CN110092772B - 一种蓝莓花青素高选择性分离方法和分离材料 - Google Patents

Abstract

一种蓝莓花青素高选择性分离方法和分离材料。本发明涉及一种蓝莓花青素高选择性分离方法，包括如下步骤：(1)高选择性分离材料研制，利用表面修饰技术，制备对蓝莓花青素具有高选择性分离材料；(2)分离材料应用，基于制备的高选择性分离材料，利用柱色谱技术，纯化蓝莓提取物，制备高纯度花青素及蓝莓多糖。本发明可促进蓝莓资源开发利用和产业化生产，同时为蓝莓高值化、综合开发提供技术支撑。

Description

一种蓝莓花青素高选择性分离方法和分离材料

技术领域：

本发明涉及一种蓝莓高选择性分离材料研制及其应用，尤其涉及一种采用表面修饰技术制备的高选择性蓝莓花青素富集材料，及采用该材料从蓝莓粗提液中富集纯化蓝莓多糖与蓝莓花青素的方法，属于天然产物提取纯化领域，本发明可促进蓝莓资源开发利用和产业化生产，同时为蓝莓高值化、综合开发提供技术支撑。

背景技术：

蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)为杜鹃花科越橘属小浆果，蓝莓栽培遍及全球各地，截止2017年我国蓝莓栽培面积达到31210hm2，总产量为114905t，北起黑龙江，南至海南，东起渤海之滨，西至西藏高原，全国规模化种植的省份、直辖市、自治区达到27个。山东省、贵州省和辽宁省蓝莓规模化种植最早，也是目前我国栽培面积和产量位列前三的省份。蓝莓果实营养丰富，是含有花色苷种类最多，花色苷含量最高的小浆果之一，蓝莓果中花青素被称为果蔬中的“第一号抗氧化剂”。蓝莓花青素属于以2-苯基苯并吡喃(C6-C3-C6)为母核的黄酮类化合物，由矢车菊色素、飞燕草色素、锦葵色素、芍药色素、牵牛花青素等5种花青素苷元，以及它们各自与葡萄糖、乙酰葡萄糖、半乳糖、乙酰半乳糖、阿拉伯糖、乙酰阿拉伯糖连接形成的花青素糖苷所组成，具有抗氧化、预防癌症、增强视力等多种生理功能，在食品、化妆品、药品等领域有着广阔的应用前景。

植物提取物中活性成分的初步富集与纯化是实现工业化生产的关键步骤。活性成分常规的分离方法一般是通过液-液萃取或者制备型高效液相色谱分离，但是，前者分离效果较差且得到的产品质量少，而后者成本较高并难以推广。大孔树脂是一类新型的非离子型高分子吸附分离介质，具有高稳定性和特殊的选择性，操作条件温和、富集效果明显、成本低廉、适合大规模工业化生产，已被广泛应用于花色苷、多糖、多酚等活性成分的分离纯化研究中。近年来，国内外一些研究者也将大孔吸附树脂应用于蓝莓花色苷的分离纯化，但是仅靠大孔树脂分离纯化成分复杂的蓝莓花色苷，无法得到令人满意的高纯度组分，这也成为限制蓝莓花色苷广泛应用的一个亟待解决的问题。因此，本专利在系统分析了多种大孔树脂对蓝莓花色苷分离效果的基础上，采用硅胶表面修饰技术，将经硅胶表面修饰的高选择性分离材料，用于对蓝莓多糖、花色苷进行分离与纯化，并对得到的花色苷单体进行结构鉴定和定量分析。本专利将为工业化生产高纯度蓝莓多糖、花色苷提供技术支撑。

发明内容：

本发明的目的是提升蓝莓附加值，并为蓝莓深加工提供关键技术及产业化应用。本发明包括如下步骤：

1、高选择性蓝莓富集纯化材料研制：采用氨基硅烷偶联剂对20-50um活化硅胶进行表面修饰，利用三乙胺进行封端，通过有机溶剂、超纯水等洗脱未反应的单体及反应试剂，真空干燥备用。

2、蓝莓功能性成分提取：在水浴超声辅助的条件下，利用乙醇：水：酸对均质化蓝莓果肉高效提取，重复提取，高速离心，合并两次提取液，在真空条件下，旋转蒸发去除提取液乙醇备用。

