CN113817004B - 一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法 - Google Patents
一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法。所述方法包括：将乌药叶与吸附剂混合，并采用基质固相分散萃取法进行洗脱，再经浓缩处理，获得乌药叶浸膏；采用高速逆流色谱法对所述乌药叶浸膏进行一次分离、二次分离处理，从而实现槲皮素‑3‑O‑β‑D‑呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷与槲皮素‑5‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的混合物、槲皮素‑3‑O‑吡喃鼠李糖苷、山奈酚‑7‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖苷的分离，其中所述二次分离处理中采用的第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、拆分剂及水，所述拆分剂包括环糊精。本发明提供的方法使得乌药叶提纯分离的黄酮类成分具有分离周期短、分离效率高、杂质少的优点。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，涉及一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法，尤其涉及一种基于放大基质固相萃取结合高速逆流色谱高效、高回收率提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法。
背景技术
乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm为樟科(Lauraceae)山胡椒属(Lindera)植物，分布于江苏、浙江、台湾、福建、广东等省，以浙江省天台县最为著名，称天台乌药，天台乌药产量占全国乌药产品的30％。药典收录其干燥块根入药。而其茎、叶均在民间使用。其中乌药叶自2012年、2014年被卫计委批准为新资源食品，列入新食品原料目录，其深入研究开发日益受到关注。乌药叶主要含黄酮类化合物，被报道具有抗氧化、降脂、抗菌等药理作用。因此，这些黄酮类成分的分离获取，对于进一步深入研究乌药叶的药效物质基础有着十分重要的作用。
传统的乌药叶中成分的提取分离纯化方法主要通过加热回流法与超声提取法等方法提取目标成分，进而采用柱层析、重结晶、制备液相色谱等方法进行分离纯化。这种分离策略虽然经典，但分离周期长，溶剂量耗费大，操作步骤繁琐，同时，分离过程由于多次使用柱色谱，不可逆吸附严重，回收率一般低于50％，有的甚至不到10％，故部分含量低微的成分难以获取。如乌药叶中槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等对照品在市场上并无销售。因而，开发一种快速、高效、低成本的制备方法对分离纯化乌药叶甚至其他中药中的微量成分的获取及其这些成分的进一步深入研究开发至关重要。
高速逆流色谱法(HSCCC，High-speed countercurrent liquid chromatography)是近年来天然产物分离纯化常用的一种高效连续的液-液分配技术，由于在分离过程中不使用固相载体作为固定相，没有不可逆吸附，具有样品无损失、高效、快速和制备量大等优点。刘云等报道了一种高速逆流色谱法分离乌药叶中的黄酮类成分的方法。该方法采用正己烷-正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水(体积比为2∶2∶5∶1.5∶6)为两相溶剂体系，分离得到了3个单体成分槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷及一对同分异构体槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物(刘云，侴桂新.高速逆流色谱法分离制备乌药叶中的黄酮类成分[J].色谱，2007(05)：735-739.)。本发明在此基础上，探索了新的逆流体系，提出以羟丙基β环糊精作为拆分剂，使同分异构体槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷得到有效分离。此外，传统用于高速逆流分离的样品所采用的提取方法一般为加热回流提取。虽然逆流色谱分离纯化效率高，但提取方法耗时耗力，溶剂消耗量大，有时还需要对粗提物进行繁琐的富集处理，使得整个提取分离纯化流程效率降低。
基质固相分散萃取(MSPD，matrix solid-phase dispersion)是一种新型样品前处理技术，集萃取与纯化为一步，具有溶剂用量少、对环境污染少、萃取时间短、操作简便、提取效率高等优点，已广泛用于食品、环境样品、中药的定量分析中，尚无将其用于化学成分提取分离纯化中的报道。因此开发一种有效提取分离乌药叶中的槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷等成分的方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法，其包括：
