CN102911138B - 一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法，包括有初提样品制备、甲醇溶解、柱层析分离和HPLC纯化步骤。本发明提供了一种安全低毒、经济环保的岩藻黄素制备方案。本发明首次采用硅藻土做柱填料分离岩藻黄素。硅藻土具有价格经济、绿色环保的特点。同时使用食用石油醚分离，降低了最终产品中有毒物质的残留。经硅藻土分离后，即可得低成本、安全健康的岩藻黄素保健品原料。再经高效液相色谱分离纯化后，便可得到色谱纯岩藻黄素。本发明为满足国内外高纯度岩藻黄素市场提供了安全低毒的分离技术，大大提高了褐藻类水产品的附加值，具有重要的经济价值。

Description

一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法

技术领域

本发明属于海洋生物天然产物技术领域，具体涉及一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法。

背景技术

自1982年《联合国海洋法公约》签订以来，世界各海洋国家纷纷将开发利用海洋资源作为国家战略决策，大力推动相关科学研究和技术产业的发展。海洋天然产物作为重要的研究分支，提供了大量具有药用价值的活性物质。

岩藻黄素作为海洋天然活性物质中的一种，在海洋环境中分布尤为广泛，其含量占到了类胡萝卜素自然总含量的10%左右。但与β-胡萝卜素等类胡萝卜素不同的是，岩藻黄素是首个从褐藻中分离出的有特殊的丙二烯碳骨架的分子，因而它具有极强的抗氧化能力。同时，岩藻黄素分子含有羟基、酯键和多个不饱和α,β-不饱和键，可以作为接受体与很多重要蛋白发生麦克加成反应，从而改善生物体的代谢循环，发挥其生物活性功能。

通过现阶段细胞培养和动物实验表明，岩藻黄素具有促进健康的作用。特别是在抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗疟疾、抑制肥胖和糖尿病，以及肝脏、脑、骨骼、皮肤、眼睛和心血管系统的保护作用方面具有极大的潜在药用价值。与目前的同类成品药物β-胡萝卜素和虾青素相比，岩藻黄素在抑制肥胖、成熟T细胞增值和海勒癌细胞发育方面有着更加突出的表现。尽管人体直接食用藻类过程中岩藻黄素的生物利用率较低，但通过食用纯化岩藻黄素和食用油脂混合可以大大提高岩藻黄素的吸收率，以及岩藻黄醇和Amarouciaxanthin A等岩藻黄素代谢中间产物在体内的浓度。同时生物毒理实验表明，服用岩藻黄素具有毒副作用小、不影响脂代谢循环等特点，因而岩藻黄素是一种具有极大潜在药用价值和经济价值的海洋活性天然产物。

目前国外很多企业和科研单位都已经将岩藻黄素应用于新药的开发研制。日本也已经推出了以岩藻黄素为添加物的护肤品，并获得了较高的市场占有率。但就目前来说，岩藻黄素市场主要存在两个问题。一是国内外高纯度岩藻黄素市场仍然空缺。而且在我国，高纯度岩藻黄素主要还是依赖国外进口。二是分离成本过高，分离工程中环境污染严重。因此急需一种操作简单经济环保的分离纯化技术，以满足国内市场对岩藻黄素的需求。

迄今为止，关于岩藻黄素的提取的专利有中国公开号为CN1706836（一种从海藻中分离岩藻黄素的方法）、CN101565411（一种从褐藻中分离岩藻黄素的方法）等。CN1706836涉及用二甲基亚砜在黑暗中浸提新鲜海藻，CN101565411是将新鲜的褐藻打浆,加入有机试剂,再加入质量千分数为0.5-1的抗氧化剂,浸提22-26小时后抽滤,得到浸提液。二甲基亚砜沸点高且较贵，后续处理成本很高；且CN101565411专利中所采用的方法，操作时间长，产品得率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法，即提供一种分离制备岩藻黄素的方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的岩藻黄素，其分子式为：