3、蓝莓多糖富集纯化：将制备的高选择性富集分离材料，装填固相萃取柱中，手动上样，控制上样及滴落液流速，用超纯水洗脱至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用烘干/冻干模式得到高纯度蓝莓多糖，采用质谱鉴定产物结果，色谱测定产物纯度。

4、蓝莓花青素富集纯化：将上样经纯水洗脱后的固相萃取柱，采用乙醇:水：酸的洗脱液洗脱，分段收集蓝色流出液与红色流出液，将流出液采用烘干或冻干模式进行干燥，采用质谱鉴定产物结构，色谱测定产物纯度。

步骤1种所述的氨基硅烷偶联剂为下列的一种或几种，三甲氧基氨丙基偶联剂、二甲氧基氨丙基偶联剂、三乙氧基氨丙基硅烷偶联剂、三甲氧基氨乙基氨丙基偶联剂、二甲氧基氨乙基氨丙基偶联剂、三乙氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂、三甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基偶联剂、二甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基偶联剂、三乙氧基氨乙基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂剂。

步骤1中所述的硅胶与氨基硅烷偶联剂的质量比为10:1-1:1。

步骤2种所述的乙醇:水:酸(v/v/v)40-80/60-20/0.1-1的混合提取液，在40-80℃水浴超声10-60min，料液比为1:10-1:20。

步骤2所述的酸为盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、醋酸、甲酸、酒石酸中的一种或几种。

步骤3所述的固相萃取柱为采用干法/湿法装填直径1-10cm,长度10-100cm的具塞固相萃取柱。

步骤3所述的控制上样、滴落流速及料液比为，控制流速5-20BV/h，溶液滴落速度2-10BV/h，上样料液比为1:5-1:30。

步骤4所述的乙醇:水：酸的体积比为(20-70/70:10/10-20)(v/v/v),酸为盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、醋酸、甲酸、酒石酸中的一种或几种。

活化硅胶的活化方法为：取粒径20-50um的硅胶加入质量浓度10％Hcl回流12h，用超纯水洗至中性，真空干燥备用。

1)本发明利用表面修饰技术，制备对蓝莓花青素具有高选择性分离材料；

2)本发明基于制备的高选择性分离材料，利用柱色谱技术，纯化蓝莓提取物，制备高纯度花青素及蓝莓多糖。本发明可促进蓝莓资源开发利用和产业化生产，同时为蓝莓高值化、综合开发提供技术支撑。

具体实施方式

实施例1、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三甲氧基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为1:10，在100℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应24h，加入活化硅胶质量0.1％三乙胺,反应0.5h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于150℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.4mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/50/10)的混合提取液，在80℃水浴超声60min，料液比为1:20，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1-1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用干法装填直径1cm,长度100cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度5BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用冻干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为70％。

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速10BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用冻干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定花青素回收率为68％，纯度为71％。

实施例2、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(双甲氧基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为1.5:10，在120℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8h，加入活化硅胶质量0.1％三乙胺,反应1h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于100℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.5mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的5g蓝莓果泥称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/20/1)的混合提取液，在40℃水浴超声60min，料液比为1:20，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用干法装填直径1cm,长度100cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速20BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度10BV/h，上样料液比为1:30，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用冻干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为69％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速5BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用烘干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率为75％，纯度为73％。

实施例3、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三乙氧基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为2:10，在100℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8h，加入活化硅胶质量0.1％三乙胺,反应0.5h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于150℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.8mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/0.1)的混合提取液，在40-80℃水浴超声10min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度2BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用冻干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为73％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速5BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用冻干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率为79％，纯度为74％。

实施例4、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三甲氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为3:10，在100℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8h，加入活化硅胶质量0.1％三乙胺,反应0.5h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于100℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为1.8mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/0.1)的混合提取液，在80℃水浴超声60min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用干法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度2BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，色谱法测定多糖纯度为75％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速5BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用烘干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为单一芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率为81％，纯度为76％。

