CN108059628A - 一种蓝莓花青素的快速制备方法 - Google Patents

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刘欣欣
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Abstract

本发明公开了一种蓝莓花青素的快速制备方法，属于植物提取技术领域。蓝莓中花青素由酸化乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂以及MCI柱层析分离等三步获得。所制得花青素的纯度可达50％以上。本方法采用酸化乙醇作为提取剂，提取充分；通过MCI柱分离，有效除去了非花青素类杂质，工艺合理，并且本方法成本低廉，操作步骤简单，易于放大，非常适合规模化生产。

Description

一种蓝莓花青素的快速制备方法
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，涉及一种蓝莓花青素的制备方法，特别是涉及一种采用萃取技术和MCI柱层析技术联用快速提取制备蓝莓中花青素的方法。
背景技术
蓝莓又称“越桔”，为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，是一种古老且具有较高经济价值的新兴小浆果树种。研究表明，蓝莓果实中花青素的含量是所有的水果与蔬菜之中最高的，主要集中于它的紫色果皮部位。蓝莓花青素的抗氧化活性很强，并具有促进视红素再合成、增强免疫、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老及抗癌等多种生理功能，已成为蓝莓研究的热点之一。然而，目前蓝莓主要以直接鲜食形式消费或加工成果酒、果汁、果酱等初级产品，而高附加值的蓝莓产品在市场上还为数不多。花青素又称“花色素”，属黄酮类化合物，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素。现已知的花青素有20多种。花青素的基本结构单元是2-苯基苯并吡喃型阳离子，即花色基元。自然条件下游离状态的花青素极少见，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷，已知天然存在的花色苷有250多种。蓝莓花青素的制备是该植物资源开发的前提，现有的技术主要包括溶剂浸提法、酶法等，但这些制备方法均存在提取时间长、提取率低、有效成分损耗大和提取成本高等缺点。因此，开展蓝莓花青素快速制备方法的研究具有重要意义。
发明内容
本发明在前期研究蓝莓化学成分的基础上，提供了一种快速制备蓝莓中花青素的新工艺。以蓝莓为原料，经酸化乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂以及凝胶柱层析等步骤，所得流份直接减压浓缩至干即可获得目标成分含量大于50％的蓝莓花青素。步骤为：
(1)取蓝莓鲜果，破碎，加酸化乙醇溶液浸渍，避光提取2～3次，每次10～12小时，过滤后合并滤液，负压下干燥至无酸味，得浸膏；
(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入一定体积的乙酸乙酯避光萃取，重复2～4次，每次20～40分钟。之后放出水层，合并，在负压下蒸干，得萃取物；
(3)将上述萃取物用纯水溶解后，湿法上样，过凝胶层析柱，依次以纯水及一定浓度的乙醇-水溶液洗脱，收集相应流份，干燥即得蓝莓花青素。
上述步骤(1)中提取蓝莓所用的酸化乙醇溶液为体积分数为65％～75％的乙醇与0.1mol/L盐酸9：1混合，其体积按液料比计为蓝莓质量的4～6倍。
上述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积为浸膏质量的1～2倍，萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2～4倍。
上述步骤(3)中分散萃取物所用纯水的体积为萃取物质量的1～2倍。
上述步骤(3)中凝胶柱层析所用填料为MCI微孔树脂，型号为CHP20/P120。
上述步骤(3)中洗脱所用乙醇-水溶液的体积浓度依次为35％～45％，洗脱后收集该流份。
综上所述，本发明具有的优点为：
(1)采用酸化乙醇长时间浸渍，提取较充分。
(2)采用纯水分散、乙酸乙酯萃取的方法除去大部分脂溶性杂质，减少了后续上柱的样品量，同时减轻了对凝胶柱分离的干扰，使MCI对花青素的分离能力大大增强，更能适应规模化提取的需要。
(3)凝胶层析柱首先以纯水洗脱，除去含量较高的多糖等强极性成分，之后以体积分数为40％的乙醇-水洗下所有花青素，也避免其他弱极性杂质的引入。
(4)提取、萃取及凝胶柱层析等操作均在低温、避光条件下进行，有效减少了花青素的分解。
(5)本发明工艺简单，产品目标成分含量高、色泽好，非常适合大规模生产。
附图说明
图1为以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品，采用pH示差法测定蓝莓花青素纯度的标准曲线图。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
取蓝莓鲜果100g，破碎，加400mL酸化乙醇溶液(65％乙醇与0.1mol/L盐酸按体积9：1混合)浸渍，避光提取2次，每次10小时，过滤后合并滤液，负压下干燥至无酸味，得浸膏21.2g。将浸膏用25mL纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入50mL乙酸乙酯避光萃取，重复2次，每次20分钟。之后放出水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物12.5g。将萃取物用15mL纯水分散后，湿法上样，过MCI微孔树脂层析柱(柱长50cm，内径2.5cm)，依次以2倍柱体积纯水及2倍柱体积体积分数为35％的乙醇-水溶液洗脱，收集乙醇-水溶液洗脱流份，干燥即得蓝莓花青素204.3mg。
以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品，采用pH示差法测定蓝莓花青素的纯度。取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷1mg，用甲醇溶解并定容至5mL，制得0.2mg/mL花青素标准品溶液。分别取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL上述标准品溶液，用pH 1.0醋酸铵缓冲溶液(0.1M)定容到5mL(浓度依次为4、8、16、32、64μg/mL)；再分别取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL标准品溶液，用pH4.5氯化钾缓冲溶液(0.025M)定容到5mL。在510nm及700nm下，分别测定上述各溶液的吸光度值，根据公式(1)计算出各溶液的示差吸光度，并以示差吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制出标准曲线，得标准回归方程为y＝0.0253x+0.0348，相关系数R2＝0.9995。
取实施例1所制得的蓝莓花青素1mg，用5mL甲醇溶解。再从中取1mL，分别用pH 1.0与pH 4.5的缓冲溶液稀释至4mL，制得浓度为50μg/mL的蓝莓花青素样品溶液。之后依次在510nm与700nm下测定吸光度，按公式(1)计算示差吸光度，利用标准回归方程计算得花青素的纯度为52.5％。
相关实验数据见表1、表2及附图1。
表1矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品溶液的浓度与吸光度
表2蓝莓花青素样品溶液(50μg/mL)的吸光度
实施例2
取蓝莓鲜果100g，破碎，加500mL酸化乙醇溶液(75％乙醇与0.1mol/L盐酸9：1混合)浸渍，避光提取2次，每次11小时，过滤后合并滤液，负压下干燥至无酸味，得浸膏23.3g。将浸膏用45mL纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入150mL乙酸乙酯避光萃取，重复4次，每次25分钟。之后放出水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物13.5g。将萃取物用25mL纯水分散后，湿法上样，过MCI微孔树脂层析柱(柱长50cm，内径2.5cm)，依次以2倍柱体积纯水及2倍柱体积体积分数为40％的乙醇-水溶液洗脱，收集流份，干燥即得蓝莓花青素220.6mg。
实施例3
取蓝莓鲜果200g，破碎，加1000mL酸化乙醇溶液(70％乙醇与0.1mol/L盐酸9：1混合)浸渍，避光提取3次，每次11小时，过滤后合并滤液，负压下干燥至无酸味，得浸膏48.1g。将浸膏用50mL纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入200mL乙酸乙酯避光萃取，重复3次，每次30分钟。之后放出水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物29.4g。将萃取物用30mL纯水分散后，湿法上样，过MCI微孔树脂层析柱(柱长50cm，内径2.5cm)，依次以2倍柱体积纯水及2倍柱体积体积分数为40％的乙醇-水溶液洗脱，收集流份，干燥即得蓝莓花青素462.6mg。
实施例4
取蓝莓鲜果200g，破碎，加1200mL酸化乙醇溶液(70％乙醇与0.1mol/L盐酸9：1混合)浸渍，避光提取3次，每次12小时，过滤后合并滤液，负压下干燥至无酸味，得浸膏51.2g。将浸膏用50mL纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入200mL乙酸乙酯避光萃取，重复3次，每次40分钟。之后放出水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物31.9g。将萃取物用35mL纯水分散后，湿法上样，过MCI微孔树脂层析柱(柱长50cm，内径2.5cm)，依次以2倍柱体积纯水及2倍柱体积体积分数为45％的乙醇-水溶液洗脱，收集流份，干燥即得蓝莓花青素470.5mg。

