CN108329374B - 一种分离高纯度茶籽皂素单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然化合物的分离纯化制备领域，具体地说是一种分离高纯度茶籽皂素单体的方法，涉及茶籽中6个高纯度五环三萜齐墩果烷型皂素的分离纯化。本发明与现有技术相比本发明的有益效果是：(a)化合物纯度较高，纯度在91‑99％；(b)分离过程简单，能同时得到茶籽中6个主要的单体皂素物质；(c)重复性好，针对性强。
Description
技术领域
本发明涉及天然化合物的分离纯化制备领域，具体地说是一种分离高纯度茶籽皂素单体化合物的方法，涉及茶籽中6个高纯度五环三萜齐墩果烷型皂素的分离纯化。
背景技术：
茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)籽是除了茶叶以外的另一重要茶树资源，其含有丰富的三萜皂素，具有调节肠胃、抗菌消炎、抗肿瘤、保护神经、促进植物吸收、发泡去污等生物活性和功能，在食品、医药、农业、化工等领域具有巨大的应用前景。茶籽中皂素结构极性相近，分离制备纯品单体十分困难。单体纯品的缺乏严重阻碍了茶籽皂素定量检测方法的建立和相关生物活性机理的深入研究，限制了该物质在相关高端行业中的开发和应用。
目前对茶皂素的制备技术，多是针对油茶籽(C.oleifera)或榨取山茶油后的茶籽饼，且是对总皂素(多个皂素混合物)的提取制备方法。对于茶(C.sinensis)籽中的皂素单体分离，目前已有的技术仍然是传统的分离技术，即甲醇或乙醇提取后，用正反向硅胶柱、制备型高效液相色谱(HPLC)多次反复分离制备。其主要缺点是样品消耗量大，分离过程特别是色谱部分操作繁琐，重复性差，盲目性较大，分离效率低。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种茶(Camellia sinensis)籽皂素单体化合物的分离纯化方法，用于制备茶籽中的6个高纯度皂素类化合物Theasaponin B5，Theasaponin E1，Theasaponin E4，Theasaponin G2，Assamsaponin B，Assamsaponin G。
一种分离高纯度茶籽皂素单体的方法，包括如下步骤：
(1)茶籽去壳，烘干过筛，得到茶籽粉末；
(2)在步骤(1)的茶籽粉末加入70％-80％乙醇以1:15-20(w/v)的料液比70-80℃回流提取5-7小时，抽滤收集提取液，45℃真空旋转浓缩得浓缩液；
(3)将步骤(2)浓缩液以1:1(v/v)石油醚萃取两次，收集水相溶液；1:1(v/v)乙酸乙酯萃取两次收集水相溶液；1:1(v/v)正丁醇萃取两次收集正丁醇相；70℃真空旋转浓缩得样品。
(4)将样品上D101大孔树脂柱，静态吸附5-8小时，用20-30％乙醇和60-80％乙醇分别洗脱三个柱体积，收集70％-80％乙醇洗脱部分45℃真空旋转浓缩后冷冻干燥成粉得到总皂素；
(5)步骤(4)中收集到的总皂素在中低压色谱系统中进一步分离：采用C-18制备柱，柱温25℃，检测波长210nm，两次过柱；第一次等梯度洗脱，流动相为50％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)，流速2.0ml/min，洗脱30min；第二次流动相：A相(0.1％甲酸/水)-B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱：0-15min 38％B，15-50min 40％B，流速1.5ml/min，分离得到茶籽皂素单体。
优选的，步骤(1)中茶籽去壳，60℃烘干，籽仁粉碎过20目筛。
优选的，步骤(2)在步骤(1)的茶籽粉末加入70％乙醇以1:15(w/v)的料液比70℃回流提取5小时，抽滤收集提取液，45℃真空旋转浓缩得浓缩液。
优选的，步骤(3)采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取两次，比例各自为1:1，并收集正丁醇相。
优选的，将样品上D101大孔树脂柱，静态吸附6小时，用30％乙醇和70％乙醇分别洗脱三个柱体积，收集70％乙醇洗脱部分45℃真空旋转浓缩后冷冻干燥成粉得到总皂素。
优选的，步骤(5)中，采用C-18柱，第一次等梯度洗脱，流动相为45-55％乙腈水溶液(含0.05-0.2％甲酸)，流速1.5-2.5ml/min；第二次流动相：A相(0.1％甲酸/水)，B相(0.05-0.2％甲酸/乙腈)；梯度洗脱：0-15min 30-38％B，15-50min 40-50％B，流速1.5-2.0ml/min。
一种分离高纯度茶籽皂素单体的方法，具体包括如下步骤：
(1)茶籽去壳，烘干过筛，得到茶籽粉末；
(2)在步骤(1)的茶籽粉末加入70％乙醇以1:15(w/v)的料液比70℃回流提取5小时，抽滤收集提取液，45℃真空旋转浓缩得浓缩液；
(3)将步骤(2)浓缩液以1:1(v/v)石油醚萃取两次，收集水相溶液；1:1(v/v)乙酸乙酯萃取两次收集水相溶液；1:1(v/v)正丁醇萃取两次收集正丁醇相；70℃真空旋转浓缩得样品。
(4)将样品上D101大孔树脂柱，静态吸附6小时，用30％乙醇和70％乙醇分别洗脱三个柱体积，收集70％乙醇洗脱部分45℃真空旋转浓缩后冷冻干燥成粉得到总皂素；