实施例5、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(双甲氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为4:10，在120℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％(w/w)偶氮二异丁腈，反应24h，加入活化硅胶质量1％(w/w)三乙胺,反应1h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于150℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为1.7mmol·g-11.7

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/1)的混合提取液，在40℃水浴超声60min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径10cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度10BV/h，上样料液比为1:30，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用冻干/烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度71％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速10BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用烘干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率为83％，纯度为72％。

实施例6、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三乙氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为3:10，在120℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应24h，加入活化硅胶质量1％三乙胺,反应1h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于150℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为1.0mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/0.1)的混合提取液，在80℃水浴超声60min，料液比为1:20，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5-20BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度10BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用冻干/烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为66％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速10BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用冻干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定花青素的回收率为75％，纯度为73％。

实施例7、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为2:10，在120℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8h，加入活化硅胶质量0.1％三乙胺,反应0.5h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于150℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.8mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/0.1)的混合提取液，在40℃水浴超声60min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速20BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度10BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为82％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速5BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用烘干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定混合花青素回收率为93％，纯度为89％。

实施例8、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(双甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为1.5:10，在100℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8-24h，加入活化硅胶质量1％三乙胺,反应1h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于100℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.6mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/0.1)的混合提取液，在80℃水浴超声10min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速5BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度2BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为79％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速5BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用冻干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率为87％，纯度为80％。

实施例9、

1、高选择性分离材料研制：利用氨基硅烷偶联剂(三乙氧基氨乙基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂)对50g 20-50um活化硅胶进行表面修饰，偶联剂与活化硅胶的质量比为1:10，在120℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量0.1％偶氮二异丁腈，反应8-24h，加入活化硅胶质量1％三乙胺,反应0.5h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于100℃真空干燥，即得高选择性分离材料。通过元素分析获得硅胶与氨基硅烷偶联剂的键合量为0.4mmol·g-1

2、蓝莓粗提液：将均质化的蓝莓果泥5g称取在100mL离心管中，加入提取剂乙醇：水：酸(v/v/v)(40/60/1)的混合提取液，在80℃水浴超声10min，料液比为1:10，离心取上清液，重复提取一次，合并上清液，真空旋转蒸发，0.1h，去除乙醇。

3、蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料5g采用湿法装填直径1cm,长度10cm的北京欣维尔具塞固相萃取柱中，上样蓝莓粗提液，手动上样，控制上样流速20BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度10BV/h，上样料液比为1:5，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，采用烘干方式得到蓝莓多糖粉末，经质谱法鉴定产物结构，结果为，黄色流出液为蓝莓多糖，色谱法测定多糖纯度为83％

4、蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸(v/v/v)(20/70/10)，控制淋洗液流速10BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液，采用冻干方式得到蓝莓花青素粉末，采用质谱法鉴定产物结构，结果为蓝色流出液为芍药花青素，红色流出液为多种花青素混合液，色谱法测定回收率91％，纯度为81％。

实施例10：

1、花青素吸附效果比较：将实施例1制备的花青素高选择性分离材料与文献报道中的大孔吸附树脂(AB-8、D-101)、聚酰亚胺材料、及采用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷偶联剂、同实施例1过程制备的吸附材料在同等的条件下进行比较，过程同具体实施实例1所述，不同之处在于大孔吸附树脂采用95％乙醇浸泡24h，湿法装柱，用蒸馏水洗至流出液体无醇味，聚酰亚胺采用95％乙醇煮沸4h,湿法装柱，蒸馏水洗至流出无醇味。以10g吸附材料为吸附介质，上样蓝莓粗提液，实施例1制备的吸附材料可吸附原液200mL，AB-8为20mL,D101为30mL，聚酰亚胺粉为50mL，羧基硅烷偶联剂制备的吸附材料为5mL，本专利制备的吸附量为大孔吸附树脂AB-8的10倍，D101的6.7倍，聚酰亚胺粉的4倍，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷偶联剂制备吸附材料的40倍。其中采用实施实例7、8、9种制备的吸附材料得到的花青素和蓝莓多糖回收率，纯度显优于具体实施实例1-6采用三甲氧基氨丙基硅烷偶联剂、双甲氧基氨丙基硅烷偶联剂、三乙氧基氨丙基硅烷偶联剂、三甲氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂、双甲氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂、三乙氧基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂的氨基硅烷偶联剂。