将乌药叶与吸附剂混合，并采用基质固相分散萃取法进行洗脱，再经浓缩处理，获得乌药叶浸膏；
采用高速逆流色谱法对所述乌药叶浸膏进行一次分离，从而分别获槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其中所述一次分离处理中采用的第一溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸及水；
以及，采用高速逆流色谱法对所述槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物进行二次分离，从而实现槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的分离，其中所述二次分离处理中采用的第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、拆分剂及水，所述拆分剂包括环糊精。
在一些较为具体的实施方案中，所述第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、羟丙基β环糊精及水，其中所述羟丙基β环糊精与水形成的羟丙基β环糊精水溶液的浓度为0.05mol/L，所述羟丙基β环糊精水溶液为酸性。
本发明实施例还提供了前述方法于中药中活性成分快速提取分离纯化中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用基质固相萃取法与高速逆流色谱法相结合的技术提取与分离中药乌药叶中有效成分；
(2)本发明采用的基质固相萃取法与高速逆流色谱法相结合的技术选用最优的工艺条件，以及采用羟丙基β环糊精作为拆分剂，使得提纯分离的槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷具有分离效果好、杂质少，纯度高；
(3)本发明首次将基质固相萃取与高速逆流色谱法相结合技术用于乌药叶中复杂基质的提取与分离纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中放大基质固相萃取法与高速逆流色谱法相结合的技术工艺流程图；
图2a-图2f是本发明实施例1-5中基质固相分散萃取工艺中不同条件的影响萃取的效果图；
图3是本发明实施例6中乌药叶提取物HPLC色谱图；
图4是本发明实施例6中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物的液相色谱图；
图5a-图5b是本发明实施例6中的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的液相色谱图；
图6a-图6b是本发明实施例6中的第一溶剂体系逆流图、第二溶剂体系逆流图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法包括：
将乌药叶以基质固相分散萃取法提取，即将样品先与吸附剂充分混合均匀，并采用合适溶剂进行洗脱，再经浓缩处理，获得乌药叶浸膏；
采用高速逆流色谱法对所述乌药叶浸膏进行一次分离，从而分别获槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其中所述一次分离处理中采用的第一溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸及水；
以及，采用高速逆流色谱法对所述槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物进行二次分离，从而实现槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的分离，其中所述二次分离处理中采用的第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、拆分剂及水，所述拆分剂包括环糊精。
进一步地，所述环糊精包括羟丙基β环糊精，且不限于此。
在一些优选实施方案中，所述方法具体包括：采用高速逆流色谱法对所述乌药叶浸膏进行一次分离，分别收集时间为105～115min、120～130min、170～185min、270～290min的洗脱液，从而分别获得槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其中所述高速逆流色谱法采用的工艺条件包括：高速逆流色谱转速为800rpm，上相作为固定相，下相作为流动相，固定相的保留值为20％～40％，流动相的流速为2mL/min，分离温度为25℃，紫外检测波长为280nm。
在一些优选实施方案中，所述第一溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇、正已烷、冰醋酸与水的体积比为5∶2∶2∶1.5∶6。
