CN108220472B - 一种野葛dna条形码标准基因序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种野葛DNA条形码标准基因序列及其应用，所述条形码标准检测基因序列如SEQ ID NO.1所示。通过聚合酶链式反应对野葛的基因组进行扩增，根据被测样品扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出226bp的条带，即可判断所检测样品中含有野葛成分。本发明提供了一种特异地检测野葛成分的方法，有助于野葛成分的鉴定，防止搀假使杂，保障消费者的健康。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现野葛的分子鉴定，能有效缩短野葛的鉴定时间。

Description

一种野葛DNA条形码标准基因序列及其应用

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体是一种野葛物种特异性的基因序列及其引物组合物。

背景技术

野葛(学名：Pueraria lobata，英文名称：kudzu)，为豆科葛属多年生落叶藤本植物。除新疆、青海及西藏外，分布几遍全国。野葛属阳生植物，常成片生长于海报100-2000米向阳坡面的森林边缘或河溪边的灌木丛中。野葛全身是宝，其根、茎、叶、花、果实(种子)等均具有较高的食用价值、药用价值和经济价值。野葛《本草纲目》记载：野葛，气味甘、平，无毒。具有清热排毒、解痉镇痛，升阳解肌，透疹止泻，润肠通便的功效。《中华人民共和国药典》收录野葛的干燥根入药，葛根中含有的葛根素、大豆苷等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、降低血脂血压、抗肿瘤及清除氧自由基等功效。

中国葛属植物划分为9个种和2个变种，其中野葛(Pueraria lobata)和粉葛(Pueraria thomsonii)分布最广、产量最高，野葛和粉葛也是商品“葛根”的主要来源。粉葛主要产于广西和广东，以人工栽培为主，其块根中的淀粉含量高达40％，是我国南方一些省区的常食蔬菜，其味甘凉可口，常作煲汤之用，是一种营养独特、药食兼优的绿色保健食品。对我国葛属植物的研究结果表明，野葛的葛根素及总黄酮含量显著高于同属其它植物，粉葛次之，干燥野葛中总黄酮含量高达5％-10％，干燥粉葛中总黄酮含量也达到0.5％-4％。由于葛属植物大多具块根，外形相似，易造成葛根药材流通和利用过程中的混杂，并且不同葛属植物和不同产地葛根药材的有效成分含量差异显著，从而给用药安全和药材质量带来影响。

目前，对于野葛的物种鉴定或野葛成分的检测鉴定，通常采用HLPC进行物质成分的色谱分析、RAPD分子标记分析、SRAP分子标记分析以及ITS序列分析等方法。这些传统的检测或鉴定方法存在着诸多不足之处，例如，葛属物种的物质成分较为相似，特别是对于近缘物种，色谱分析往往难以进行很好的区分，而RAPD分子标记分析、SRAP分子标记分析以及ITS序列分析等方法，虽然能够对葛属的近缘物种进行区分，但是，这些方法对于样本的待测量要求较高，当样本量中的野葛成分含量较低时，容易出现假阳性或假阴性的问题。另外，RAPD分子标记分析、SRAP分子标记分析需要通过对比复杂的电泳图谱、ITS序列分析则需要进行序列组成分析，这些方法的结果判定方式复杂，对于实验设备的要求较高，并不适用于工业化、普及化的检测。

因此建立一种可以特异性好、灵敏度高，结果判定简单、操作简便、成本较低的且的野葛成分检测方法是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中对于野葛成分的检测所存在诸多问题，本发明的目的之一是提供一种野葛物种特异性检测基因或一种野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列，其核苷酸序列或基因序列如下所述(SEQ ID NO.1)：

本发明的目的之二是提供一种可以特异性检测野葛DNA条形码标准检测基因或野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列的PCR引物，该引物的序列如下所示：

SEQ ID NO.2F1：gatggtagga gaataataac atatcgat；

SEQ ID NO.3R1：ccaatgttca atttccaccg tcta。

本发明的目的之三是提供一种野葛DNA条形码标准检测基因或一种野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列以及相应的PCR引物的用途，具体为：

