CN102078400B - 一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将枇杷叶干燥粉碎；(2)用乙醇或甲醇为溶剂提取枇杷叶干燥粉末，将提取液减压浓缩成浸膏；(3)将步骤(2)中得到的浸膏用80-90％乙醇或甲醇溶解，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；(4)取活性炭装柱，将步骤(3)得到的醇溶液上样，用乙醇或甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液；(5)将步骤(4)收集的洗脱液浓缩干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物；或将步骤(4)收集的洗脱液浓缩至醇浓度为20-50％，放置6-12小时，过滤，将沉淀物干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物。该方法制得的枇杷叶总三萜酸含量高，且工艺简单，成本低。

Description

一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法。

背景技术

枇杷叶是蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥叶，是一味常用传统中药，收载于历版中国药典供中医临床使用。枇杷叶归肺、胃经，具清肺止咳、降逆止呕作用，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆、烦热口渴等症状。新近的研究发现从枇杷叶中分离得到的三萜酸类化学成分具有显著的降血糖活性。

目前对枇杷叶总三萜酸提取物的制备，大多直接采用溶剂提取，工艺相对简单，但所得到的提取物中三萜酸的含量较低；改进工艺能适当提高提取物中三萜酸的含量，但工艺相对复杂、成本高，且三萜酸含量提高较少，无法满足制药需求。

发明内容

本发明的目的是克服现有工艺中的缺陷，提高枇杷叶总三萜酸提取物中三萜酸的含量。

为了达到上述目的，本发明提供了一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将枇杷叶干燥粉碎；

(2)用乙醇或甲醇为溶剂提取步骤(1)中得到的枇杷叶干燥粉末，将提取液减压浓缩成浸膏；

(3)将步骤(2)中得到的浸膏用80-90％乙醇或甲醇溶解，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；所述乙醇或甲醇的重量为浸膏重量的10-40倍；

(4)取活性炭装柱，将步骤(3)得到的醇溶液上样，用乙醇或甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液；所述活性炭与步骤(1)中所述枇杷叶的重量比为：0.2-5∶1.；

(5)将步骤(4)收集的洗脱液浓缩干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物；或将步骤(4)收集的洗脱液浓缩至醇浓度为20-50％(最佳浓度为30-35％)，放置6-12小时，过滤，将沉淀物干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物。

其中，步骤(2)中提取方法为：每千克枇杷叶加入4-10L浓度为60-95％的乙醇或甲醇，热回流或浸渍或渗漉提取2-4次，热回流提取每次1-3小时，浸渍或渗漉提取每次15天，合并提取液。最佳提取方法为：每千克枇杷叶加入8L浓度为90％的乙醇提取2小时，过滤，滤渣加入6L浓度为90％的乙醇提取1小时，过滤，合并两次提取液。

步骤(4)中活性炭与枇杷叶的重量比为1∶3；中洗脱采用重量为活性炭重量8-15倍的80-90％乙醇；或先采用重量为活性炭重量10-20倍的10-75％乙醇进行洗脱，后采用重量为活性炭重量8-15倍的80-90％乙醇进行洗脱，收集80-90％的乙醇洗脱液。

本发明具有以下优点：

(1)本发明采用醇提取结合活性炭柱层析法进行制备，能够有效提高总三萜酸含量，经高效液相色谱法检测含量均高于60％，最高能达到69％，紫外分光光度法测得总三萜酸含量以熊果酸计均高于80％。

(2)活性炭是由含炭为主的物质作原料，经高温炭化和活化制得的疏水性吸附剂。活性炭含有大量微孔，具有巨大的比表面积，易于吸附非极性或极性很低的吸附质，对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。枇杷叶中除了三萜酸外还含有黄酮类和多酚类化合物，枇杷叶中含有的三萜酸类化合物大多为低极性大分子，而枇杷叶中的黄酮类和多酚类化合物具有芳环结构，而且大都含有多个酚羟基，极性较大，活性碳对其吸附力比三萜酸类更强。因此采用活性炭柱层析法纯化提取物时，80-95％高浓度乙醇可以将三萜酸类成分洗脱下来，而多酚类黄酮类化合物则依旧保留在活性炭柱上。同时活性炭相对大孔树脂等常规柱层析材料价格便宜，在工业生产上能够节约成本；且在进行洗脱时，杂质不易解吸附，因此不需要进行梯度洗脱，工艺相对简单。

