CN108727328A - 一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，本发明同时将混合酶和超声波联合辅助提取蓝莓中的花青素，让混合酶在超声波环境中加速破坏细胞结构，从而提高蓝莓花青素的出汁率，再用乙醇溶剂将蓝莓花青素提取出来，最后将花青素粗提取液通过预先处理的硅胶层析柱，得到高纯度花青素。该提取方法不仅可以大大缩短提取时间，最大程度地将有效成分提取出来，显著提高提取率，而且操作简单易行、生产工艺参数稳定、产品质量稳定，适合工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于植物提取技术领域，具体是一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法。
背景技术：
花青素是纯天然的抗衰老的营养补充剂，它是当今人类发现最有效的抗氧化剂，我们从蓝莓中可高效提取并纯化花青素，可广泛用在医学，化妆品行业。
蓝莓花青素的提取和纯化是花青素生产和投入使用的关键环节。而现有蓝莓花青素提取的技术主要有用溶剂浸取，也有用酶法提取的，但这些提取方法得提取成本高，提取过程较复杂，其提取率相对较低。
中国专利文献申请号为CN201610551414.2的资料中所述的蓝莓花青素的提取方法如下：首先，将蓝莓搅碎成蓝莓果浆，然后，加入生物复合酶酶解，再经超声波辅助提取、离心收集上清液、超滤浓缩、喷雾干燥，得花青素；所述的生物复合酶为酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的复合物。混合酶联合超声波辅助浸提法能解决单一辅助法提取效率过低，但是操作时间较长。
中国专利文献申请号为CN201610978607.6的资料中公开了一种高效提取蓝莓花青素的方法，属于植物提取技术领域。蓝莓中花青素由酸化乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂以及小孔树脂凝胶柱层析分离等三步获得，所制得花青素的纯度可达50％以上。本方法采用酸化乙醇作为提取剂，提取充分；通过小孔树脂凝胶柱分离，有效除去了非花青素类杂质，工艺合理。但是，采用小孔树脂不仅成本较高，而且小孔树脂含有有机物材料，早被国家药监局列为限制使用产品，不适合规模化生产。
发明内容：
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，它采用酶-超声联合辅助提取以及硅胶柱层析纯化工艺，具有工序简单，成本低廉，效率高的优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：依次按照以下步骤进行：
一、蓝莓的预处理：
1)取蓝莓干果置于粉碎机中进行粉碎。
2)将粉碎后的蓝莓干粉取出，过50-70目筛。
3)收集过筛后的蓝莓干粉装于洁净的塑料袋中，放置冰箱保存备用。
二、混合酶联合超声粗提：
1)分别取蓝莓干粉和混合酶并按照90-110:1的重量配比混合后加入洁净且干燥的锥形瓶中，所述混合酶包括有纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的重量配比为4:6。
2)向锥型瓶中加入体积分数为40-80％的乙醇溶液搅匀，调节pH＝4-5，密封；其中蓝莓干粉与乙醇溶液的固液比为1:28-32g/mL。
3)将密封后的锥形瓶放入超声波清洗机中，超声波清洗机的温度设定为45-55℃，功率为750-950W，超声时间为20-40min。
4)所述蓝莓干粉经过超声波破壁和减压过滤操作，分离滤渣后去除，得到花青素粗提取液。
这一步骤中，本发明同时将混合酶和超声波联合辅助提取蓝莓中的花青素，让混合酶在超声波环境中加速破坏蓝莓的细胞壁结构，从而提高蓝莓花青素的出汁率。
三、硅胶层析柱预处理：
1)称量50-70g硅胶置于烧杯中，向烧杯中加入浓盐酸使浓盐酸刚好淹没硅胶面，浸泡9-11h。