在一些优选实施方案中，所述方法具体包括：采用高速逆流色谱法对所述槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物进行二次分离，分别收集时间为670-710min、740-790min的洗脱液，从而实现槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的分离，其中所述高速逆流色谱法采用的工艺条件包括：高速逆流色谱主机转速为800rpm，上相作为流动相，下相作为固定相，固定相的保留值为25％～50％，流动相的流速为2mL/min，分离温度为5℃，紫外检测波长为254nm。
在一些优选实施方案中，所述第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、羟丙基β环糊精及水，其中所述羟丙基β环糊精与水形成的羟丙基β环糊精水溶液的浓度为0.05mol/L，所述羟丙基β环糊精水溶液为酸性。
进一步地，所述羟丙基β环糊精水溶液的pH为3.16，所述乙酸乙酯、正丁醇、羟丙基β环糊精水溶液的体积比为9∶1∶10。
在一些优选实施方案中，所述乌药叶与吸附剂的质量比为1∶0～2∶1。
进一步地，所述乌药叶与吸附剂的质量比为1∶1。
在一些优选实施方案中，所述吸附剂包括硅胶、氧化铝、弗洛里硅土、分子筛SBA-15中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步地，所述吸附剂为硅胶。
在一些优选实施方案中，所述方法具体包括：
对乌药叶进行干燥、粉碎、过筛处理，并与吸附剂研磨混合，形成乌药叶混合物；
将所述乌药叶混合物置于层析柱中并进行洗脱处理，获得乌药叶洗脱液；
以及，对所述乌药叶洗脱液进行浓缩干燥处理，获得所述乌药叶浸膏。
进一步地，所述过筛处理使用的目数为65目。
进一步地，所述研磨处理的时间为0～6min。
在一些优选实施方案中，所述洗脱处理采用的洗脱剂包括乙醇、70wt％乙醇、甲醇、50wt％甲醇、70wt％甲醇、90wt％甲醇中的任意一种。
进一步地，所述洗脱处理采用的洗脱剂为70wt％乙醇。
进一步地，所述洗脱剂的流速为0.5～3mL/min。
更进一步地，所述洗脱剂的流速为1mL/min。
进一步地，所述洗脱剂的体积为1～6BV。
更进一步地，所述洗脱剂的体积为5BV。
在一些更为优选实施方案中，所述提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法包括：
(1)将乌药叶进行干燥、粉碎，过65目筛得乌药叶粉末。
(2)称取乌药叶粉末与一定质量比的吸附剂于研钵中，研磨一定的时间，将研磨好的固体混合物转移至抽滤层析柱中，并在固体混合物上方铺适量脱脂棉，加入洗脱剂，加压进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。所述吸附剂为硅胶。
(3)将浓缩干后的浸膏通过高速逆流色谱进行分离，分段收集洗脱液。
(4)将收集到的洗脱液分别进HPLC进行检测。
(5)将洗脱液浓缩、结晶获得槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷产品。
进一步地，步骤(2)中所述乌药叶粉末和硅胶的质量比为1∶0～2∶1，优选1∶1。
进一步地，步骤(2)中所述研磨采用研钵研磨0～6min，优选4min。
进一步地，步骤(2)中所述洗脱剂为下列之一：乙醇、70％乙醇、甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇，优选70％乙醇。
进一步地，步骤(2)中所述洗脱剂流速为0.5～3mL/min，优选1mL/min。
进一步地，步骤(2)中所述洗脱剂液体积为1～6BV，优选5BV。
进一步地，步骤(3)中所述高速逆流色谱分离提取乌药叶中槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷的方法，其中高速逆流色谱法采用的第一溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸、水组成；所述乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸与水的体积比为5∶2∶2∶1.5∶6，高速逆流色谱主机转速为800rpm；上相作为固定相，下相作为流动相，固定相保留值为20％-40％，流动相得流速为2mL/min；分离温度为25℃，紫外检测波长为280nm，进样后分别收集时间为105min-115min、120min-130min、170min-185min、270min-290min的洗脱液。其中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷用以上溶剂体系是混合物。
进一步地，本发明将用另一个溶剂体系将槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷分离，即乙酸乙酯、正丁醇和0.05mol/L环糊精水组成的第二溶剂体系，其中乙酸乙酯、正丁醇、0.05mol/L环糊精水体积比为9∶1∶10，高速逆流色谱主机转速为800rpm；上相作为流动相，下相作为固定相，固定相保留值为25％-50％，流动相得流速为2mL/min；分离温度为5℃，紫外检测波长为254nm，进样后分别收集时间为670min-710min与740min-790min的洗脱液。
