CN109718574B

CN109718574B - 一种定向快速富集中药尤其桑叶中目标成分的方法

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Publication number: CN109718574B
Application number: CN201811536664.4A
Authority: CN
Inventors: 郭威; 曲永胜; 邹文; 王亮
Original assignee: Shandong Academy of Chinese Medicine
Current assignee: Shandong Academy of Chinese Medicine
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN109718574A

Abstract

本发明提供了一种富集中药目标成分的方法，其特征在于，将目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于0.2‑5，先进行下相萃取上相多次，再上相萃取下相多次。更具体的涉及定向快速富集桑叶中目标成分的方法，将桑叶粗提后的样品采用正己烷‑乙酸乙酯‑甲醇‑水溶剂体系进行下相萃取、上相反萃，完成目标成分的定向快速富集。通过本发明的方法实现目标成分的定向快速富集和大部分杂质的去除，该方法不同于以往的液液萃取，可实现目标成分的大量定向快速富集，大大减少目标成分的损失，并除去大部分杂质。

Description

一种定向快速富集中药尤其桑叶中目标成分的方法

技术领域

本发明属于植物成分提取，尤其是中药中的目标成分提取领域，更具体涉及富集桑叶中目标成分的方法。

背景技术

中药成分复杂，尤其是微量成分，为了进一步的分析或分离，通常需要对样品进行进一步的浓缩富集处理，以提高目标成分的含量。

目前，样品富集常用的方法主要有溶剂萃取法，色谱法，固相萃取法等。溶剂萃取法一般采用甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、正己烷等有机试剂进行提取或萃取，处理样品量较大，但是对目标成分缺乏专属性，最终样品中含有大量其他杂质，一般随后会结合色谱法进行进一步切分和富集，效率低效果差。

传统的色谱法富集技术如大孔树脂、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等方法，通常存在分离效率低、周期长、重现性差、溶剂耗费高、样品死吸附、填料昂贵、小微量成分易丢失等缺点，而且色谱法处理的样品量取决于色谱柱的容量，实验室中一般可达到百克级，最终富集的产品一般可达毫克级，为了获得更多样品需要多次进行色谱富集，时间、人力、试剂成本极高。

固相萃取法本质属于色谱法，是近年发展的较新的快速富集技术，具有快速、高选择性、低溶剂耗费、效率高等优点，多用于生物样品、食品药品等中的农药残留等痕量或微量成分的富集分析，处理的样品量较低，一般在微克级至毫克级。

桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶，初霜后采收，除去杂质，晒干。用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤眼花等病症，为中医临床常用中药。桑叶中成分复杂，主要含有黄酮类、生物碱类、多糖类、氨基酸类、有机酸类、甾体类、挥发油和钙、铁、锰、锌等微量元素。现代研究发现，桑叶具有多种生物活性如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖、减肥及皮肤美白等功效，作用非常多样化。因此，研发富集桑叶目标成分，以用于进一步提取具有重要意义。

发明内容

中药成分极为复杂，分离纯化单体化合物最主要的限速步骤在于分离之前的前处理——富集，故对目标成分的富集是十分重要的步骤，可为后续研究提供更好的基础，而本发明的目的在于探索一种比以往富集方法更加快速、简便、处理样品量更大的定向处理方法，用于中药复杂基质中目标成分的大量定向快速富集。所述目标成分可以是已知成分，也可以是今后进一步研究的对象，本发明方法可以根据检测到的色谱峰进行定量，之后就可以根据峰面积计算分配比，并不必须要求事先知道成分具体是什么。

本发明的技术原理是发明人经过研究分析提出。假设一样品存在三组成分（每个组分由一个或多个化合物组成）：杂质1，目标成分A，杂质2，其在反相色谱中保留时间如图1，在两相体系中的分配系数分别为K ₁ 、K _A 、K ₂，则三组成分的极性由大到小顺序为：杂质1>目标成分A>杂质2，三组成分K值大小顺序为：K ₁ <K _A <K ₂。

