CN101518565B

CN101518565B - 一种野葛藤提取物hplc指纹图谱的构建方法

Info

Publication number: CN101518565B
Application number: CN200910020213XA
Authority: CN
Inventors: 李贵海; 刘逢芹; 于希昌; 刘田云
Original assignee: Shandong Academy of Chinese Medicine
Current assignee: Shandong Academy of Chinese Medicine
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: CN101518565A

Abstract

本发明涉及一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，主要包括以下步骤：取野葛藤药材，用乙醇回流提取得醇提物粉末，用95％的乙醇溶解，定容，滤过，得供试品溶液；然后进行高效液相色谱分析，Diamonsil^TM C₁₈色谱柱，检测波长250nm，流动相为乙腈-0.5％乙酸水溶液；得到野葛藤提取物HPLC指纹图谱。本发明的方法精确，稳定，重现性好，操作简便，容易掌握，所得指纹图谱中各共有特征峰分离良好，易于辨认，能较严格地评价和控制野葛藤提取物的内在质量。

Description

一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，属于中药材的鉴别方法技术领域。

背景技术

葛根作为临床常用中药，用量很大，但每年大量采挖，造成水土流失、植被破坏等严重的环保问题，有必要寻找新的药用资源作为替代品。野葛藤为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willdenow)ohwi的地上干燥藤茎，与常用中药葛根同源。在对野葛藤药用资源的开发研究中发现，野葛藤中也含有大量与葛根相同的异黄酮成分，有可以替代葛根入药的可能性。但野葛藤药材因品种、产地的不同，其有效成分的含量存在一定的差异，因此用于临床的质量稳定性也难以保证。目前，还没有建立一种能较好的控制其质量的方法。

中药指纹图谱是指采用一定的分析手段得到的某种中药材或中药制剂中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱图或光谱图。以指纹图谱作为中药(天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。因此，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。

发明内容

本发明旨在提供一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，为确保野葛藤提取物的质量，控制和评价其质量稳定性提供依据。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

称取野葛藤药材，每50g加入65％～75％(V/V)的乙醇300～350mL，回流提取3次，每次1～2h，合并提取液，回收乙醇，浓缩至比重1.12后离心，取上清液上大孔树脂柱，依次用2倍柱体积的纯化水、5倍柱体积的70％(V/V)乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，干燥成细粉；

取上述细粉约5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加95％(V/V)的乙醇10ml溶解，加重蒸水定容至刻度，用微孔滤膜滤过，所得续滤液即为供试品溶液；

(2)高效液相色谱分析：

色谱条件：色谱柱：Diamonsil^TM C₁₈色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；

检测波长250nm，流动相流速1.0ml/min，柱温为室温，进样量为10μl；流动相A为乙腈，流动相B 0.5％(V/V)的乙酸水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序如下：其中下述比例为体积比：

0min时，流动相A∶流动相B＝15∶85；

40min时，流动相A∶流动相B＝40∶60；

60min时，流动相A∶流动相B＝50∶50；

(3)精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述条件操作，得到野葛藤提取物的HPLC指纹图谱。

该指纹图谱所具有的共有特征峰为(4)、(7)、(12)、(16)四个峰，其保留时间分别为7.9min、12.8min、19.7min、31.2min，经分析确定这四个峰依次为葛根素、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的特征峰。

进一步的，本发明方法中得到的指纹图谱的共有特征峰还包括(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(15)、(17)十三个峰，其保留时间分别为5.2min、6.1min、6.9min、8.9min、10.7min、14.1min、14.9min、16.7min、18.1min、20.9min、24.3min、27.7min、32.5min。

按照本发明所述的方法，在供试品溶液的制备时，优选每50g野葛藤样品加入70％的乙醇300mL，进行回流提取，每次提取1.5h。

所述的大孔树脂柱优选为HPD100或HPD600型。

为保证野葛藤药材的质量稳定性，确定野葛藤药材的定期采集时间为每年1-4和9-12月。

本发明选取不同产地、不同采集时间的药材20多批，按本发明的方法进行高效液相分析，通过对不同批次图谱的比较，确定了其共有的特征峰。

本发明的有益效果是：通过大量的实验研究，明确了野葛藤药材的采集时间、提取方法，并对野葛藤醇提物的纯化工艺和HPLC色谱条件进行了优化选择，最终通过高效液相色谱法确定了野葛藤提取物指纹图谱的总体特征；该方法精确，稳定，重现性好，操作简便，容易掌握，所得指纹图谱中各共有特征峰分离良好，易于辨认，能较严格地评价和控制野葛藤提取物的内在质量。

