CN103962091B - 一种银离子改性氨基硅胶分离epa和dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银离子改性氨基硅胶分离EPA和DHA的方法。以银离子改性的氨基硅胶为固定相，装填色谱柱，通过改变氨基硅胶和硝酸银比例、洗脱体系和进样量，使EPA和DHA达到基线分离。该发明方法制备出的填料使EPA和DHA得到了有效分离，同时解决了银离子在硅胶上的不稳定性和在分离过程中易脱落造成的样品污染问题，提高了柱子利用率。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离纯化技术领域，涉及一种银离子改性硅胶分离EPA和DHA新方法。
背景技术
EPA和DHA是深海鱼油成分中主要的特征性脂肪酸，它们都具有重要的生理活性。其中，EPA具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖作用，适合中老年人服用。DHA是大脑细胞形成发育及运作不可缺少的物质基础，改善大脑机能，提高记忆力，是婴儿益智食品的良好基料。它们都是新药和保健食品开发的热点。因此，从鱼油中提取高纯度的单体EPA和单体DHA具有重要的意义。
目前，常用的分离提取方法主要有低温结晶法、膜分离法、酶法、超临界流体萃取法、尿素包合法、分子蒸馏法、硝酸银络合法、吸附分离法和高效液相色谱法；采用单一的方法都不能将EPA和DHA完全分开，所以常常将多种方法结合使用。结合使用中应用最多的就是硝酸银柱层析法，但是现有的硝酸银柱层析法大多采用物理结合法将银离子吸附到硅胶表面， Ag+稳定性差，容易脱落污染样品，影响样品纯度。
本发明建立一种银离子改性氨基硅胶分离EPA和DHA的方法。以银离子改性的氨基硅胶为固定相，制备4.6×250 mm分析柱，通过改变氨基硅胶和硝酸银比例、洗脱体系和进样量，使EPA和DHA达到基线分离。利用该方法制备出的填料解决了银离子的不稳定性和在分离过程中重金属污染样品的问题，提高了柱子利用率，从而更好、更有效的分离EPA和DHA。
申请号为200710054067.3的专利公开了一种硅胶和无机材料粉体表面改性及其制备方法，尤其是涉及一种烷基化制备硅胶的方法。研究了乙二胺功能材料对Cu2+，Pb2+，Zn2 +的吸附性能，通过对吸附过程中的吸附焓、自由能和吸附熵的检测，对乙二胺功能材料吸附金属离子做出了合理解释。
申请号为2008100552839.4的专利公开了一种二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制备和分离方法。该方法采用硝酸银柱层析分离DPA和DHA，结果怎么样？混合脂肪酸甲酯上样质量为填充硝酸银硅胶的质量0.5%-10%，洗脱梯度为0.5~15%的正己烷溶液，最终将DPA含量由原料的20.32%提高到99.61%，DHA含量44.83%提高到99.02%，收率均在90%以上。
发明内容
1氨基硅胶合成
1.1 采用1mol/L硝酸溶液对硅胶进行活化
1.2 采用γ-氯丙基三氯硅烷对硅胶进行烷基化
1.3 烷基化后的硅胶接枝乙二胺，最终合成氨基硅胶
2银离子改性氨基硅胶
1）取一定质量氨基硅胶，加入无水乙醇，常温下搅拌反应。
2）称取一定质量的硝酸银至无水乙醇溶液中，黑暗条件不断搅拌，完全溶解。
3）将2）逐滴加入到正在搅拌的1）中，常温黑暗条件下反应。
4）反应后的样品经过布氏漏斗过滤除去无水乙醇，一定温度活化，放入干燥器内保存待用。
3、分析色谱柱的装填（4.6×250 mm）
取3.0~3.5g 银离子改性的氨基硅胶，正己烷湿法装柱。装柱压力：50~60Mpa；装柱时
间：30min。
4、色谱条件
色谱柱：银离子改性的氨基硅胶；检测波长：210nm；流速：1mL/min；样品：EPA（92%）和DHA（88%）混合液；样品浓度：1mg/mL、10mg/mL；进样量： 20、10、5μL；
