以10％的接种量，接种到灭菌的发酵基料中，然后在36℃下发酵96h，过程中进行连续或间断搅拌。

(4)分离：发酵结束后，调节发酵液至pH2.0，静止12h，过滤，收集沉淀物。

(5)浸提：向步骤(4)得到的沉淀物中加入质量体积比为1:3的乙醇溶液进行浸提，浸提次数3次，每次提取时间1.5h；浸提结束后，通过8000r/min离心，收集上清液，即为浸提液。

(6)浓缩：浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物，称得最终虾青素膏状物质量为0.1Kg，测得游离虾青素的含量约为13％，酯转化率约为65％。

实施例5

(1)原料：雨生红球藻100Kg(荆州市天然虾青素厂，虾青素含量2.0％)，加入10倍雨生红球藻质量(W/V)的水，搅拌均匀。

(2)配料：向步骤(1)搅拌均匀的混合体系中加入质量分数为15％的葡萄糖，搅拌均匀后灭菌，得到发酵基料。

(3)发酵：将活化好的根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1的比例混合，制成菌悬液，然后将菌悬液以12％的接种量，接种到灭菌的发酵基料中，然后在35℃下发酵48h，过程中进行连续或间断搅拌。

(4)分离：发酵结束后，调节发酵液至pH3.0，静止5h，过滤，收集沉淀物。

(5)浸提：向步骤(4)得到的沉淀物中加入质量体积比为1:8的乙醇溶液进行浸提，浸提次数1次，单次提取时间3h；浸提结束后，过滤，收集浸提液。

(6)浓缩：浸提液经减压浓缩，回收有机溶剂，得到虾青素膏状提取物，称得最终虾青素膏状物质量为8.2Kg，测得游离虾青素的含量约为18％，酯转化率约为79％。

通过对比试验发现，实施例1、实施例5中利用根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的混合菌液进行发酵，其得到的产品中虾青素含量和酯转化率均比实施例2、实施例3、实施例4中利用两种菌混合发酵得到的产品高。具体比较结果如下表所示：

由表可以看出，利用三种菌进行混合发酵比两种菌进行发酵具有优势。产品中虾青素含量提高20％以上，酯转化率提高15％以上。

Claims

1.一种制备游离虾青素的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：

2.如权利要求1所述的方法，特征在于所述的步骤2)中葡萄糖添加的浓度质量分数为0.1％～20％。

3.如权利要求1所述的方法，特征在于所述的步骤5)中的乙醇添加的质量体积比为1:2～20。

4.如权利要求1所述的方法，特征在于所述的步骤3)所述的混合菌液为根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌中的任两种或三种。

5.如权利要求1所述的方法，特征在于所述的步骤3)所述的混合菌液为为根霉菌、黑曲霉菌和假丝酵母菌三种菌的混合菌液。