(3)本发明采用活性炭进行柱层析，不同于常规试验中采用活性炭进行热回流：首先，活性炭的用量(20％-500％)比常规用量(一般加入量均小于5％)大，能够有效的吸附杂质，从而提高产物的三萜酸含量；其次，采用动态的解吸附过程，能够使三萜酸和杂质更好的分离，提高产品纯度。

(4)本发明采用活性炭柱层析法得到的洗脱液采用浓缩至低醇度自然沉析的方法，枇杷叶中的三萜酸极性小能够自然析出，而极性较大的杂质溶解于母液中，从而能够有效的去除极性较大的杂质，进一步提高产物中总三萜酸的含量。

具体实施方式

工艺优选实施例

本试验采用以下4种方法制备枇杷叶总三萜酸提取物，根据高效液相色谱法测量各三萜酸成分的含量，同时根据紫外分光光度法测量总三萜酸含量，并进行比较：

A、醇提取法：100g枇杷叶药材粗粉，分别加药材重量8倍量和6倍量85％乙醇回流提取两次，提取时间分别为2小时、1小时，过滤，合并提取液并浓缩干燥。

B、醇提取醇溶解法：100g枇杷叶药材粗粉，分别加药材重量8倍量和6倍量85％乙醇回流提取两次，提取时间分别为2小时、1小时，过滤，合并提取液并浓缩成浸膏，浸膏加90％乙醇溶解，过滤，上清液浓缩干燥。

C、醇提结合活性碳加热回流法：100g枇杷叶药材粗粉，分别加药材重量8倍量和6倍量85％乙醇回流提取两次，提取时间分别为2小时、1小时，过滤，合并提取液并浓缩成浸膏，浸膏加90％乙醇溶解，过滤，取上清液加入20g活性碳，加热回流，趁热过滤，滤液浓缩干燥。

D、醇提结合活性碳柱层析法：100g枇杷叶药材粗粉，分别加药材重量8倍量和6倍量85％乙醇回流提取两次，提取时间分别为2小时、1小时，过滤，合并提取液并浓缩成浸膏，浸膏加90％乙醇溶解，滤过，上清液上20g活性碳柱，300g 90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥。

高效液相色谱法：

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C₁₈柱，250mm*4.6mm，5μm)；以甲醇(A)-0.15％甲酸(B)为流动相梯度洗脱，0～1min A∶B＝73∶27，2～48min A∶B＝80∶20，49～60minA∶B＝90∶10。柱温30℃；检测波长208nm。

对照品溶液的制备：精密称取三萜对照品适量加甲醇溶解配置成含野鸭椿酸0.2mg·ml^-1、委陵菜酸0.1mg·ml^-1、山楂酸0.1mg·ml^-1、克罗索酸0.2mg·ml^-1、齐墩果酸0.05mg·ml^-1、熊果酸0.2mg·ml^-1的混合对照品溶液作为对照品溶液。

样品溶液的制备：精确称取枇杷叶总三萜酸提取物10.0mg于10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

样品测定：分别取样品溶液和对照品溶液各10μl，进样，按外标法以峰面积计算样品含量。

紫外分光光度法：

对照品溶液的制备：精密称取熊果酸5.0mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至25ml，摇匀即得。

样品溶液的制备：精确称取枇杷叶总三萜酸提取物6.0mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇超声溶解，定容至25ml，摇匀即得。

样品测定：精密移取0.2～0.4ml样品溶液于试管中，水浴蒸干溶剂，加入新配5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，再加入高氯酸1.0ml，60℃水浴反应15min，立即置于冰水浴中冷却，再加冰醋酸5ml混合均匀后于紫外-可见分光光度计下测量545nm处的吸收值，根据熊果酸标准曲线计算样品总三萜酸含量。