野葛DNA条形码标准检测基因或野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物用于鉴别野葛物种。

野葛DNA条形码标准检测基因或野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物用于检测样本中是否含有野葛成分，其中，检测样本包括但不限于葛粉或葛根中药饮片。

野葛DNA条形码标准检测基因或野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物用于制备检测野葛成分的试剂盒。

本发明的目的之四是提供一种可以检测样本中野葛成分的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒中含有野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物，即引物F1，序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：gatggtagga gaataataac atatcgat；引物R1，序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ccaatgttca atttccaccg tcta。

本发明的目的之五是通过一种野葛物种的分子鉴定方法，具体步骤为：

1)从待测样品中提取DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，用引物F1和R1通过聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)进行扩增。以无菌水为空白对照，以野葛基因组DNA为阳性对照，其中引物F1如SEQ ID NO.2：gatggtagga gaataataac atatcgat所示，引物R1如SEQ ID NO.3：ccaatgttca atttccaccg tcta所示；

3)然后取适量步骤2)的PCR扩增出的基因片段用琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；

4)根据被测样品扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出226bp的条带，即可判断所检测样品中含有野葛成分。

本发明提供了一种野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列、PCR引物以及相应的检测野葛成分的方法，与现有的野葛成分检测方法相比，本发明具有以下有益的效果：

1.与传统的鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现野葛的分子鉴定，能有效缩短野葛的鉴定时间，其可以有效的检测野葛成分，特别是有助于区分野葛和粉葛，防止搀假使杂。

2.本发明的野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列、PCR引物以及相应的检测野葛成分的方法特异性好，其能够在8种野葛物种中扩增出特异性条带，在20种其他植物中并无扩增。

3.本发明的野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列、PCR引物以及相应的检测野葛成分的方法灵敏度高，其可检测野葛基因组DNA含量低至0.02ng/μL的样品。

4.本发明的野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列、PCR引物以及相应的检测野葛成分的方法结果判定简单，其仅仅需要观察是否出现226bp的特异性扩增条带，而无需进行电泳图谱比对或序列分析。本发明的方法操作简便，成本较低，特别适合工业应用。

附图说明

图1是野葛DNA条形码标准检测核苷酸序列的PCR引物F1/R1在野葛条形码标准检测核苷酸序列中的位置图；

图2是引物F1/R1分别对8种不同野葛品种的基因组DNA扩增结果图，其中泳道M是Takara DL2000 DNA ladder，泳道1为水的空白对照，泳道2-9的野葛分别来自湖南，山西，浙江，湖北，江西，四川，贵州，安徽；

图3是引物F1/R1分别对野葛和20种非野葛品种的基因组DNA扩增结果图，其中泳道M为Takara DL2000 DNA ladder，泳道1为空白对照，泳道2为野葛叶片基因组DNA阳性对照，泳道3-22分别为粉葛，峨眉葛，大豆，长豇豆，豌豆，蚕豆，绿豆，花生，拟南芥，烟草，水稻，玉米，薏米，萝卜，大麦，小麦，马铃薯，番茄，油菜，棉花；

图4是引物F1/R1对野葛扩增的灵敏度检测图，泳道M为Takara DL2000 DNAladder，泳道1为空白对照，泳道2-6分别为20，2，0.2，0.02，0.002ng野葛基因组DNA；

图5利用特异性引物组合检测不同样品的PCR扩增结果，其中泳道M为TakaraDL2000 DNA ladder，泳道1为空白对照，泳道2为野葛叶片基因组DNA阳性对照，泳道3-8分别为6种不同的葛根制品。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

不同物种由于独立进化的结果，它们在遗传、生理和品质等方面各具特色。利用不同物种特有的DNA序列可以开发成能够识别和定量不同物种及其加工产品的标记。本发明是这样实现的：通过将本研究团队从野葛中克隆获得的基因序列进行Blastn分析，选择特异性强、相似序列少的野葛基因序列。以特异性强的基因序列为检测靶标，设计引物，进行PCR扩增并对扩增结果进行测序分析。获得野葛物种特异性检测条形码标准检测基因序列，序列组成如下：