2)用蒸馏水洗涤浸泡盐酸后的硅胶，当洗涤的水呈中性后，继续冲洗0.2-0.7h，除尽硅胶上附着的氯离子。
3)晾干除尽氯离子的硅胶，在烘箱中100-120℃的条件下活化1-3h。
这一步骤中，将硅胶进行除氯离子后在活化处理，有助于提高硅胶的吸附能力。
四、花青素的纯化：
1)取一只洁净且干燥的色谱柱，将活化后的硅胶通过漏斗均匀地注入色谱柱中，期间用橡胶锤轻轻地敲击色谱柱柱身，使色谱柱中的硅胶紧致且结实，保持硅胶上表面平整。
2)色谱柱中注满硅胶后，在色谱柱上端安置分液漏斗一，将乙醇溶液加入分液漏斗一中，打开分液漏斗一下端活塞和色谱柱下端活塞，使乙醇溶液沿色谱柱内壁缓慢流入，并从色谱柱下端缓慢流出，所述乙醇溶液流速和分液漏斗一流速相同；待硅胶中的空气经乙醇溶液排尽后，停止注入乙醇溶液并关闭色谱柱下端活塞，拿开分液漏斗一并保持乙醇溶液高出硅胶顶面1-3mm，此过程中一直保持硅胶上表面平整。
3)在色谱柱上端安置分液漏斗二，将花青素粗提取液加入分液漏斗二中，打开分液漏斗二下端活塞和色谱柱下端活塞，使花青素粗提取液沿色谱柱内壁均匀缓慢地注入，始终保持硅胶上表面平整，此时花青素吸附到硅胶中；待分液漏斗二中的花青素粗提取液全部流出后，关闭色谱柱下端活塞并拿走分液漏斗二。
4)在色谱柱上端安置分液漏斗三，将洗脱剂乙醇加入分液漏斗三中，打开分液漏斗三下端活塞和色谱柱下端活塞，加入洗脱剂乙醇，保持乙醇的加入流速和下端流出流速相同，用锥形瓶收集下端收集流出液。
5)对收集的流出液进行减压溶缩，除去流出液中的乙醇后，得到蓝莓花青素。
这一步骤中，先将色谱柱中通过注入乙醇溶液的方式排出色谱柱中的空气。接着，在色谱柱中注入花青素粗提取液，使得花青素粗提取液中的花青素在硅胶表面许多硅醇基团的作用下产生吸附作用，达到与其他成分一步分离的效果，再向色谱柱中注入高程度的洗脱剂乙醇，此时，“滞留”在硅胶中的花青素随着乙醇一起从色谱柱下端流出，最后通过减压溶缩的方式，去除流出液中的乙醇，得到高纯度的蓝莓花青素。
所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：蓝莓的预处理中，将粉碎后的蓝莓干粉取出，过60目筛。
所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：混合酶联合超声粗提中：
1)分别取蓝莓干粉和混合酶并按照100:1的重量配比混合后加入洁净且干燥的锥形瓶中，所述混合酶包括有纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的重量配比为4:6。
2)向锥型瓶中加入体积分数为60％的乙醇溶液搅匀，调节pH＝4，密封；其中蓝莓干粉与乙醇溶液的固液比为1:30g/mL。
3)将密封后的锥形瓶放入超声波清洗机中，超声波清洗机的温度设定为50℃，功率为800W，超声时间为30min。
所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：硅胶层析柱预处理：
1)称量60g硅胶置于烧杯中，向烧杯中加入浓盐酸使浓盐酸刚好淹没硅胶面，浸泡10h。
2)用蒸馏水洗涤硅胶，当洗涤的水呈中性后，继续冲洗0.5h，除尽硅胶上附着的氯离子。
3)晾干硅胶，在烘箱中110℃的条件下活化2h。
所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：花青素纯化的步骤2)中拿开分液漏斗一并保持乙醇溶液高出硅胶顶面2mm，此过程中一直保持硅胶上表面平整。
所述硅胶注入色谱柱的高度为8-10cm。
为证明了以上提取和纯化方法的提取和纯化效果，进行了五组实验，每组实验都是按照上面的工艺流程，五组实验所采用的参数分别为：
实验一采用的参数
实验二采用的参数
实验三采用的参数
实验四采用的参数
实验五采用的参数
每组实验得到的结果，汇成的表格如下。
可见，本发明方法对蓝莓花青素的提取率高。