流动相：正己烷-异丁醇、正己烷-正丁醇、正己烷-正丙醇、正己烷-异丙醇、环己烷-异丁醇、环己烷-正丁醇、环己烷-正丙醇、环己烷-异丙醇、正己烷-乙酸丁酯、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸丁酯和环己烷-乙酸乙酯。
5、氨基硅胶与硝酸银的比例对分离EPA和DHA的影响
考察氨基硅胶：硝酸银=5:1、10:1、15:1和20:1 下EPA和DHA的分离情况，最终确定最佳比例为15:1。
6、不同进样量对EPA和DHA分离度的影响
考察进样量0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005mg时EPA和DHA的分离度的变化情况。最终确定最佳进样量0.005mg时，EPA和DHA达到有效分离，分离度为1.50。
本发明提供了银离子改性氨基硅胶分离EPA和DHA的方法，首先确定氨基硅胶和硝酸银最佳比例，然后通过改变洗脱体系和进样量，进一步优化该填料对EPA和DHA的分离条件。
附图说明
图1氨基硅胶(10-40μm):硝酸银=15:1、正己烷:异丁醇=2000:1、进样量为0.005mg下EPA和DHA分离液相图；
图2氨基硅胶(5μm):硝酸银=15:1、正己烷:异丁醇=2000:1、进样量为0.005mg下EPA和DHA分离液相图。
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例进行详细说明，但并不仅仅局限于以下实施例。
[实施例1]
1氨基硅胶合成
1.1 采用1mol/L硝酸溶液对硅胶进行活化
1.2 采用γ-氯丙基三氯硅烷对硅胶进行烷基化
1.3 烷基化后的硅胶接枝乙二胺，最终合成氨基硅胶
2银离子改性氨基硅胶
1） 取4份4.0000g乙二胺基偶联接枝氨基硅胶，分别加入100mL无水乙醇，常温下搅拌30min。
2）分别称取0.8000、0.4000、0.2667和0.2000mg硝酸银加于20mL无水乙醇溶液中，黑暗条件不断搅拌，使硝酸银完全溶解。
3）将完全溶解的硝酸银溶液逐滴加入到正在搅拌的1）中，常温黑暗条件下反应25h。
4）反应后的样品经过布氏漏斗过滤除去无水乙醇，90℃下活化约4h。
5）将活化后的银离子改性氨基硅胶迅速装入棕色瓶中，放入干燥器内保存待用。
3 色谱柱的装填
取3.0~3.5g 银离子改性的氨基硅胶，正己烷湿法装柱。装柱压力：50~60Mpa；装柱时间：30min。
4 氨基硅胶与硝酸银的比例对分离EPA和DHA的影响
考察氨基硅胶：硝酸银=5:1、10:1、15:1和20:1 下EPA和DHA的分离情况。当氨基硅胶：硝酸银=10:1~15:1，EPA和DHA的分离效果较佳；考虑成本问题，最终确定最佳氨基硅胶与硝酸银的比例为15:1。
表1不同比例氨基硅胶和硝酸银对EPA和DHA分离度的影响
4不同进样量对EPA和DHA分离度的影响
本实验采用氨基硅胶：硝酸银=15:1，洗脱体系正己烷：异丙醇=1500:1，考察进样量0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005mg时EPA和DHA的分离度的变化情况。最终确定最佳进样量0.005mg时，EPA和DHA达到有效分离，分离度为1.50。
表2不同进样量对EPA和DHA分离的影响
5 不同洗脱体系对EPA和DHA分离度的影响
洗脱体系为正己烷-异丁醇、正己烷-正丁醇、正己烷-正丙醇和正己烷-异丙醇时可有效分离EPA和DHA；在这四种体系下，随着正己烷含量的不断增加，EPA和DHA分离度逐渐增加，其色谱行为完全符合正相色谱规律。
洗脱体系为环己烷-异丁醇、环己烷-正丁醇、环己烷-正丙醇、环己烷-异丙醇、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸丁酯和环己烷-乙酸乙酯时，大部分EPA和DHA吸附在柱子上，小部分洗脱下来的样品也可达到基线分离。
