CN102285954B - 从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，依次包括以下步骤：1)将杨梅果渣用pH 1.0～2.0的酸性水溶液提取后，过滤，得滤液；2)将滤液用大孔吸附树脂吸附，得吸附后大孔吸附树脂；3)用质量比为75～95％的乙醇水溶液洗脱吸附后大孔吸附树脂，收集洗脱液；将洗脱液浓缩后，得提取物；4)将提取物进行柱层析分离，用洗脱剂进行洗脱，收集含有表儿茶素的组分进行结晶，制得粗结晶；5)将粗结晶用结晶液进行重结晶，得表儿茶素。采用本发明的方法从杨梅果渣中提取表儿茶素，具有工艺步骤简单易行、回收率高的特点。
Description
技术领域
本发明属于植物中有效成分的提取方法；具体地说，涉及一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法。
背景技术
杨梅(Myrica rubra)为杨梅科杨梅属植物，是我国南方的特色水果，目前分布的省份有浙江、江苏、云南、贵州、福建、广东、湖南、广西、江西、四川、安徽、台湾等，目前全国杨梅栽培面积约500余万亩，产量达100万吨以上，杨梅果品加工量约占总量的40％，其中一部分是用于加工制作杨梅酒和饮料，在制作杨梅酒和饮料的过程中，杨梅榨汁后能产生约20％杨梅果渣，但除有报道杨梅果渣可加工成果酱外(方忠祥等.一种利用杨梅渣制备杨梅果酱的方法.中华人民共和国专利，专利公开号：CN101161098)，当前杨梅果渣均没有被充分利用而大部分直接被废弃，既浪费资源又污染环境。因此，充分利用杨梅果渣资源不仅具有良好的经济效益还具有社会效益。
表儿茶素在植物中的分布非常广泛，具有抗氧化、抗癌和抗炎等多种生物活性，已在食品添加剂、医药、日用化工等领域大量应用，其结构式为：
Suzana C.Santos等报道从杨梅同属植物香杨梅(M. gale)的地上部分能分离得到表儿茶素(Suzana C.Santosa等，Condensed tannins from Myrica gale.Fitoterapia，2000，71610-612)，但文献未报道具体的提取分离方法。戴宏芬等采用高效液相色谱法测试表明杨梅果肉中含有一定量表儿茶素(戴宏芬等.黄皮和杨梅果肉中绿原酸、表儿茶素及芦丁含量的测定.华中农业大学学报，2008，27(3)：445～449)，但文献也未报道具体的提取分离方法。张嫩玲等报道了采用乙醇回流法从毛叶合欢中提取表儿茶素的方法(张嫩玲等.毛叶合欢的化学成分.中草药，2010，41(7)：1075-1078)。上述文献虽报道杨梅果肉及杨梅同属植物香杨梅中均有表儿茶素，但至今未见有从杨梅果渣中提取和分离表儿茶素的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺步骤简单易行、回收率高的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，依次包括以下步骤：
1)、将杨梅果渣用pH 1.0～2.0的酸性水溶液提取后，过滤，得滤液；
2)、将滤液用大孔吸附树脂吸附，得吸附后大孔吸附树脂；
3)、用质量比为75～95％的乙醇水溶液洗脱吸附后大孔吸附树脂，收集洗脱液；将洗脱液浓缩后，得提取物；
4)、将提取物进行柱层析分离，用洗脱剂进行洗脱，收集含有表儿茶素的组分进行结晶，制得粗结晶；
5)、将粗结晶用结晶液进行重结晶，得表儿茶素。
作为本发明的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法的改进：将步骤2)所得吸附后大孔吸附树脂先用清水洗脱(目的是为了去除未被大孔吸附树脂所吸附的糖类等杂质)；然后再进行步骤3)的洗脱。
作为本发明的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法的进一步改进：大孔吸附树脂为LX-68、XDA-1或XDA-7。
作为本发明的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法的进一步改进：
步骤1)中：杨梅果渣与酸性水溶液的质量/体积比为：1kg杨梅果渣/10～12L酸性水溶液；酸为盐酸、柠檬酸或乳酸；提取时间为3～5小时，提取温度为室温。
步骤2)中：滤液的流速为每小时2～4倍的大孔吸附树脂体积，大孔吸附树脂对滤液的处理量是大孔吸附树脂的4～6体积倍。
步骤3)中：乙醇水溶液流量为每小时2～4倍的大孔吸附树脂的体积，乙醇水溶液的用量是大孔吸附树脂的2～4体积倍。