本发明的优点是：
本发明同时将混合酶和超声波联合辅助提取蓝莓中的花青素，让混合酶在超声波环境中加速破坏细胞结构，从而提高蓝莓花青素的出汁率，再用乙醇溶剂将蓝莓花青素提取出来，最后将花青素粗提取液通过预先处理的硅胶层析柱，得到高纯度花青素。该提取方法不仅可以大大缩短提取时间，最大程度地将有效成分提取出来，显著提高提取率，而且操作简单易行、生产工艺参数稳定、产品质量稳定，适合工业化生产；另外，本发明方法提取及纯化后的蓝莓花青素最高可达16.64％，即每1g干果可以提取166.40mg花青素(略高于大孔树脂的14.271％)，具有较高的市场应用价值。
具体实施方式：
一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：依次按照以下步骤进行：
一、蓝莓的预处理：
1)取蓝莓干果置于粉碎机中进行粉碎。
2)将粉碎后的蓝莓干粉取出，过60目筛。
3)收集过筛后的蓝莓干粉装于洁净的塑料袋中，放置冰箱保存备用。
二、混合酶联合超声粗提：
1)分别取蓝莓干粉和混合酶并按照100:1的重量配比混合后加入洁净且干燥的锥形瓶中，所述混合酶包括有纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的重量配比为4:6。
2)向锥型瓶中加入体积分数为40-80％的乙醇溶液搅匀，调节pH＝4，密封；其中蓝莓干粉与乙醇溶液的固液比为1:30g/mL。
3)将密封后的锥形瓶放入超声波清洗机中，超声波清洗机的温度设定为50℃，功率为800W，超声时间为20-40min。
4)所述蓝莓干粉经过超声波破壁和减压过滤操作，分离滤渣后去除，得到花青素粗提取液。
三、硅胶层析柱预处理：
1)称量50-70g硅胶置于烧杯中，向烧杯中加入浓盐酸使浓盐酸刚好淹没硅胶面，浸泡10h。
2)用蒸馏水洗涤硅胶，当洗涤的水呈中性后，继续冲洗0.5h，除尽硅胶上附着的氯离子。
3)晾干硅胶，在烘箱中110℃的条件下活化2h。
四、花青素的纯化：
(1)取一只洁净且干燥的色谱柱，将活化后的硅胶通过漏斗均匀地注入色谱柱中，期间用橡胶锤轻轻地敲击色谱柱柱身，使色谱柱中的硅胶紧致且结实，保持硅胶上表面平整。
(2)色谱柱中注满硅胶后，在色谱柱上端安置分液漏斗一，将乙醇溶液加入分液漏斗一中，打开分液漏斗一下端活塞和色谱柱下端活塞，使乙醇溶液沿色谱柱内壁缓慢流入，并从色谱柱下端缓慢流出，所述乙醇溶液流速和分液漏斗一流速相同；待硅胶中的空气经乙醇溶液排尽后，停止注入乙醇溶液并关闭色谱柱下端活塞，拿开分液漏斗一并保持乙醇溶液高出硅胶顶面1-3mm，此过程中一直保持硅胶上表面平整。
(3)在色谱柱上端安置分液漏斗二，将花青素粗提取液加入分液漏斗二中，打开分液漏斗二下端活塞和色谱柱下端活塞，使花青素粗提取液沿色谱柱内壁均匀缓慢地注入，始终保持硅胶上表面平整，此时花青素吸附到硅胶中；待分液漏斗二中的花青素粗提取液全部流出后，关闭色谱柱下端活塞并拿走分液漏斗二。
(4)在色谱柱上端安置分液漏斗三，将洗脱剂乙醇加入分液漏斗三中，打开分液漏斗三下端活塞和色谱柱下端活塞，加入洗脱剂乙醇，保持乙醇的加入流速和下端流出流速相同，用锥形瓶收集下端收集流出液。
5)对收集的流出液进行减压溶缩，除去流出液中的乙醇后，得到蓝莓花青素。
Claims (6)
1.一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：依次按照以下步骤进行：
一、蓝莓的预处理：
1)取蓝莓干果置于粉碎机中进行粉碎；
2)将粉碎后的蓝莓干粉取出，过50-70目筛；
3)收集过筛后的蓝莓干粉装于洁净的塑料袋中，放置冰箱保存备用；
二、混合酶联合超声粗提：
1)分别取蓝莓干粉和混合酶并按照90-110:1的重量配比混合后加入洁净且干燥的锥形瓶中，所述混合酶包括有纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的重量配比为4:6；