进一步，基于上述核苷酸序列设计引物，并进行优化筛选，最终筛选出来的引物组合具有以下特征：1、扩增条带清晰、单一；2、在所有的野葛品种中均有相同的扩增条带；3、在其他野葛近缘种、常见的作物中均没有扩增。基于此，获得野葛DNA条形码标准检测基因序列的PCR引物，其序列为：

SEQ ID NO.2 F1：gatggtagga gaataataac atatcgat 28

SEQ ID NO.3 R1：ccaatgttca atttccaccg tcta 24。

实施例1野葛DNA条形码标准检测基因序列及其PCR引物在不同物种中的扩增情况分析

1.实验材料

1.1植物材料

进行试验的8个不同野葛(Pueraria lobata)品种分别采自我国8个不同省份(分别来自湖南，山西，浙江，湖北，江西，四川，贵州，安徽)。其他20种不同种属的材料分别有：粉葛(Pueraria thomsonii)，峨眉葛(Pueraria omeiensis)，大豆(Glycine max)，长豇豆(Vigna unguicμLata)，豌豆(Pisum sativum)，蚕豆(Vicia faba)，绿豆(Vigna radiata)，花生(Arachis hypogaea)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，烟草(Nicotiana tabacum)，水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，薏米(Coix chinensis)，萝卜(Raphanussativus)，大麦(Hordeum vμLgare)，小麦(Triticum aestivum)，马铃薯(Solanumtuberosum)，番茄(Lycopersicon escμLentum)，油菜(Brassica napus)，棉花(Gossypiumspp)。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂)；

凝胶成像系统：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：

2.1.1、粉碎样品，取样100mg。

2.1.2、加入400μL bufferAP1和4μLRNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。期间混匀2-3次。

2.1.3、加入130μL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min。

2.1.4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作为收集管。14000rpm离心2min。

2.1.5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。吹打混匀。

2.1.6、取650μL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650μL的体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm离心1min，对剩余的样品同样操作。

2.1.7、将柱子置于新的2mL离心管，用500μL buffer AW洗脱，8000rpm离心1min，弃洗脱液。

2.1.8、再用500μL buffer AW洗脱，1400rpm离心2min，弃洗脱液。

2.1.9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100μL洗脱液Buffer AE。室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。

2.2PCR扩增

以1.1中所述的植物材料的基因组DNA为模板，以能特异性鉴定野葛的引物组合F1/R1为引物，进行PCR扩增，引物信息和扩增片段大小见表1所示：

表1引物信息和扩增片段大小

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O补足至25μL。

3.实验结果

PCR扩增均以无菌水为空白对照，以野葛基因组DNA为阳性对照，只有当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带(条带大小为226bp)则说明PCR结果可靠。

如图2所示，利用本发明的引物组合对8个野葛品种基因组DNA进行PCR扩增，均扩增出清晰、单一条的226bp条带。表明本发明公布的基因片段及检测方法在野葛品种中具有较好的物种内稳定性。如图3所示，选取20个野葛近缘种和常见作物，利用本发明的引物组合对这20种基因组DNA进行PCR扩增，结果只有以野葛基因组DNA为阳性对照的泳道有清晰、单一条带。其他泳道均无任何带型，表明本发明公布的基因片段及检测方法在野葛品种中具有较好的物种间特异性。

实施例2野葛DNA条形码标准检测基因序列及其PCR引物的检测灵敏度分析

1.提取野葛基因组DNA，提取方法与实施例1中的方法相同。

2.将野葛基因组DNA用水梯度稀释至20ng/μL,2ng/μL,0.2ng/μL,0.02ng/μL,0.002ng/μL，利用本发明的引物组合F1/R1为引物，进行PCR扩增，PCR扩增的方法与实施例1中的方法相同