本发明的提取方法，包括如下的步骤：

1）在褐藻粉内添加丙酮和甲醇混合溶剂进行超声浸提，浸提液浓缩蒸干获得初提样品；

2）将1）中获得的初提样品加入甲醇进行溶解，溶解液样品进行紫外/可见光谱分析，选取450nm处吸收峰的样品作为褐藻浸提液进行后续的分离纯化；

3）对2）中制备的褐藻浸提液进行柱层析分离，柱填料为硅藻土，用食用石油醚和丙酮的混合溶剂做洗脱剂；获得洗脱液并浓缩；

4）使用HPLC对步骤3）中获得的洗脱液再进行分离，选用正向ODS柱，石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合试剂作为流动相，色谱分离获得高纯化岩藻黄素。

其中步骤1）中丙酮和甲醇混合溶剂中丙酮和甲醇的体积比为3:1。

其中步骤3）中食用石油醚和丙酮体的积比为1：0.43～2.33。

其中步骤4）石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合试剂中石油醚、二氯甲烷和丙酮的体积比为：10:5:3。

本发明的岩藻黄素是一种具有潜在药用价值的海洋天然产物。可以用于新型抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗疟疾、抑制肥胖和糖尿病药物的研发，同时也可开发为保肝、减肥和保护视力的保健品，以及美白保湿的护肤品等。

本发明提供了一种安全低毒、经济环保的岩藻黄素制备方案。本发明首次采用硅藻土做柱填料分离岩藻黄素。硅藻土具有价格经济、绿色环保的特点。同时使用食用石油醚分离，降低了最终产品中有毒物质的残留。经硅藻土分离后，即可得低成本、安全健康的岩藻黄素保健品原料。再经高效液相色谱分离纯化后，便可得到色谱纯岩藻黄素。本发明为满足国内外高纯度岩藻黄素市场提供了安全低毒的分离技术，大大提高了褐藻类水产品的附加值，具有重要的经济价值。

附图说明

图1：本发明从褐藻中的制备岩藻黄素过程示意图。

图2:本发明海带粗提样品0316-2紫外/可见吸收光谱。

图3：本发明从海带中提取岩藻黄素高效液相色谱图。

图4：本发明从巨藻中提取岩藻黄素高效液相色谱图。

图5：本发明从马尾藻中提取岩藻黄素高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明对褐藻岩藻黄素的制备纯化步骤中试剂的进行了长期的筛选，并对提取液、柱层析液和HPLC的洗脱液进行了优化，从而完成了本发明。

实施例1：从海带中提取纯化岩藻黄素

一、海带粗提液制备和筛选

将10kg海带洗净晾干，置于烘箱中，45℃下烘干，得海带干重346.49g。将干海带压碎研磨成粉末，使用丙酮：甲醇=3:1混合液45℃下超声浸提4h。浸提3次，浸提液过滤，清液45℃下真空旋转蒸干，得海带粗提浸膏。

在海带粗提浸膏中依次分别加入食用石油醚、丙酮和甲醇进行溶解，得到样品0316-1～3。

使用紫外分光光度计对0316-1～3样品进行300～500nm波长扫描，分别用相应纯溶剂做空白参照。结果表明，样品0316-3，即甲醇浸提液在450nm处吸收峰值最大，类胡萝卜素及其衍生物含量最高；0316-3紫外吸收光谱见图2。

二、分离纯化岩藻黄素

首先使用干法装柱，柱填料为硅藻土。样品0316-3加入少量硅藻土拌干上样；以体积比为1：0.55的食用石油醚和丙酮做洗脱剂梯度洗脱，最后用1L丙酮洗脱。收集不同色带洗脱物，浓缩并编号为1#～9#。

使用HPLC系统对以上获得的1#～9#进行分离。选用正向ODS柱，溶剂体系为石油醚、二氯甲烷和丙酮（10:5:3）混合体系，流速为0.5mL/min，于样品中分离纯化获得岩藻黄素。具体液相色谱见图3，根据HPLC系统自生成报告可知，所分离的化合物纯度可以达到94.77%。