(5)在中低压色谱系统中，采用C-18制备柱，柱温25℃，检测波长210nm，两次过柱。第一次等梯度洗脱，流动相为50％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)，流速2.0ml/min，洗脱30min；第二次流动相：A相(0.1％甲酸/水)-B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱：0-15min 38％B，15-50min 40％B，流速1.5ml/min。
与现有技术相比本发明的有益效果是：(a)化合物纯度较高，纯度在91-99％；(b)分离过程简单，能同时得到茶籽中6个主要的单体皂素物质；(c)重复性好，针对性强。
本申请与现有专利“茶籽粕中综合提取茶籽皂素、茶籽多肽、茶籽多糖的方法”(公开号：CN104177508A)和“一种油茶籽皂素的提取方法”(公开号：CN1188772)相比存在下述不同：
(1)分离原料不同。对比专利中的涉及的籽是油茶(Camellia oleifera)籽，而本专利中是茶(Camellia sinensis)籽，二者在植物学分类上为同属但不同种植物，其中的皂素组成也不相同。
(2)对比专利中的终产物是总皂素(几十种皂素的化合物)，工艺是针对总皂素的制备，并未有单个化合物的分离纯化。而本专利的创新点是分离单体皂素化合物，而非混合物粗品。单体化合物在科学研究等方面具有混合物不可替代的作用。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
(1)采福鼎大白品种茶树茶籽，去壳，在干燥恒温烘箱中60℃烘至恒重，植物粉碎机将籽仁粉碎，过20目筛，收集晒下茶籽粉末。
(2)取1kg茶籽粉，按照1:15(w/v)比例加入70％乙醇，70℃条件下回流提取5小时，趁热抽滤收集提取液，45℃下真空旋转浓缩得浸膏(得率约为13.25％)。
(3)浸膏溶入1L水中，以1:1(v/v)石油醚萃取三次，收集水相溶液；1:1(v/v)乙酸乙酯萃取三次收集水相溶液；1:1(v/v)正丁醇萃取三次收集正丁醇相。70℃下真空旋转浓缩得浸膏(正丁醇相对于粗提物浸膏得率约为11.88％)。
(4)上样量80g，D101大孔树脂柱床体积约2000ml(分离柱内径10cm)，用30％乙醇和70％乙醇分别洗脱三个柱体积，收集70％乙醇洗脱部分，45℃真空旋转浓缩后冷冻干燥成粉(得率约为35.5％)。
(5)采用
Purifier100制备色谱仪(配有UV900检测器、UNICORN5.20工作站)，第一次制备条件为：依利特SinoChrom ODS-Bp(250mm×10.0mm，5μm)制备柱；流动相为A相(0.1％甲酸/水)-B相(0.1％甲酸/乙腈)；采用等梯度洗脱：0-30min 50％B，流速2.0ml/min，室温下洗脱，检测波长210nm。收集相关组分并浓缩。将第一次分离到的各组分进行第二次分离，采用制备柱：Wathers XBridge RP18(250mm×10.0mm，5μm)；流动相：A相(0.1％甲酸/水)-B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱：0-15min 38％B，15-50min 40％B，流速1.0-1.5ml/min，进样量0.5ml，洗脱温度为室温，检测波长210nm。分离得到的6个茶籽皂素单体经UPLC-MS进行分析，Assamsaponin G纯度92％；Theasaponin E1纯度99％；Theasaponin B5纯度96％；Theasaponin G2纯度92％；Assamsaponin B纯度99％，Theasaponin E4纯度91％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一部分具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种分离茶籽皂素单体的方法，包括如下步骤：
（1）茶籽去壳，烘干过筛，得到茶籽粉末；
（2）在步骤（1）的茶籽粉末加入70%乙醇以1:15w/v的料液比70℃回流提取5小时，抽滤收集提取液，45℃真空旋转浓缩得浓缩液；
（3）将步骤（2）浓缩液以1:1v/v石油醚萃取两次，收集水相溶液；1:1v/v乙酸乙酯萃取两次收集水相溶液；1:1v/v正丁醇萃取两次收集正丁醇相；70℃真空旋转浓缩得样品；
（4）将样品上D101大孔树脂柱，静态吸附6小时，用30%乙醇和70%乙醇分别洗脱三个柱体积，收集70%乙醇洗脱部分45℃真空旋转浓缩后冷冻干燥成粉得到总皂素；
（5）步骤（4）中收集到的总皂素在中低压色谱系统中进一步分离：采用C-18制备柱，柱温25℃，检测波长210nm，两次过柱；第一次等梯度洗脱，流动相为50% 乙腈水溶液，乙腈水溶液含0.1%甲酸，流速2.0ml/min，洗脱 30 min；第二次流动相：A相为0.1%甲酸/水- B相为0.1%甲酸/乙腈；梯度洗脱：0-15min 38%B，15-50min 40%B，流速1.5ml/min，分离得到6个皂素类化合物茶皂素B5（Theasaponin B5），茶皂素E1（Theasaponin E1），茶皂素E4（Theasaponin E4），茶皂素G2（Theasaponin G2），阿萨姆茶皂素B(Assamsaponin B），阿萨姆茶皂素G(Assamsaponin G）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中茶籽去壳，60℃烘干，籽仁粉碎过20目筛。
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