本发明中，乌药叶提取分离采用的放大基质固相萃取法与高速逆流色谱法相结合的技术工艺流程图如图1所示。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述方法于中药中活性成分快速提取分离纯化中的用途。
本发明将集萃取与纯化为一步的基质分散固相萃取法(MSPD)放大，建立了以硅胶作为吸附剂，首次结合基质固相分散萃取技术和高速逆流色谱技术，以羟丙基β环糊精作为两相溶剂体系的添加剂，来有效提取分离乌药叶中的槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷等成分。其中，放大MSPD作为新型的分离样品提取方法，可大大节省样品的提取时间、提取溶剂，且对热不稳定性成分十分友好。高速逆流色谱纯化方法，可不使用固相载体作为固定相，没有不可逆吸附，大大提高目标成分分离纯化的回收率。该策略不仅为乌药叶中活性成分的提取与分离提供一种更加绿色环保、廉价、快速、简便、高效的新方法，而且为其他中药中活性成分的快速提取分离纯化提供一种有效的策略。
本发明首次提出基质固相萃取提取法和高速逆流分离纯化相结合的策略，用来分离纯化中药/天然药物中成分，优势在于效率高、回收率高；基质固相萃取现有报道仅用来作为样品分析的提取方法，尚无将其作为分离纯化提取方法的报道；两个黄酮类成分同分异构体的HSCCC分离纯化，尚无文献报道。本研究通过在逆流体系中添加拆分剂环糊精，使得难以分离的两个成分成功分离。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
本发明实施例所用硅胶mSiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用C18，购自上海正亚化工有限公司。
本发明实施例中采用的仪器为安捷伦高效液相色谱系统(Agilent 1260InfinityLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)配备真空抽气泵，二元流动相系统，恒温自动进样器，恒温柱温箱。色谱柱Kromasil 100-5C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃。流动相为乙腈(B)和0.1％甲酸水溶液(D)，梯度洗脱：0min，10％B，15min，15％B，23min，23％B，40min，29％B，41min，70％B，43min，100％B，46min，100％B；运行时间为46min；进样量：10μL，流速：1mL/min，检测波长：280nm。
本发明实施案例中高速逆流色谱仪(HSCCC)是TBE-200V J型高速逆流色谱仪(上海Tauto Biotechnique，中国上海)。逆流色谱系统由三个多层线圈，MP-0106恒流泵，21C-B紫外线检测器和SDC-6恒温控制器组成，由BSZ-160自动成分收集器和SEPU3010组成工作站。初始分离柱由总体积为190mL的1.6mm ID PTFE管组成。该柱的β值从0.45变化到0.81。
实施例1：吸附剂种类的选择
平行称取4份乌药叶粉末30mg分别加入到4组玛瑙研钵中，并称取30mg不同吸附剂(Florida Sillica(宁波鸿谱仪器科技有限公司)、分子筛SBA-15(南京吉仓纳米科技有限公司)、Al2O3(上海安谱实验科技有限公司)、Sillica gel(上海安谱实验科技有限公司)，分别加入4组研钵中与乌药叶粉末研磨3min。将研磨好的固体混合物过基质固相小柱(加垫片)，加入2mL的70％乙醇进行加压洗脱，收集洗脱液，并浓缩，最后加入1mL的甲醇溶解，在13000rpm的转速下用离心机离心5min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
在MSPD的吸附过程中，吸附剂是影响提取效率的中药因素，不仅可以作为固体载体而且还起到吸附分离目标化合物的作用。本实验考察了Florida Sillica与传统吸附剂分子筛SBA-15、中性Al2O3、硅胶对乌药叶中槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷提取效率的影响，结果如图2a所示。结果显示硅胶对目标分析物的提取效率高于子筛SBA-15、Al2O3、Florida Sillica，因此选用硅胶为吸附剂。
实施例2：样品与吸附剂的质量比的选择
平行称取4份乌药叶粉末30mg分别加入到4组玛瑙研钵中，并称取不同质量(0mg、15mg、30mg、60mg)的硅胶，分别加入4组研钵中与乌药叶粉末研磨3min。将研磨好的固体混合物过基质固相小柱(加垫片)，加入2mL的70％乙醇进行加压洗脱，收集洗脱液，并浓缩，最后加入1mL的甲醇溶解，在13000rpm的转速下用离心机离心5min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