步骤4)为：将提取物用强极性溶剂溶解，得溶解物；再将溶解物用100目～200目硅胶拌样，置于40～60℃烘箱中烘干，经200目～300目硅胶柱层析，用洗脱剂洗脱；经TLC法紫外灯下跟踪检测，收集含有表儿茶素的馏分，进行结晶，制得粗结晶。强极性溶剂为甲醇或乙醇，洗脱剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水中的至少一种。
步骤5)中：结晶液为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和石油醚中的至少一种。
在本发明的步骤3)中，可将洗脱液用旋转蒸发浓缩后，获得提取物B。
采用本发明方法提取而得的表儿茶素的结构鉴定如下：
白色针状结晶(甲醇)，HR-ESI-MS：m/z 313.0684[M+Na]+，calculated for C15H14O6Na313.0688；1H NMR(400MHz，DMSO)：δ4.74(1H，s，H-2)，4.00(1H，s，H-3)，2.48(1H，dd，J＝16.4，3.1，H-4A)，2.68(1H，dd，J＝16.4，4.4，H-4B)，5.72(1H，d，J＝2.1，H-6)，5.90(1H，d，J＝2.1，H-8)，6.89(1H，d，J＝2.0，H-2′)，6.65(1H，d，J＝8.0，H-5′)，6.66(1H，dd，J＝8.2，2.0，H-6′)，，9.11(1H，s，-OH)，8.91(1H，s)，8.81(1H，s，-OH)，8.72(1H，s，-OH)，4.65(1H，s，3-OH)；13C NMR(100MHz，DMSO)：78.5(C-2)，65.4(C-3)，28.7(C-4)，99.0(C-4a)，156.7(C-5)，95.5(C-6)，156.2(C-7)，94.6(C-8)，156.2(C-8a)，131.1(C-1′)，115.2(C-2′)，145.0(C-3′)，144.9(C-4′)，115.2(C-5′)，118.4(C-6′)。其波谱数据与文献(《Food Research International》2006，39，864-870)报道的表儿茶素(-)-epicatechin一致。
本发明提取表儿茶素所用的原料是杨梅果品加工企业生产中的副产品-杨梅果渣，这不仅把原来企业废弃的物质得以利用，而且避免了它们对环境的污染；另外，本发明从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法所采用的设备简单，即所用的是常规的大孔树脂和柱层析，不需要高压色谱仪和超临界流体萃取仪等昂贵的仪器；本发明提取用的溶剂是酸性水，不用有机溶剂，成本低廉；本发明采用的大孔树脂具有去粗存精作用，产品回收率高且产品纯度大于99％，宜于规模化推广使用。
具体实施方式
以下实施例中所用到的杨梅果渣均为杨梅榨汁后产生的，其含水率约为80％。所选用的大孔吸附树脂为LX-68、XDA-1或XDA-7，可购自西安蓝晓科技有限公司。
实施例1、一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，依次进行以下步骤：
1)、取杨梅果渣1公斤，加入pH1的盐酸水溶液10升，室温下浸泡4h，纱布过滤得滤液，滤渣再用pH1的盐酸水溶液(10升)重复提取3次，合并4次所得的滤液；得总滤液。
2)、将总滤液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂选用LX-68大孔吸附树脂，得吸附后大孔吸附树脂；总滤液的流速为每小时3倍的大孔吸附树脂体积，大孔吸附树脂对总滤液的处理量是大孔吸附树脂的5体积倍。
将上述吸附后大孔吸附树脂先用清水洗脱(清水的总量为大孔吸附树脂体积的2倍，清水的流速为每小时2倍的大孔吸附树脂体积)，以去除未被大孔吸附树脂所吸附的糖类等杂质；然后再进行步骤3)的洗脱。
3)、用质量比95％乙醇水溶液洗脱步骤2)所得的大孔吸附树脂；乙醇水溶液流量为每小时3倍的大孔吸附树脂的体积，乙醇水溶液的用量是大孔吸附树脂的3倍。收集洗脱液，将洗脱液经浓缩(50转/分钟的转速和46℃的温度下旋转蒸发浓缩)、真空(0.1MPa)干燥(46℃干燥2小时)后，得到红色素8g。
4)、将上述步骤3)所得的8g红色素进行柱层析分离，采用硅胶(200目～300目)作为固定相，流动相为二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，具体如下：