实施例2：从巨藻中提取纯化岩藻黄素

一、巨藻粗提液的制备

将10kg巨藻洗净晾干，置于烘箱中，45℃下烘干。将干巨藻压碎研磨成粉末，使用丙酮：甲醇=3:1混合液45℃下超声浸提4h。浸提3次，浸提液过滤，清液45℃下真空旋转蒸干，得到巨藻粗提干样。加入20ml甲醇溶解干样，作为柱层析样品。

二、分离纯化岩藻黄素

首先使用干法装柱，柱填料为硅藻土。上述步骤中所获样品加入少量硅藻土拌干上样。以体积比为1：0.75的食用石油醚和丙酮做洗脱剂梯度洗脱，最后用1L丙酮洗脱。收集不同色带洗脱物并浓缩。

使用HPLC系统对上一步骤获得的样品进行分离。选用正向ODS柱，溶剂体系为石油醚、二氯甲烷和丙酮（10:5:3）混合体系，流速为1mL/min，于样品中分离纯化获得岩藻黄素。具体液相色谱见图4，根据HPLC系统自生成报告可知，所分离的化合物纯度可以达到90.07%。

实施例3：从马尾藻中提取纯化岩藻黄素

一、马尾藻粗提液的制备

将10kg马尾藻洗净晾干，置于烘箱中，45℃下烘干。将干马尾藻压碎研磨成粉末，使用丙酮：甲醇=3:1混合液45℃下超声浸提4h。浸提3次，浸提液过滤，清液45℃下真空旋转蒸干，得到马尾藻粗提干样。加入20ml甲醇溶解干样，作为柱层析样品。

二、分离纯化岩藻黄素

首先使用干法装柱，柱填料为硅藻土。上述步骤中所获样品加入少量硅藻土拌干上样。以体积比为1：0.52的食用石油醚和丙酮做洗脱剂梯度洗脱，最后用1L丙酮洗脱。收集不同色带洗脱物并浓缩。

使用HPLC系统对上一步骤获得的样品进行分离。选用正向ODS柱，溶剂体系为石油醚、二氯甲烷和丙酮（10:5:3）混合体系，流速为1mL/min，于样品中分离纯化获得岩藻黄素。具体液相色谱见图5，根据HPLC系统自生成报告可知，所分离的化合物纯度可以达到75.72%。

本发明得到海洋天然产物具有活性高、毒副作用小的特点，可以用于抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗疟疾、抑制肥胖和糖尿病药物的研发。也可用于开发保肝、保护视力、减肥的保健品和美白保湿护肤品。

本发明采用的制备方案具有低毒安全、环保经济的特点。使用硅藻土分离后，获得的产品即可应用于保健食品的开发以及护肤品的添加。在获得目标产物的同时，提高了产品的食用安全性，降低了对环境的污染和生产成本。经高效液相色谱分离后，即可获得色谱纯岩藻黄素。满足了国内外对高纯度岩藻黄素的需求，因而具有极大的经济价值和广泛的应用前景。

Claims (1)

1.一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法，其特征在于，包括有如下步骤：

1)在褐藻粉内添加丙酮和甲醇混合溶剂进行超声浸提，浸提液浓缩蒸干获得初提样品；其中丙酮和甲醇混合溶剂中丙酮和甲醇的体积比为3:1；

2)将1)中获得的初提样品加入甲醇进行溶解，溶解液样品进行紫外/可见光谱分析，选取450nm处吸收峰的样品作为褐藻浸提液进行后续的分离纯化；

3)对2)中制备的褐藻浸提液进行柱层析分离，柱填料为硅藻土，用食用石油醚和丙酮的混合溶剂做洗脱剂；获得洗脱液并浓缩；其中食用石油醚和丙酮体的积比为1:0.55；

4)使用高效液相色谱对步骤3)中获得的洗脱液再进行分离，选用正向ODS柱，以石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合试剂做为流动相，色谱分离获得纯化的岩藻黄素；其中石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合试剂中石油醚、二氯甲烷和丙酮的体积比为10:5:3；所述的褐藻为海带。