分配系数

（1）

（V_上、V_下分别为为上相下相的体积，C_上、C_下分别为为上相下相中成分的浓度）

当上下相体积相同时，有：

K=C_上/C_下 (2)

用等体积上相多次萃取下相时，对于化合物A，上下相分配时，上相中A的富集率为：

M_A=（C_上/（C_上+C_下））×100%

代入公式（2）得

M_A=(1/(1+1/K _A))×100% （3）

此时，K_A值越大，A的富集率越高，但是同时杂质2也被萃取到上相。

用等体积下相多次萃取上相时，对于化合物A，上下相分配时，上相中A的富集率为：

M_A=（C_下/（C_上+C_下））×100%

代入公式（2）得

M_A=(1/(1+K _A)) ×100% （4）

此时，K _A值越小，A的富集率越高，但是同时杂质1也被萃取到下相。

由公式（3）（4）可推知，为实现目标成分A的富集，同时杂质1和杂质2尽量少，K _A值需要一个合理区间，且K ₁ 、K ₂与K _A的差异足够大。在满足此前提下，可以通过上相萃取下相富集A到上相，同时除去K值较小的杂质1，然后通过下相萃取上相富集A到下相，同时除去K值较大的杂质2。

上相萃取下相时的富集率-K-萃取次数之间的关系为：

100%

100% (5)

公式（5）函数曲线为：

由图2可知，当上相萃取下相时，K=0.2，萃取次数n=5时，富集率可达60%，当K>0.2时，相同的萃取次数富集率更高。为了更高的富集率可适当增加萃取次数或者增加K值。

下相萃取上相时的富集率-K-萃取次数m之间的关系为：

100%

100% (6)

公式（6）函数曲线为：

由图2可知，当上相萃取下相时，K=0.2，萃取次数n=5时，富集率可达59.8%，当K>0.2时，相同的萃取次数富集率更高。为了更高的富集率可适当增加萃取次数或者增加K值。

由图3可知，当下相萃取上相时，K=5，萃取次数m=5时，富集率可达59.8%，当K<5时，相同的萃取次数富集率更高，为了更高的富集率可适当增加萃取次数或者减小K值。

由此可得对于一个化合物群的富集，其组成化合物的K值分布较为合理范围为0.2<K<5，萃取次数5次，此时富集率可达59.8%。实际情况可结合图2和图3，根据K值分布的实际情况，分别确定萃取次数n和m。

目标成分的最终富集率与K值的关系为：

=

100%

代入公式（2）：

=

100% （7）

当n=m=5时，其函数曲线为：

由富集率-K函数曲线可知，当K值为1时，即目标成分A在上相和下相浓度相同时，提取率最高，当K<1时，由于上相萃下相效率下降，K>1时，由于下相萃上相效率下降，使最终的富集率下降。因此K=1时为本发明理论上的最佳平衡点，当K=1，萃取次数为5时，即可实现目标成分的高度富集，可达93.85%，由于杂质1的K值较小，当上相萃下相时效率较低，杂质2的K值较大，当下相萃上相时相率较低，从而使杂质1和杂质2大部分可以除去。

经计算，0.2<K<5为目标成分富集的合理K值范围，可使富集率达到59.8%，当对多目标进行富集时可参考此范围进行富集，当富集单一化合物时，推荐K值接近1时效果最好。

其中，目标成分不同所使用的两相溶剂体系不同，比如溶剂比例和/或组成溶剂。已知的关于逆流色谱分离的文献，报道了不同成分所适用的两相溶剂体系。但这些文献的目的是用于分离，并非本发明所进行的定向富集。即两者有本质区别，但其所用的两相体系本身可适用于本发明的方法中。因此，本发明的要点在于：调整目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于合适范围，则所用的两相体系与其溶剂构成无直接关系，具体来说是将目标成分在两相体系中的分配比为0.2-5之间，优选为0.3-5即可适用。通过这种溶剂体系，再经过多次萃取，即可实现目标成分的定向快速富集和大部分杂质的去除，该方法不同于以往的液液萃取，可实现目标成分的大量定向快速富集，大大减少了目标成分的损失。一种富集中药目标成分的方法，其特征在于，将目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于0.2-5，优选为0.3-5，先进行下相萃取上相多次，再上相萃取下相多次，或者先进行上相萃取下相多次，再下相萃取上相多次。上述萃取顺序对不同中药都适用，但可以根据不同的中药采用更佳的顺序。