不同样品与吸附剂的质量比的萃取效果如图2b所示，结果表明，当样品与吸附剂的质量比从1∶0升到1∶1时，目标分析物的提取效率逐渐提高。而当质量比提高到1∶2时，提取效果则开始下降，因此选用1∶1作为样品与吸附剂质量比。
实施例3：洗脱溶剂种类选择
平行称取6份乌药叶粉末30mg与6份30mg硅胶分别加入到2组玛瑙研钵中，并分别研磨3min。将研磨好的固体混合物过基质固相小柱(加垫片)，加入2mL的乙醇、70％乙醇、甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇，优选70％乙醇洗脱剂，加压进行洗脱，收集洗脱液，并浓缩，最后加入1mL的70％甲醇溶解，在13000rpm的转速下用离心机离心5min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
不同洗脱溶剂种类的萃取效果如图2c所示，结果表明，70％乙醇作为洗脱溶剂对三种分析物的洗脱效率高于甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、乙醇，优选70％乙醇，故再进一步研究中选择了70％乙醇作为洗脱液。
实施例4：吸附动力学试验
平行称取4份乌药叶粉末5g与4份5g硅胶分别加入到4组玛瑙研钵中，并分别研磨不同的时间(0min、2min、4min、6min)。然后，将研磨好的固体混合物转移至抽滤层析柱中并在固体混合物下方、上方铺适量脱脂棉，加入125mL的70％乙醇洗脱剂，加压进行洗脱，收集洗脱液，并浓缩，最后加入150mL的70％甲醇溶解，在13000rpm的转速下用离心机离心4min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
不同研磨时间的萃取效果如图2d所示，结果表明，随着研磨时间的增加萃取效果增强，增至最优值4min后，当研磨时间延长至6min时，提取效果反而下降。这可能是由于研磨时间过长导致活性成分被过度提取而被挤压到吸附剂中致密的孔内，增加了洗脱的难度，从而使提取效果下降。
实施例5：动力学测试(洗脱速度与洗脱剂体积的选择)
(1)洗脱速度的选择
平行称取6份乌药叶粉末5g与6份5g硅胶分别加入到6组玛瑙研钵中，并分别研磨4min。然后，将研磨好的固体混合物转移至抽滤层析柱中并在固体混合物上方铺适量脱脂棉，加入150mL的70％乙醇洗脱剂分别以流速(0.5mL/min、21mL/min、2mL/min、3mL/min)对填装好的层析柱进行洗脱，加压进行洗脱，收集洗脱液，并浓缩，最后加入150mL的甲醇溶解，在13000rpm的转速下用离心机离心5min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
洗脱剂不同速度提取效果如图2e所示，当洗脱剂体积从1mL/min逐渐增加到6mL/min时，目标分析物的提取效率都没有流速1mL/min的效果好，故再进一步研究中选择了1mL/min作为洗脱速度。
(2)洗脱体积的选择
称取乌药叶粉末5g与5g硅胶加入到玛瑙研钵中，并研磨4min。然后，将得到的均匀固体混合物小心地转移抽滤层析柱中，并在固体混合物下方、上方铺适量脱脂棉，加入150mL的70％乙醇洗脱速度的流速1mL/min对填装好的层析柱进行洗脱，以每个柱体积25mL收集一管，共收集6管(1BV、2BV、3BV、4BV、5BV、6BV)，将6管洗脱液分别浓缩后分别加入15mL的甲醇溶解，最后，在13000rpm的转速下用离心机离心5min，收集离心得到上清液，取上清液装入样品瓶，用高效液相色谱仪进行检测分析。
不同洗脱剂体积对种类的提取效果如图2f所示，当洗脱剂体积从1BV逐渐增加到6BV时，目标分析物的提取效率逐渐提高，但当体积增加至6BV时，目标组分洗脱效率达到最大值。说明洗脱剂体积6BV能够较大程度把硅胶上的活性成分洗脱下来而溶剂体积又不至于太大。
实施例6：高速逆流色谱纯化
高速逆流色谱法采用第一溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸、水组成；其中乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸、水体积比为5∶2∶2∶1.5∶6，将有机相和水相放入分液漏斗中混匀，并在室温下彻底平衡15～30min，上、下层分别放在两个锥形瓶中，上相为固定相，下相为流动相。各取5mL上相与下相，称取乌药叶的浸膏287mg溶解在两项溶剂中，高速逆流色谱主机转速为800rpm；上相作为固定相，下相作为流动相，固定相保留值为40％左右，流动相得流速为2mL/min；分离温度为25℃，紫外检测波长为280nm，进样后分别收集时间为105min-115min、120min-130min、170min-185min、270min-290min的洗脱液，从而分别获得槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷用以上溶剂体系是混合物10mg；
乌药叶提取物HPLC色谱图如图3所示；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物的液相色谱图如图4所示；