3.结果分析，如图4所示，结果当DNA浓度低至0.02ng/μL时仍有清晰可见的条带，表明本发明公布检测方法可检测基因组DNA含量低至0.02ng/μL的样品，灵敏度较高。

实施例3野葛DNA条形码标准检测基因序列及其PCR引物对于市售葛粉中药葛成分的检测

1.实验材料

1.1植物材料

即冲型野葛粉(市售)，野葛粉(同仁堂牌)，野葛根中药饮片(市售)，野葛代餐粉(市售)，粉葛根粉(御桂园牌)，粉葛根丁(市售)

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂)；

凝胶成像系统：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：

2.1.1、粉碎样品，取样100mg。

2.1.2、加入400μL bufferAP1和4μL RNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。期间混匀2-3次。

2.1.3、加入130μL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min

2.1.4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作为收集管。14000rpm离心2min

2.1.5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。吹打混匀。

2.1.6、取650μL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650μL的体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm离心1min，对剩余的样品同样操作。

2.1.7、将柱子置于新的2mL离心管，用500μL buffer AW洗脱，8000rpm离心1min，弃洗脱液。

2.1.8、再用500μL buffer AW洗脱，1400rpm离心2min，弃洗脱液。

2.1.9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100μL洗脱液Buffer AE。室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。

2.2 PCR扩增

以1.1中材料的基因组DNA为模板，以能特异性鉴定野葛的引物组合F1/R1为引物，进行PCR扩增，引物信息和扩增片段大小见表2所示：

表2引物信息和扩增片段大小

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O补足至25μL。

3.实验结果

PCR扩增均以无菌水为空白对照，以野葛基因组DNA为阳性对照，只有当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带(条带大小为226bp)则说明PCR结果可靠。

实验结果如图5所示，野葛粉(同仁堂牌)(泳道4)和野葛根中药饮片(市售)(泳道5)均检测到与阳性对照相同的条带，因此含有野葛成分。即冲型野葛粉(市售)，野葛代餐粉(市售)，粉葛根粉(御桂园牌)，粉葛根丁(市售)均无扩增，因此不含有野葛成分。实验结果表明，本发明的基于野葛特异性序列的引物组合能够准确鉴定出样品中的野葛成分。

以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种野葛DNA 条形码标准基因序列及其应用

<130> CP11803022C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 226

<212> DNA

<213> 野葛（Pueraria lobata）

<400> 1

gatggtagga gaataataac atatcgatac ccaagttcgt agctatgata aaatcatatg 60

ggtagataga catgaataaa atatccccaa ttattgctta gtaaatgaaa aataaaataa 120

ataatagggg tagagacggt cttggtcttg aaaaacatgc gggcatatgc caccaaactc 180

gtaggttaac aagcagtctt agtagacggt ggaaattgaa cattgg 226

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatggtagga gaataataac atatcgat 28

210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaatgttca atttccaccg tcta 24

Claims (9)

1.一种野葛DNA条形码标准检测基因，其特征在于，所述条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述的野葛DNA条形码标准检测基因或权利要求2所述野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物在鉴别野葛物种中的应用。

4.一种权利要求1所述的野葛DNA条形码标准检测基因或权利要求2所述的野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物的用途，其特征在于，所述DNA条形码标准检测基因或野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物用于检测样本中是否含有野葛成分。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述样本选自葛粉或葛根中药饮片。

6.权利要求1所述的野葛DNA条形码标准检测基因或权利要求2所述的野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物在制备鉴别野葛物种的试剂盒中应用。

7.权利要求1所述的野葛DNA条形码标准检测基因或权利要求2所述野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物在制备检测野葛成分的试剂盒中应用。

8.一种检测野葛成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的野葛DNA条形码标准检测基因的PCR引物。

9.一种野葛物种的分子鉴定方法，包括：

1)从待测样品中提取DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行扩增；以无菌水为PCR空白对照，以野葛基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

3)取步骤2)扩增出的核苷酸片段用琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；

4)根据被测样品扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出226bp的条带，即可判断所检测样品中含有野葛成分。

Images