TWI480065B - A method for purifying the fuciform yellow matter of the granulomatous algae into micron particles - Google Patents

Description

純化棲狀褐茸藻之岩藻黃質成為微米顆粒之方法

本發明是關於從棲狀褐茸藻萃取及純化岩藻黃質之技術。

岩藻黃質(Fucoxanthin)亦稱褐藻黃素，是自可食用褐藻中如裙帶菜、海帶中提取出來的天然類葫蘿蔔素中的一種，因其長分子鏈的兩端分別有一個化學活性極為活潑的5,6-環氧非飽和丙二烯鍵，所以它比其他的天然類葫蘿蔔分子具有更強的生物活性。近年來，它的多種生物學活性已被證實。

通過細胞培養以及動物實驗證實，岩藻黃質具有促進健康的作用，特別是在抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抑制肥胖和血糖控制，對於皮膚、眼睛和心血管系統也具有保護作用。與其同類的蝦青素和β-葫蘿蔔素相比，岩藻黃質在抑制肥胖、成熟T細胞增值、抑制癌細胞發育等方面有更顯著的表現。但人體直接食用藻類可獲取的岩藻黃質較低，但通過食用純化岩藻黃質和食用油脂混合，可以大大提高岩藻黃質的吸收率。同時，生物毒性實驗證明，服用岩藻黃質的毒副作用小，且不影響脂類代謝循環，因此岩藻黃質是一種具有極大潛在食用或藥用價值及經濟價值的海洋活性天然產物。

目前已有一些關於岩藻黃質提取方法的文獻報導，例如：中國專利CN1706836一種從海藻中分離岩藻黃素的方法，描述關 於岩藻黃素的提取分離的方法，將新鮮海藻或冰凍海藻於室溫下解凍後，用蒸餾水清洗去除表面鹽離子，然後除去其表面水分，再將海藻用二甲基亞碸在黑暗中浸提，浸提時間為15~60分鐘，二甲基亞碸的用量為2~6ml/每克海藻，最後用乙酸乙酯和硫酸氨混合溶液將二甲基亞碸浸提液中的色素萃取到乙酸乙酯中。

中國專利CN101565411描述一種由褐藻中提取岩藻黃素的方法，其特徵是將新鮮的褐藻打漿，加入有機試劑，再加入品質千分數為0.5-1的抗氧化劑，浸提22-26小時後抽濾，得到浸提液，反復浸提直至有機層無色，合併各次有機層液體於棕褐色瓶中；旋轉蒸發除去有機溶劑，向旋轉蒸發器皿中所得貼壁物中加體積比1：1-2的乙酸乙酯和水，溶解後振盪分層，收集有機層，反復3-6次，合併各有機層液體後旋轉蒸發濃縮，得該褐藻的總色素；利用矽膠柱層析分離純化，以體積比為1：0.43-9的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，最後用乙酸乙酯沖注，洗脫出的黃色液體即為岩藻黃素。

中國專利CN101914075A描述一種從褐藻中提取褐藻黃素的方法，提取時將粉碎的褐藻先經過水溶漲預處理，再用水溶性有機溶劑浸提，之後以兩次柱層析法對浸提液中的褐藻黃素進行純化，最後經製備薄層層析法或製備高效液相色譜法進一步純化得到純度90%以上或99%以上的褐藻黃素標準品。

中國專利CN102911138描述一種褐藻中岩藻黃素的提取純化方法，在褐藻粉內添加甲醇和丙酮混合溶劑進行超音波萃提，獲得超音波初提樣品；之後將超音波初提樣品加入甲醇溶解獲褐藻浸提液；將褐藻浸提 液進行管柱層析分離，柱填料為矽藻土，以食用石油醚和丙酮之混合溶劑做洗脫劑，取得洗脫液，使用高效液相色譜儀對洗脫液進行再分離，使用正向ODS柱，以石油醚、二氯甲烷和丙酮混合試劑做為流動相，經分離後獲得岩藻黃素，純度為75.72。