2)向锥型瓶中加入体积分数为40-80％的乙醇溶液搅匀，调节pH＝4-5，密封；其中蓝莓干粉与乙醇溶液的固液比为1:28-32g/mL；
3)将密封后的锥形瓶放入超声波清洗机中，超声波清洗机的温度设定为45-55℃，功率为750-950W，超声时间为20-40min；
4)所述蓝莓干粉经过超声波破壁和减压过滤操作，分离滤渣后去除，得到花青素粗提取液；
三、硅胶层析柱预处理：
1)称量50-70g硅胶置于烧杯中，向烧杯中加入浓盐酸使浓盐酸刚好淹没硅胶面，浸泡9-11h；
2)用蒸馏水洗涤浸泡盐酸后的硅胶，当洗涤的水呈中性后，继续冲洗0.2-0.7h，除尽硅胶上附着的氯离子；
3)晾干除尽氯离子的硅胶，在烘箱中100-120℃的条件下活化1-3h；
四、花青素的纯化：
1)取一只洁净且干燥的色谱柱，将活化后的硅胶通过漏斗均匀地注入色谱柱中，期间用橡胶锤轻轻地敲击色谱柱柱身，使色谱柱中的硅胶紧致且结实，保持硅胶上表面平整；
2)色谱柱中注满硅胶后，在色谱柱上端安置分液漏斗一，将乙醇溶液加入分液漏斗一中，打开分液漏斗一下端活塞和色谱柱下端活塞，使乙醇溶液沿色谱柱内壁缓慢流入，并从色谱柱下端缓慢流出，所述乙醇溶液流速和分液漏斗一流速相同；待硅胶中的空气经乙醇溶液排尽后，停止注入乙醇溶液并关闭色谱柱下端活塞，拿开分液漏斗一并保持乙醇溶液高出硅胶顶面1-3mm，此过程中一直保持硅胶上表面平整；
3)在色谱柱上端安置分液漏斗二，将花青素粗提取液加入分液漏斗二中，打开分液漏斗二下端活塞和色谱柱下端活塞，使花青素粗提取液沿色谱柱内壁均匀缓慢地注入，始终保持硅胶上表面平整，此时花青素吸附到硅胶中；待分液漏斗二中的花青素粗提取液全部流出后，关闭色谱柱下端活塞并拿走分液漏斗二；
4)在色谱柱上端安置分液漏斗三，将洗脱剂乙醇加入分液漏斗三中，打开分液漏斗三下端活塞和色谱柱下端活塞，加入洗脱剂乙醇，保持乙醇的加入流速和下端流出流速相同，用锥形瓶收集下端收集流出液；
5)对收集的流出液进行减压溶缩，除去流出液中的乙醇后，得到蓝莓花青素。
2.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：蓝莓的预处理中，将粉碎后的蓝莓干粉取出，过60目筛。
3.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：混合酶联合超声粗提中：
1)分别取蓝莓干粉和混合酶并按照100:1的重量配比混合后加入洁净且干燥的锥形瓶中，所述混合酶包括有纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的重量配比为4:6；
2)向锥型瓶中加入体积分数为60％的乙醇溶液搅匀，调节pH＝4，密封；其中蓝莓干粉与乙醇溶液的固液比为1:30g/mL；
3)将密封后的锥形瓶放入超声波清洗机中，超声波清洗机的温度设定为50℃，功率为800W，超声时间为30min。
4.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：硅胶层析柱预处理：
1)称量60g硅胶置于烧杯中，向烧杯中加入浓盐酸使浓盐酸刚好淹没硅胶面，浸泡10h；
2)用蒸馏水洗涤硅胶，当洗涤的水呈中性后，继续冲洗0.5h，除尽硅胶上附着的氯离子；
3)晾干硅胶，在烘箱中110℃的条件下活化2h。
5.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：花青素纯化的步骤2)中拿开分液漏斗一并保持乙醇溶液高出硅胶顶面2mm，此过程中一直保持硅胶上表面平整。
6.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法，其特征在于：所述硅胶注入色谱柱的高度为8-10cm。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181102 |