将8g红色素用适量甲醇溶解(甲醇的用量只需能溶解8g红色素即可)，得溶解物；再将溶解物用100目～200目硅胶(8g)拌样，置于50度烘箱中烘干(至恒重)，经200目～300目硅胶柱(100g)层析，用二氯甲烷/甲醇的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱；二氯甲烷-甲醇的梯度设置规则如下：二氯甲烷/甲醇100∶4(体积比)400ml；二氯甲烷/甲醇100∶8(体积比)800ml；二氯甲烷/甲醇100∶16(体积比)800ml。
分段回收(每100ml收集一瓶，共收集20瓶)，经簿层层析板(TLC)紫外灯下跟踪检测；其中第5-12瓶为主要成份，合并后浓缩(50转/分钟的转速和46℃的温度下旋转蒸发浓缩)，得到富含表儿茶素的组分，将该组分先用少量的丙酮溶解(丙酮的用量只需能溶解该组分即可)，然后加5ml二氯甲烷结晶，得到粗晶体。
5)、将粗晶体用少量的丙酮溶解(丙酮的用量只需能溶解粗晶体即可)，然后加5ml二氯甲烷重结晶，得到纯度＞99％的表儿茶素119mg。
实施例2、一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，依次进行以下步骤：
1)、取杨梅果渣1公斤，加入pH1.5的柠檬酸水溶液12升，室温下浸泡5h，纱布过滤得滤液，滤渣再用pH1.5的柠檬酸水溶液(12升)重复提取3次，合并4次所得的滤液；得总滤液A。
2)、将总滤液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂选用XDA-7大孔吸附树脂，得吸附后大孔吸附树脂；总滤液的流速为每小时3的大孔吸附树脂体积，大孔吸附树脂对总滤液的处理量是大孔吸附树脂的5体积倍。
将上述吸附后大孔吸附树脂先用清水洗脱，以去除未被大孔树脂吸附的糖类等杂质；然后再进行步骤3)的洗脱。
3)、用质量比95％乙醇水溶液洗脱步骤2)所得的大孔吸附树脂；乙醇水溶液流量为每小时3倍的大孔吸附树脂的体积，乙醇水溶液的用量是大孔吸附树脂的3倍。收集洗脱液，将洗脱液经浓缩、真空干燥后，得到红色素8.1g。
4)、将上述步骤3)所得的8.1g红色素进行柱层析分离，采用硅胶(200目～300目)作为固定相，流动相为三氯甲烷/甲醇/水梯度洗脱，具体如下：
将8.1g红色素用适量甲醇溶解(甲醇的用量只需能溶解8.1g红色素即可)，得溶解物；再将溶解物用100目～200目硅胶(8.1g)拌样，置于50度烘箱中烘干(至恒重)，经200目～300目硅胶柱(100g)层析，用三氯甲烷/甲醇/水的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱；三氯甲烷/甲醇/水的梯度设置规则如下：三氯甲烷/甲醇/水7∶3∶0.5(体积比)800ml；三氯甲烷/甲醇/水6∶4∶1(体积比)800ml；三氯甲烷/甲醇/水5∶5∶1(体积比)400ml。
分段回收(每100ml收集一瓶，共收集20瓶)，经簿层层析板(TLC)紫外灯下跟踪检测；其中第3-8瓶为主要成份，合并后浓缩(50转/分钟的转速和46℃的温度下旋转蒸发浓缩)，得到富含表儿茶素的组分，将该组分先用少量的甲醇溶解(甲的用量只需能溶解该组分即可)，然后加5ml二氯甲烷结晶，得到粗晶体。
5)、将粗晶体用少量的甲醇溶解(甲醇的用量只需能溶解粗晶体即可)，然后加5ml的二氯甲烷重结晶，得到纯度＞99％的表儿茶素120mg。
实施例3、一种从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，依次进行以下步骤：
1)、取杨梅果渣1公斤，加入pH2的乳酸水溶液11升，室温下浸泡4h，纱布过滤得滤液，滤渣再用pH2的乳酸水溶液(11升)重复提取3次，合并4次所得的滤液；得总滤液。
2)、将总滤液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂选用XDA-1大孔吸附树脂，得吸附后大孔吸附树脂；总滤液的流速为每小时3倍的大孔吸附树脂体积，大孔吸附树脂对总滤液的处理量是大孔吸附树脂的5体积倍。
将上述吸附后大孔吸附树脂先用清水洗脱，以去除未被大孔树脂吸附的糖类等杂质；然后再进行步骤3)的洗脱。
3)、用质量比95％乙醇水溶液洗脱步骤2)所得的大孔吸附树脂；乙醇水溶液流量为每小时3倍的大孔吸附树脂的体积，乙醇水溶液的用量是大孔吸附树脂的3倍。收集洗脱液，将洗脱液经浓缩、真空干燥后，得到红色素7.9g。
4)、将上述步骤3)所得的7.9g红色素进行柱层析分离，采用硅胶(200目～300目)作为固定相，流动相为二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，具体如下：