中國專利CN103012327A描述岩藻黃質的製備方法，將清洗後的褐藻原料晾乾，用有機溶劑浸漬，提取；獲得的提取液濃縮，得岩藻黃質粗提物；將岩藻黃質粗提物採用柱層析分離，收集岩藻黃質餾分，濃縮，得岩藻黃質原料；將獲得的岩藻黃質原料用有機溶劑溶解，轉入半製備/製備型高效液相色譜的進樣瓶中，啟動半製備/製備型高效液相色譜分離純化，通過紫外線上檢測或質譜信號觸發餾分收集器自動收集岩藻黃質純化液；將收集的岩藻黃質純化液減壓濃縮，冷凍乾燥，得高純岩藻黃質。經測試，所制得的岩藻黃質的純度大於99%。

本發明之目的是在提出一種純化棲狀褐茸藻之岩藻黃質成為微米顆粒之方法。

本發明結合超音波溶劑萃取法、正相管柱層析法和超臨界抗溶沉澱法，進行純化棲狀褐茸藻粉之岩藻黃質並製備成微米級顆粒。

該超音波溶劑萃取法，採用乙酸乙酯為溶劑，溶固比60：1(V/g)，將棲狀褐茸藻粉與乙酸乙酯混合，溫度298K，超音波萃取10分鐘，萃出液以濾紙過濾，過濾後的濾液經乾燥，其乾燥物再以乙酸乙酯回溶，進行二次減壓濃縮，獲得超音波初萃物，該超音波初萃物每克含5.4毫克的岩藻黃質。

該正相管柱層析法用以提純該超音波初萃物中的岩藻黃質，管柱層析純化採用正相矽膠填充3公分內徑管柱，矽膠高度25公分，動相為正己烷-丙酮(7：3)混合溶液，沖提流速每分鐘12ml；管柱層析中有4個劃分層，收集內含岩藻黃質顏色為黃紅色至深紅色的分劃層做為第一次管柱層析提純物；將該第一次管柱層析提純物以蒸發濃縮原理之裝置進行濃縮，將該濃縮物再經第二次管柱層析純化，第二次管柱層析純化之條件與第一次管柱層析純化相同；第二次管柱層析純化將第一次管柱層析提純物進行再純化，產生關鍵性的濃度提昇作用，據此得第二次管柱層析提純物；將該第二次管柱層析提純物以蒸發濃縮原理之裝置進行濃縮，每克第二次管柱層析濃縮物中含719.8毫克之岩藻黃質。層析之岩藻黃質平均回收率分別為85.4%。

該超臨界抗溶沉澱法用以純化第二次管柱層析濃縮物，將第二次管柱層析濃縮物與乙醚溶劑混合，製成濃度10mg/ml的進料溶液，以壓力90bar、時間10分鐘、進料速率0.3ml/min、溫度313K、二氧化碳流速15L/min之固定條件進行抗溶沈澱，獲得超臨界抗溶沈澱粉粒每克含有886.2毫克的岩藻黃質，回收率可達98.7%。

電子顯微鏡照射圖顯示超臨界抗溶沈澱粉粒的型態為不規則型花瓣狀的微米聚集堆疊。

第一圖，以掃描式電子顯微鏡觀察超臨界抗溶沈澱粉粒，放大1000倍的影像。

第二圖，以掃描式電子顯微鏡觀察超臨界抗溶沈澱粉粒，放大5000倍的影像。

第三圖，以掃描式電子顯微鏡觀察超臨界抗溶沈澱粉粒，放大10000倍的影像。

本發明結合超音波溶劑萃取法、正相管柱層析法和超臨界抗溶沉澱法，進行純化棲狀褐茸藻粉之岩藻黃質並製備成微米級顆粒。

首先，超音波溶劑萃取棲狀褐茸藻粉，將儲存於193K冰箱中177微米粒徑的冷凍棲狀褐茸藻粉取出退冰，以電子天平精確定量的藻粉1g，起初於溫度298K，溶固比為60：1(V/g)，將棲狀褐茸藻粉與乙酸乙酯混合，超音波萃取10分鐘，萃出液以濾紙進行重力過濾，過濾後的濾液以蒸發濃縮原理之裝置(例如：減壓濃縮機抽氣)進行乾燥，獲得之乾燥物再以乙酸乙酯回溶，再進行二次減壓濃縮，獲得乾燥的超音波初萃物。接著秤定量超音波初萃物以乙酸乙酯適量回溶，取0.1毫升加入HPLC動相組成甲醇：乙腈(7：3)7.9毫升，配製成符合檢量線範圍濃度(2mg/L至10mg/L)內的樣品濃度，使用PTFE過濾碟過濾待測溶液，然後以高效能液相層析儀(HPLC)分析樣品溶液中岩藻黃質含量及濃度，每克超音波初萃物中含5.4毫克的岩藻黃質。