在本发明中，优选地，将目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于0.2-5，先进行下相萃取上相多次，再上相萃取下相多次。比如，对于一种富集桑叶的目标成分的方法，其特征在于，将目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于0.2-5，优选为0.3-5，先进行下相萃取上相多次，再上相萃取下相多次。其中，优选地，所述次数中的一种或多种为3-8次，优选为4-6次，最优选为5次。

进一步地，目前的液液萃取多为二元溶剂组成的两相溶剂体系，一般为水和一种与水不互溶的有机相，有机相通常为正己烷、石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂，选择范围窄，分配系数不能根据目标化合物的性质进行定向调节。本发明采用四元溶剂体系，通过调节四元溶剂体系的种类和比例，根据目标化合物的理化性质，进行了四元溶剂体系的选择和考察，建立了适合桑叶中目标成分的快速定向富集方法。

本发明的具体涉及桑叶的技术方案为：一种定向快速富集桑叶中目标成分的方法，其特征在于包括如下步骤：

将桑叶粗提后的样品采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系的下相溶解浸膏，加入优选为同体积的上相混匀，静置，取出下相，再加入下相萃取，优选为萃取三至八次，优先四至六次，最优选为五次，合并下相，蒸干后加入用下相溶解后，加入上相，混匀，静置，取出上相，优选为萃取3至8次，优先4至6次，最优选为5次，合并上相，蒸干即得富集后的目标成分。

优选地，桑叶粗提可采用超声提取法、加热回流提取法等常规方法，其中以超声提取为佳，例如在桑叶样品中加入甲醇，超声提取三次，每次的过滤液合并，进一步地对其进行蒸干得浸膏备用。

优选地，所述溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的配比为0.6~1：1~1.2：1：1，更优选地为0.8：1：1：1。

本发明本质属于液液萃取法，相对于传统方法提高了专属性和选择性，通过调整两相溶剂系统的溶剂组成，使目标成分在两相体系中的分配比处于0.2-5，优选为0.3-5，即可通过多次下相萃取、上相反萃，完成目标成分的定向快速富集，本方法所用两相溶剂体系一经确定，在富集过程中不再需要更换溶剂，处理的样品量取决于液体容器的大小，门槛低、效率高、效果好。本方法具有定向、快速的特点，适用于中药及天然药物中目标成分的富集，富集效率高、样品处理量大、可根据目标化合物的理化性质，进行定向调节、操作简单、方便、不需要昂贵的试剂和设备。具体到桑叶中目标成分的富集而言，根据本发明筛选的溶剂体系，效果十分显著，实验表明富集后样品目标成分的百分含量高达为74.33%，目标成分损失非常小，并且为后续目标成分的分离与分析去除了干扰杂质。

附图说明

图1原理样品反相色谱图

图2 上相萃取下相时的富集率-K-萃取次数n之间的关系

图3 下相萃取上相时的富集率-K-萃取次数m之间的关系

图4 n=m=5时的最终富集率-K函数曲线

图5 初始样品的色谱图

图6 去除目标成分后样品的色谱图

图7 最终富集后产品的色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1

1 样品提取方法

称取桑叶40 g，加入1000 mL甲醇超声（200 W，40 kHz）30 min，提取三次，过滤，合并滤液，蒸干，得浸膏5.25 g。

2 桑叶指纹图谱的建立与分析

2.1 色谱条件

采用Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；检测波长320 nm；速1.0mL·min^-1；柱温30 ℃；进样量10 μL，流动相为0.3%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱，B相比例随时间变化：0～20min，10%～70%；20～28min，70%；28～30min，70%～100%；30～35min，100%。