将7.9g红色素用适量乙醇溶解(乙醇的用量只需能溶解7.9g红色素即可)，得溶解物；再将溶解物用100目～200目硅胶(7.9g)拌样，置于50度烘箱中烘干(至恒重)，经200目～300目硅胶柱(100g)层析，用二氯甲烷/甲醇的混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱；二氯甲烷/甲醇的梯度设置规则如下：二氯甲烷/甲醇100∶4(体积比)洗脱400ml；二氯甲烷/甲醇100∶8(体积比)洗脱800ml；二氯甲烷/甲醇100∶16(体积比)洗脱800ml。
分段回收(每100ml收集一瓶，共收集20瓶)，经簿层层析板(TLC)紫外灯下跟踪检测；其中第5-12瓶为主要成份，合并后浓缩(50转/分钟的转速和46℃的温度下旋转蒸发浓缩)，得到富含表儿茶素的组分，将该组分先用少量的甲醇溶解(甲醇的用量只需能溶解该组分即可)，然后加5ml三氯甲烷结晶，得到粗晶体。
5)、将粗晶体用少量的甲醇溶解(甲醇的用量只需能溶解粗晶体即可)，然后加5ml的三氯甲烷重结晶，得到纯度＞99％的表儿茶素118mg。
对比实施例1、取杨梅果渣1公斤，参照文献(张嫩玲等.毛叶合欢的化学成分.中草药，2010，41(7)：1075-1078)中的乙醇回流提取法进行提取和分离，最终得到纯度＞99％的表儿茶素90mg。该方法主要的缺陷是：用95％乙醇对杨梅果渣进行回流提取时，能提取出其中的起泡成分，浓缩样品时因起泡而不易回收提取溶剂；溶剂提取杨梅果渣后需要萃取步骤，能耗较高；萃取时需大量有机溶剂且萃取不完全，产品得率偏少。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是依次包括以下步骤：
1）、将杨梅果渣用pH 1.0~2.0的酸性水溶液提取后，过滤，得滤液；
2）、将滤液用大孔吸附树脂吸附，得吸附后大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂为LX-68、XDA-1或XDA-7；
3）、用质量比为75~95％的乙醇水溶液洗脱吸附后大孔吸附树脂，收集洗脱液；将洗脱液浓缩后，得提取物；
4）、将提取物进行柱层析分离，用洗脱剂进行洗脱，收集含有表儿茶素的组分进行结晶，制得粗结晶；
5）、将粗结晶用结晶液进行重结晶，得表儿茶素。
2.根据权利要求1所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：将步骤2）所得吸附后大孔吸附树脂先用清水洗脱；然后再进行步骤3）的洗脱。
3.根据权利要求2所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：
所述步骤1）中：杨梅果渣与酸性水溶液的质量/体积比为：1kg杨梅果渣/10~12L酸性水溶液；所述酸为盐酸、柠檬酸或乳酸；提取时间为3~5小时，提取温度为室温。
4.根据权利要求3所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：
所述步骤2）中：滤液的流速为每小时2~4倍的大孔吸附树脂体积，所述大孔吸附树脂对滤液的处理量是大孔吸附树脂的4~6体积倍。
5.根据权利要求4所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：
所述步骤3）中：乙醇水溶液流量为每小时2~4倍的大孔吸附树脂的体积，乙醇水溶液的用量是所述大孔吸附树脂的2~4体积倍。
6.根据权利要求5所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：
所述步骤4）为：将提取物用强极性溶剂溶解，得溶解物；再将溶解物用100目~200目硅胶拌样，置于40~60℃烘箱中烘干，经200目~300目硅胶柱层析，用洗脱剂洗脱；经TLC法紫外灯下跟踪检测，收集含有表儿茶素的馏分，进行结晶，制得粗结晶。
7.根据权利要求6所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：所述步骤4）中的强极性溶剂为甲醇或乙醇，洗脱剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的从杨梅果渣中提取表儿茶素的方法，其特征是：
所述步骤5）中：结晶液为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和石油醚中的至少一种。
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