接著，將超音波初萃物進行正相管柱層析，正相管柱層析連續執行兩次。第一次管柱層析，將管柱層析儀之玻璃管柱以夾子固定，取500毫升燒杯盛裝矽膠粉末200克，接著倒入配好的動相正己烷-丙酮(7：3)混合溶液200毫升，充分以玻棒攪拌直至燒杯中混濁懸浮液無氣泡時，快速倒入 玻璃管柱底部已關閉之玻璃管柱，接著打開玻璃管柱的底部出口閥門，利用溶液的向下流動，讓矽膠顆粒沉澱變扎實，同時使用軟橡皮塞輕敲玻璃管柱讓矽膠中小氣泡排出，等到矽膠層高度不再變化時，使用50毫升燒杯盛裝無水硫酸鈉2克注入玻璃管柱中的矽膠層上方，填充方式類似矽膠，作為管柱層析的緩衝層，緩衝層中矽膠層高度為25cm。填充程序完成後，關閉底部出口閥門。接著將約55mg的超音波初萃物以動相溶液[正己烷-丙酮(7：3)混合溶液]5ml回溶(溶固比為10：1ml/mg)，以滴管沿玻璃管柱邊緣滴入管柱中，完畢後打開底部出口閥門，讓溶液滲入管柱上層緩衝層中，接著再以滴管吸取乾淨的動相溶液，沿玻璃管柱邊緣滴入20毫升清洗管柱上殘留物，然後打開底部出口閥門，同時啟動微量蠕動幫浦泵入進料溶液，並使動相流速維持每分鐘12ml。接著在層析過程中分別收集沖提出來的溶液。第一次管柱層析中有4個劃分層，分劃層1顏色為淡黃色，狀態似油脂；分劃層2為呈現深色的液體，內含葉綠素成分；分劃層3顏色為黃紅色至深紅色，內含岩藻黃質成分；分劃層4則呈現墨綠色液體，內含葉綠素成分。收集分劃層3溶液，做為第一次管柱層析提純物；將該第一次管柱層析提純物以旋轉濃縮機抽乾濃縮，獲得第一次管柱層析濃縮物。再取定量第一次管柱層析濃縮物配置成適當濃度進行HPLC岩藻黃質濃度與含量分析，岩藻黃質濃度及回收率分別為每克濃縮物146.3毫克及84%。

接著，將第一次管柱層析濃縮物進行第二次管柱層析，將該第一次管柱層析濃縮物與動相溶液正己烷-丙酮混合溶液(7：3)混合，(第一次管柱層析濃縮物55mg，動相溶液5ml，溶固比為10：1ml/mg)，製備第二次管柱層析進料溶液，管柱填充方式比照第一次管柱填充方式，管柱長度 與動相流速則以第一次管柱的條件為條件。以滴管將第二次管柱層析進料溶液沿著玻璃管柱邊緣滴入，完畢後打開底部出口閥門，讓溶液向下流滲入緩衝層中，接著再以滴管吸取乾淨的動相溶液沿玻璃管柱邊緣滴入20ml清洗壁上殘留，然後打開底部出口，同時啟動微量蠕動幫浦泵入進料溶液，使動相流速維持每分鐘12ml。接著實驗進行過程中分別收集沖提出來的溶液，第二次管柱層析有3個分劃層，分劃層1與分劃層3皆為淡黃色液體似油脂，內含第一次管柱層析濃縮物中未分離的其他物質，分劃層2位於中間地帶，為黃紅色溶液，所收集得到的分劃層溶液，再以旋轉濃縮機抽乾濃縮，獲得第二次管柱層析濃縮物。取定量第二次管柱層析濃縮物配置成適當濃度進行HPLC岩藻黃質濃度與含量分析，每克第二次管柱層析濃縮物中含719.8毫克之岩藻黃質。層析之岩藻黃質平均回收率分別為85.4%，證明第二次管柱層析具有關鍵性的濃度提昇作用。