本发明将用第二溶剂体系将槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷分离，即乙酸乙酯、正丁醇和0.05mol/L环糊精水溶液组成的溶剂体系，其中乙酸乙酯、正丁醇、0.05mol/L环糊精水溶液的体积比为9∶1∶10，高速逆流色谱主机转速为800rpm；上相作为流动相，下相作为固定相，固定相保留值为47％，流动相得流速为2mL/min；分离温度为5℃，紫外检测波长为254nm，进样后分别收集时间为670min-710min与740min-790min的洗脱液。得到化合物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷液相色谱图分别如图5a-图5b所示。结果显示，所获得的黄酮类化合物的回收率可达80％以上，大大高于传统分离纯化的回收率。
本实施例中第一溶剂体系逆流图、第二溶剂体系逆流图分别如6a-图6b所示。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法，其特征在于包括：
将乌药叶与吸附剂混合均匀，采用基质固相分散萃取法提取，经洗脱、浓缩处理，获得乌药叶浸膏；
采用高速逆流色谱法对所述乌药叶浸膏进行一次分离，分别收集时间为105~115min、120~130min、170~185min、270~290min的洗脱液，从而分别获得槲皮素-3-O-β-D-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物、槲皮素-3-O-吡喃鼠李糖苷、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其中，所述高速逆流色谱法采用的工艺条件包括：高速逆流色谱转速为800rpm，上相作为固定相，下相作为流动相，流动相的流速为2mL/min，分离温度为25℃，紫外检测波长为280nm；所述一次分离处理中采用的第一溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸及水；所述第一溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、冰醋酸与水的体积比为5:2:2:1.5:6；
以及，采用高速逆流色谱法对所述槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的混合物进行二次分离，分别收集时间为670~710min、740~790min的洗脱液，从而实现槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷与槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷的分离，其中，所述高速逆流色谱法采用的工艺条件包括：高速逆流色谱主机转速为800rpm，上相作为流动相，下相作为固定相，流动相的流速为2mL/min，分离温度为5℃，紫外检测波长为254nm；所述二次分离处理中采用的第二溶剂体系包括乙酸乙酯、正丁醇、拆分剂及水，所述拆分剂为羟丙基β环糊精，所述羟丙基β环糊精与水形成的羟丙基β环糊精水溶液的浓度为0.05mol/L，所述羟丙基β环糊精水溶液为酸性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乌药叶与吸附剂的质量比为1:0~2:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乌药叶与吸附剂的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述吸附剂为硅胶、氧化铝、弗洛里硅土、分子筛SBA-15中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述吸附剂为硅胶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体包括：
对乌药叶进行干燥、粉碎、过筛处理，并与吸附剂研磨混合，形成乌药叶混合物；
将所述乌药叶混合物置于层析柱中并进行洗脱处理，获得乌药叶洗脱液；
以及，对所述乌药叶洗脱液进行浓缩干燥处理，获得所述乌药叶浸膏。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述研磨处理的时间为0~6min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述洗脱处理采用的洗脱剂为乙醇和/或甲醇；所述洗脱剂的流速为0.5~3mL/min；所述洗脱剂的体积为1~6BV。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述洗脱处理采用的洗脱剂为70wt%乙醇；所述洗脱剂的流速为1mL/min；所述洗脱剂的体积为5BV。
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