[实施例2]
1银离子改性5μm-氨基硅胶的制备
1）取4.0000g 5μm-氨基硅胶，加入100mL无水乙醇，常温下搅拌30min。
2）称取0.2667硝酸银加于20mL无水乙醇溶液中，黑暗条件不断搅拌，使硝酸银完全溶解。
3）将完全溶解的硝酸银溶液逐滴加入到正在搅拌的1）中，常温黑暗条件下反应25h。
4）反应后的样品经过布氏漏斗过滤除去无水乙醇，90℃下活化约4h。
5）将活化后的银离子改5μm-氨基硅胶迅速装入棕色瓶中，放入干燥器内保存待用。
2 分析色谱柱的装填
取3.0~3.5g 银离子改性的5μm-氨基硅胶，正己烷湿法装柱。装柱压力：50~60Mpa；装柱时间：30min。
3色谱条件
色谱柱：银离子改性的5μm-氨基硅胶；检测波长：210nm；流速：1mL/min；样品：EPA（92%）和DHA（88%）混合液；样品浓度：1mg/mL、10mg/mL；进样量： 5μL；
流动相：正己烷-异丁醇、正己烷-正丁醇、正己烷-正丙醇、正己烷-异丙醇、环己烷-异丁醇、环己烷-正丁醇、环己烷-正丙醇、环己烷-异丙醇、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸丁酯和环己烷-乙酸乙酯。
4 不同洗脱体系对EPA和DHA分离度的影响
其色谱行为完全符合上述实例1的规律，当5μm-氨基硅胶：硝酸银=15:1、洗脱体系为正己烷：异丁醇=2000:1，进样量是0.005mg时，EPA和DHA分离效果最佳，分离度达到2.03。
表3不同洗脱体系对EPA和DHA分离影响
| 1000:1 | 1500：1 | 2000:1 | |
| 正己烷:异丁醇 | 1.51 | 1.57 | 2.03 |
| 正己烷:正丁醇 | 1.44 | 1.49 | 1.61 |
| 正己烷:正丙醇 | 1.44 | 1.78 | 1.93 |
| 正己烷:异丙醇 | 1.37 | 1.51 | 1.62 |
Claims (2)
1.一种银离子改性氨基硅胶分离EPA和DHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备银离子改性氨基硅胶：取一定质量的硝酸银配制成乙醇溶液，逐滴加入到正在搅拌的氨基硅胶醇溶液中，常温下反应20h-30h，过滤，90℃下真空干燥4h后避光干燥保存，制得银离子改性的氨基硅胶；所述氨基硅胶分为两种：一种是以市售无定型硅胶为原料由实验室自制的粒径为10-40μm的乙二胺偶联接枝合成氨基硅胶，另一种是粒径为5μm的市售通用色谱分析氨基硅胶；
(2)银离子改性氨基硅胶柱色谱分离EPA和DHA
取3.0～3.5g银离子改性的氨基硅胶，以正己烷为装柱流动相，采用通用正相色谱柱装填方法进行装柱，装柱的规格为4.6×250mm；
分离EPA和DHA的色谱条件如下：
色谱柱：银离子改性氨基硅胶；检测波长：210nm；流速：1mL/min；样品：92％的EPA和88％的DHA的混合液；样品浓度：1mg/mL、10mg/mL；进样量：20、10、5μL；分离流动相：正己烷-异丁醇、正己烷-正丁醇、正己烷-正丙醇、正己烷-异丙醇、环己烷-异丁醇、环己烷-正丁醇、环己烷-正丙醇、环己烷-异丙醇、正己烷-乙酸丁酯、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸丁酯。
2.据权利要求1所述的一种银离子改性氨基硅胶分离EPA和DHA的方法，其特征在于：所述分离流动相是由正己烷、环己烷为主要洗脱体系，正构烷基醇、异构烷基醇和乙酸乙酯、乙酸丁酯为调解体系所组成二元洗脱体系。
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