接著，將第二次管柱層析濃縮物進行超臨界抗溶沉澱，將第二次管柱層析濃縮物與乙醚溶劑混合，製成濃度10mg/ml的進料溶液，以壓力90bar、時間10分鐘、進料速率0.3ml/min、溫度313K、二氧化碳流速15L/min之固定條件進行抗溶沈澱，獲得超臨界抗溶沈澱粉粒每克含有886.2毫克的岩藻黃質，回收率可達98.7%，平均岩藻黃質純度88.9%。

以掃描式電子顯微鏡觀察該超臨界抗溶沈澱粉粒，以放大1000倍的圖來看(第一圖)，超臨界抗溶沉澱物為多邊形或圓形球體結構，結構鬆散而分散，中間穿插些許樹枝狀剛硬結構。以放大5000倍的圖來看(第二圖)，超臨界抗溶沉澱物可看出不規則狀球體結構內含有剛硬棒狀結構。以放大10000倍的圖來看(第三圖)，超臨界抗溶沉澱物的型態為不規則型花瓣 狀的微米聚集堆疊，可發現球體是由類似奈米般雪片狀結構經高壓下不斷聚集而形成，球體如蜂巢般的細微結構更加確定此球形是由義大利捲心麵等小結構連結而成。包覆於球體中心的剛硬棒狀結構更加清楚，與球形結構的基本連結單元似乎相同，可更加確定是受到溶劑的再溶解而形成。

綜上所述，本發明結合超音波溶劑萃取法、兩次正相管柱層析法、以及超臨界抗溶沉澱法，進行純化棲狀褐茸藻粉之岩藻黃質並製備成微米級顆粒；最終所獲得的的超臨界抗溶沈澱物中每克含有886.2毫克的岩藻黃質，回收率可達98.7%。

Claims (1)

1. 一種純化棲狀褐茸藻之岩藻黃質成為微米顆粒之方法，包括：步驟一，超音波溶劑萃取棲狀褐茸藻粉，將棲狀褐茸藻粉與乙酸乙酯溶劑混合，溶固比為60：1(V/g)，進行超音波萃取，溫度為298K，時間10分鐘；萃出液以濾紙過濾，過濾後之濾液以蒸發濃縮法濃縮；獲得之乾燥物再以乙酸乙酯回溶，再進行減壓濃縮，獲得乾燥的超音波初萃物，每克超音波初萃物含5.4毫克的岩藻黃質；步驟二，以第一次正相管柱層析純化超音波初萃物；正相為矽膠填充，動相溶液為，正己烷：丙酮為7：3，沖提液為超音波初萃物與上述動相溶液混合，溶固比為10：1ml/mg，沖提流速每分鐘12ml；收集內含岩藻黃質顏色為黃紅色至深紅色的分劃層做為第一次管柱層析提純物；將該第一次管柱層析提純物以蒸發濃縮法濃縮，獲得第一次管柱層析濃縮物；該第一次管柱層析濃縮物之岩藻黃質濃度及回收率分別為每克濃縮物146.3毫克及84%；步驟三，以第二次正相管柱層析純化第一次管柱層析濃縮物，正相為矽膠填充，動相溶液為正己烷-丙酮混合溶液，正己烷：丙酮為7：3，沖提液為第一次管柱層析濃縮物與上述動相溶液混合，溶固比為10：1ml/mg，沖提流速每分鐘12ml；收集黃紅色分劃層，做為第二次管柱層析提純物；將該第二次管柱層析提純物以蒸發濃縮法濃縮，獲得第二次管柱層析濃縮物；每克第二次管柱層析濃縮物中含719.8毫克之岩藻黃質，岩藻黃質平均回收率為85.4%；步驟四，以超臨界二氧化碳抗溶沈澱純化第二次管柱層析濃縮物，將 第二次管柱層析濃縮物與乙醚溶劑混合，製成濃度10mg/ml的進料溶液，以壓力90bar、時間10分鐘、進料速率0.3ml/min、溫度313K、二氧化碳流速15L/min之固定條件進行抗溶沈澱，獲得超臨界抗溶沈澱粉粒；超臨界抗溶沈澱粉粒每克含有886.2毫克的岩藻黃質，回收率達98.7%。