2.2 指纹图谱的分析

20min之前的主要色谱峰的质谱信息已有文献报道[1]沈小月,宋敏,杭太俊.LC-MS法鉴定桑叶中生物碱类成分[J].药物分析杂志,2016,36(10):1737-1744. [2]赵安琦,李博,张慧荣,李丽.应用电喷雾质谱技术分析鉴定桑叶中黄酮类化合物[J].分子科学学报,2014,30(04):293-298.，因此，可通过质谱分析对其代表的化合物进行指认，但20min后的1-5号峰无相关的文献报道，不能通过质谱指认，必须通过分离纯化得到峰1-5的单体，才能确认其所代表的化合物，因此峰1-5为所要富集的目标成分。

3 富集方法研究

3.1 溶剂体系的研究

对正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5）、乙酸乙酯-甲醇-水（2：1：3）、正己烷-正丁醇-乙酸-水（0.6：3：0.5：4）、甲基叔丁基醚-甲醇-水-冰醋酸（3：1：3：0.1）、氯仿-正丁醇-水-冰醋酸（4：1：2：0.05）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1：1：1：1）等溶剂体系进行了考察，在正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5）、乙酸乙酯-甲醇-水（2：1：3）、正己烷-正丁醇-乙酸-水（0.6：3：0.5：4）、甲基叔丁基醚-甲醇-水-冰醋酸（3：1：3：0.1）溶剂体系中，目标成分均集中在上相，氯仿-正丁醇-水-冰醋酸（4：1：2：0.05）体系中，目标成分均集中在下相，只有正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1：1：1：1）体系中，上下相均有分布。因此，对正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系的比例进行了考察，各比例的分配比见表1。当比例为0.8：1：1：1时，目标成分的K值为0.45-2.24，故最终选择体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8：1：1：1）。

表1 K值

3.2 最优溶剂体系萃取方法

根据上述结果，配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8：1：1：1），取上、下相各70mL，溶解浸膏，混匀，静置，取出下相，再加入下相70 mL，萃取五次，合并下相，蒸干后加入70mL下相溶解，加入上相萃取五次，合并上相，蒸干即得富集后的目标成分。

4 结果

根据上述3.2的方法获得如图5、图6、图7所示的实验结果。其中初始样品、去除目标成分后样品以及最终富集后产品的色谱图分别见图5、图6、图7，目标成分为峰1-5。初始样品中目标成分的百分含量17.21%，富集后样品目标成分的百分含量高达为74.33%，含量提高了51.09%，去除目标成分后的样品基本无目标成分，目标成分损失很小。并且富集后的样品溶液由原来的墨绿色变为淡黄色，除去了桑叶中的大部分叶绿素，为后续目标成分的分离与分析去除了干扰杂质。

Claims

1.一种富集桑叶目标成分的方法，其特征在于，将目标成分在两相溶剂体系中的分配比处于0.2-5，具体为：将桑叶粗提后的样品采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系的下相溶解浸膏，加入同体积的上相混匀，静置，取出下相，再加入下相萃取，重复萃取三至八次，合并下相，蒸干后加入等体积下相和上相溶解，混匀，静置，取出上相，重复萃取三至八次，合并上相，蒸干即得富集后的目标成分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述萃取次数为4-6次。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述萃取次数为5次。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：桑叶粗提采用超声提取法、加热回流提取法。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：桑叶粗提采用超声提取法。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述超声提取是在桑叶样品中加入甲醇，超声提取三次，过滤，合并滤液，进一步地对其进行蒸干得浸膏备用。

7.如权利要求1所述的定向快速富集桑叶中目标成分的方法，其特征在于：所述正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂体系配比为0.6~1：1~1.2：1：1。

8.如权利要求7所述的定向快速富集桑叶中目标成分的方法，其特征在于：所述正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂体系配比为0.8：1：1：1。