2、花青素解析效果比较：将制备的花青素高选择性分离材料与大孔吸附树脂在相同解析液下进行解析，本专利制备的高选择性分离材料，可直接获得单一的花青素甘元，和混合的花青素甘元，同时在相同上样量条件下，以10g的吸附材料作比较，以回收率80％为终点，本专利所需解析液5mL，大孔树脂(AB-8、D101)为20mL，聚酰亚胺粉为50mL，本专利的解析效率为大孔吸附树脂的4倍和10倍。

3、花青素纯度比较：采用本专利制备条件下的吸附材料在相同的上样和洗脱条件下，实施例7制备的红色流出液为多种蓝莓花青素混合溶液纯度为89％，黄色流出液蓝莓多糖的纯度为82％，蓝色流出液为芍药色素的纯度为91％，回收率为93％。采用大孔吸附树脂、聚酰亚胺粉仅能得到多种蓝莓花青素混合溶液纯度为71％。

Claims (4)

1.一种蓝莓花青素高选择性分离方法，其特征在于：

1）高选择性分离材料的制备：利用氨基硅烷偶联剂对粒径20-50μm经质量浓度5-10%HCl回流的活化硅胶进行表面修饰，在100-120 ℃无水甲苯真空体系下，加入活化硅胶质量的0.1-1%（w/w）的偶氮二异丁腈，反应8-24 h，加入活化硅胶质量的0.1-1%（w/w）的三乙胺，反应0.5-1h，产物抽滤后，依次用甲苯、无水乙醇、去离子水，冲洗未反应单体，于100-150℃真空干燥，即得高选择性分离材料，硅胶与氨基硅烷偶联剂的质量比（w/w）为10:1-1:1，硅胶表面氨基硅烷偶联剂的键合量为0.1-4mmol·g-1；

所述氨基硅烷偶联剂为三甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基偶联剂、二甲氧基氨乙基氨乙基氨丙基偶联剂、三乙氧基氨乙基氨乙基氨丙基硅烷偶联剂中的一种或二种以上；

2）蓝莓多糖、蓝莓花青素提取：采用乙醇:水:酸（v/v/v）=40-80/60-20/0.1-1的混合提取液，在40-80 ℃水浴超声10-60min，提取蓝莓果肉，蓝莓果肉与提取液的料液质量比为1:10 -1:20； 3000-10000r/min离心5-10min，收集上层清液；残渣采用上述条件再重复提取1次或2次，合并上层清液，即为蓝莓多糖、蓝莓花青素粗提液；

3）蓝莓多糖纯化：将制备的高选择性分离材料采用干法和/或湿法装填直径1-10cm,长度10-100cm的具塞固相萃取柱中，粗提液在50-60℃，真空旋转蒸发，0.1-1h，去除乙醇，上样经干法/湿法装填的固相萃取柱，上样，控制上样流速5-20BV/h，通过隔膜真空泵加压，控制溶液滴落速度2-10BV/h，上样填料与粗提液质量比为1:5-1:30，上样完成后，采用超纯水淋洗至黄色流出液消失，收集黄色流出液，干燥得到蓝莓多糖粉末；

4）蓝莓花青素纯化：将上样后，经超纯水淋洗至黄色消失的固相萃取柱，切换淋洗液为乙醇：水：酸（v/v/v）=(20-70/70-10/10-20)，控制淋洗液流速5-10BV/h，收集蓝色流出液，待蓝色流出液消失后，更换收集瓶，收集至红色流出液消失，将收集的蓝色流出液、红色流出液干燥，得到蓝莓花青素粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）和（4）中所述酸为无机酸和/或有机酸，无机酸为盐酸、磷酸、硝酸、硫酸中的一种或二种以上；有机酸为柠檬酸、醋酸、甲酸、酒石酸中的一种或二种以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中得到蓝莓多糖粉末经质谱法鉴定产物结构，色谱法测定多糖纯度；步骤（4）中得到蓝莓花青素粉末采用质谱法鉴定产物结构，色谱法测定花青素纯度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）或步骤（4）中采用的干燥方式为冻干或烘干方式。