附图说明

图1为按本发明方法获得的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱。

图2为按实施例1方法获得的混合对照品和野葛藤提取物的指纹图谱。

其中，1～17为野葛藤提取物的HPLC指纹图谱中的共有特征峰。

A～F为不同批次的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱。

G为混合对照品的图谱，峰1：葛根素；峰2：大豆苷；峰3：染料木苷；峰4：大豆苷元。

具体实施方式

实施例1

1仪器

Waters高效液相色谱仪Empower色谱工作站，Waters600泵，Waters2996检测器；AE-241型分析天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司。试剂95％乙醇(分析纯)天津市北方天医化学试剂厂20050314；甲醇(色谱纯)天津市科密欧化学试剂开发中心20060427；冰醋酸(优级醇)天津市科密欧化学试剂开发中心20051015。对照品葛根素(中国药品生物制品检定所，编号110752-200209)；大豆苷(中国药品生物制品检定所，编号111738-200501)，染料木苷(中国药品生物制品检定所，编号111709-200501)，大豆苷元(中国药品生物制品检定所，编号1502-200101)，染料木素(中国药品生物制品检定所，编号111704-200501)。

2试药野葛藤药材共6批，编号1～6号。

1号山东新泰，采集时间2004.02；2号河南西峡，采集时间2004.11；

3号济南柳埠，采集时间2006.11；4号济南西营采集时间2006.11；

5号山东烟台，采集时间2006.11；6号济南彩石，采集时间2006.11。

将上述采集到的药材切成薄片晒干。取野葛藤切片，每50g加入70％(V/V)的乙醇加热回流提取，提取3次，每次1.5h，合并提取液，回收乙醇浓缩至适量，离心，取上清液加于已处理好的HPD100型大孔吸附树脂柱上，然后依次用2BV的纯化水和5BV的70％(V/V)的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液，回收乙醇后，喷雾干燥，进口温度120℃，出口温度65℃，即得野葛藤醇提物粉末。

3方法与结果

3.1供试溶液制备

3.1.1对照品溶液制备：精密称取对照品葛根素1.20mg，大豆苷1.30mg，染料木苷0.57mg，大豆苷元0.97mg，染料木素0.5mg，置同一容量瓶中，加95％乙醇溶解至10ml，摇匀，用微孔滤膜(孔径微0.45μm)滤过，滤液作为对照品混合溶液。

3.1.2供试品溶液的制备：取1-6号野葛藤提取物粉末各约5mg，分别精密称定，置25ml容量瓶中，加95％(V/V)乙醇溶解至刻度，用微孔滤膜(孔径微0.45μm)滤过，滤液作为供试品溶液。

3.2HPLC色谱条件

色谱柱：DiamonsilTM C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长250nm；流动相流速1.0ml/min；柱温为室温；进样量为10μl；流动相为乙腈-0.5％乙酸水溶液按不同体积进行混合的二元梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述条件操作，得到对照品和各批次野葛藤提取物的HPLC指纹图谱，见图1、图2。与对照品的指纹图谱比较可见，在此色谱条件下，供试品中已知成分的各色谱峰能得以较好地分离；对比6批次的图谱，其共有峰的相对保留时间符合程度较好，经专用统计软件分析统计表明RSD＜5％、p＞0.05，不仅提示葛藤提取物作为药用新资源具有十分好的前景，也从另一角度提示临床应用药材应在固定产地的前提下才能确保疗效的一致性。

表1野葛藤提取物HPLC指纹图谱的流动相组成

表2各批次野葛藤提取物HPLC指纹图谱中共有峰的保留时间一览表

实施例2

除供试品溶液的制备中，每50g野葛藤药材加入65％(V/V)的乙醇350mL，回流提取3次，每次1h外，其余操作同实施例1。

实施例3

除供试品溶液的制备中，每50g野葛藤药材加入75％(V/V)的乙醇300mL，回流提取3次，每次2h外，其余操作同实施例1。

Claims

1.一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

称取野葛藤药材，每50g加入65％～75％V/V的乙醇300～350mL，回流提取3次，每次1～2h，合并提取液，回收乙醇，浓缩至比重1.12后离心，取上清液上大孔树脂柱，依次用2倍柱体积的纯化水、5倍柱体积的70％V/V乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，干燥成细粉；

取上述细粉约5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加95％V/V的乙醇10ml溶解，加重蒸水定容至刻度，用微孔滤膜滤过，所得续滤液即为供试品溶液；

(2)高效液相色谱分析：

色谱条件：Diamonsil^TM C₁₈色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；

检测波长250nm，流动相流速1.0ml/min，柱温为室温，进样量为10μl；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％V/V的乙酸水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序如下：其中下述比例为体积比：

0min时，流动相A∶流动相B＝15∶85；

40min时，流动相A∶流动相B＝40∶60；

60min时，流动相A∶流动相B＝50∶50；

2.根据权利要求1所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：得到的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱所具有的共有特征峰为葛根素(4)、大豆苷(7)、染料木苷(12)、大豆苷元(16)四个峰，其保留时间分别为7.9min、12.8min、19.7min、31.2min。

3.根据权利要求1或2所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：得到的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱中的共有特征峰还包括(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、 (8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(15)、(17)十三个峰，其保留时间分别为5.2min、6.1min、6.9min、8.9min、10.7min、14.1min、14.9min、16.7min、18.1min、20.9min、24.3min、27.7min、32.5min。

4.根据权利要求1或2所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，每50g野葛藤样品加入70％的乙醇300mL，进行回流提取，每次提取1.5h。

5.根据权利要求1所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述的大孔树脂柱为HPD100或HPD600型。