Claims (6)

1.一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取蓝莓鲜果，破碎，加酸化乙醇溶液浸渍，避光提取，然后分离收集滤液，滤渣再次提取分离1～3次，每次提取10～12小时，过滤后合并滤液，负压下浓缩得浸膏；
(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯避光萃取，之后放出水层；重复萃取过程1～4次，每次萃取20～40分钟；合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物；
(3)将上述萃取物用纯水分散后，湿法上样，过凝胶层析柱，依次以纯水及乙醇-水溶液洗脱，收集相应乙醇-水溶液洗脱流份，干燥即得蓝莓花青素。
2.如权利要求1所述的一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取蓝莓所用的酸化乙醇溶液为体积分数为65％～75％的乙醇与0.1mol/L盐酸按体积比1：9～9：1混合，按液料比计，酸化乙醇溶液体积ml为蓝莓质量g的4～6倍。
3.如权利要求1所述的一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积ml为浸膏质量g的2～3倍，萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2～4倍。
4.如权利要求1所述的一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中分散萃取物所用纯水的体积ml为萃取物质量g的1～2倍。
5.如权利要求1所述的一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中凝胶柱层析所用填料为MCI微孔树脂，型号为CHP20/P120。
6.如权利要求1所述的一种蓝莓花青素的快速制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中洗脱所用乙醇-水溶液的体积浓度为35％～45％，洗脱后收集该流份。
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