结果见表1，方法D醇提结合活性炭柱层析法得到的总三萜酸含量及各三萜酸成分含量均明显高于其它三种方法得到总三萜酸含量及各三萜酸成分含量。

表1不同制备方法所得提取物的出膏率、各主要总三萜酸的含量及总三萜含量

产品实施例1

取干燥枇杷叶1.0kg粉碎成粗粉，依次用80％乙醇8L、6L冷浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏，加10倍稠膏重量的80％乙醇，搅拌，放置。过滤，取上清液备用。取活性碳颗粒5kg装柱，将上述备用的上清液上样，分别用50kg的70％乙醇和50kg的90％乙醇进行梯度洗脱，收集90％乙醇洗脱液。减压浓缩至醇浓度为40％，放置8小时冷析，过滤，沉淀干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物，得率为1.2％。提取物经HPLC检测，其中主要三萜酸成分含量分别为：野鸭椿酸12.13％、委陵菜酸8.88％、山楂酸10.12％、克罗索酸14.15％、齐墩果酸4.34％、熊果酸14.11％，总含量为63.73％，经紫外分光光度法测得提取物总三萜酸含量以熊果酸计为82.35％。

产品实施例2：

取干燥枇杷叶1.0kg粉碎成粗粉，20kg的90％乙醇浸渍48小时后，渗漉提取，渗漉至流出液色浅，三萜反应不明显为止，减压浓缩呈稠膏，加30倍稠膏重量的90％乙醇，搅拌，置离心机沉降离心，取上清液备用。取0.5kg活性碳颗粒装柱，将上述备用的上清液上样，用4kg的90％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压浓缩至醇浓度为20％，放置10小时冷析，滤过，沉淀干燥。得枇杷叶总三萜酸提取物，得率为1.4％。提取物经HPLC检测，其中主要三萜酸成分含量分别为：野鸭椿酸15.61％、委陵菜酸6.15％、山楂酸8.64％、克罗索酸13.91％、齐墩果酸4.47％、熊果酸12.53％，总含量为61.31％，经紫外分光光度法测得提取物总三萜酸含量以熊果酸计为81.91％。

产品实施例3：

取干燥枇杷叶1.0kg粉碎成粗粉，依次用90％乙醇6L、4L加热回流提取2次，每次分别为2小时、1小时，合并提取液，减压浓缩呈稠膏，加40倍稠膏重量的90％乙醇，搅拌，放置。置离心机沉降离心，取上清液备用。取0.2kg活性炭颗粒装柱，用15kg的95％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压浓缩至醇为50％，放置6小时冷析，过滤，沉淀干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物，得率为1.1％。提取物经HPLC检测，其中主要三萜酸成分含量分别为：野鸭椿酸13.30％、委陵菜酸5.22％、山楂酸6.73％、克罗索酸16.56％、齐墩果酸3.92％、熊果酸20.86％，总含量为66.59％，经紫外分光光度法测得提取物总三萜酸含量以熊果酸计为86.78％。

产品实施例4：

取干燥枇杷叶1.0kg粉碎成粗粉，依次用95％甲醇8L、6L冷浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏，加10倍稠膏重量的90％乙醇，搅拌，置离心机沉降离心，取上清液备用。取1kg活性碳颗粒装柱，将上述备用的上清液上样，用8kg的80％乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液。减压浓缩至醇浓度为20％，放置12小时冷析，滤过，沉淀干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物，得率为1.4％。提取物经HPLC检测，其中主要三萜酸成分含量分别为：野鸭椿酸13.99％、委陵菜酸5.26％、山楂酸8.31％、克罗索酸14.95％、齐墩果酸5.56％、熊果酸16.13％，总含量为64.20％，经紫外分光光度法测得提取物总三萜酸含量以熊果酸计为84.16％。

产品实施例5：

取1.0kg干燥枇杷叶粉碎成粗粉，依次用90％乙醇8L、6L加热回流2次，每次分别为2小时、1小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏。浸膏加20kg的90％乙醇溶解，过滤，得上清液。称取活性碳颗粒330g，装柱，取上清液上样，采用3.3kg90％乙醇洗脱。收集洗脱液，浓缩至醇浓度为30％，放置10小时冷析，过滤得沉淀，沉淀用50％乙醇洗涤，干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物，得率为1.2％。其中主要三萜酸成分含量分别为：野鸭椿酸15.44％、委陵菜酸6.02％、山楂酸8.72％、克罗索酸15.88％、齐墩果酸5.19％、熊果酸18.32％，总含量为69.57％，经紫外分光光度法测得提取物总三萜酸含量以熊果酸计为89.78％。

Claims (6)

1.一种枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)将枇杷叶干燥粉碎；

(2)用乙醇或甲醇为溶剂提取步骤(1)中得到的枇杷叶干燥粉末，将提取液减压浓缩成浸膏；

(3)将步骤(2)中得到的浸膏用80-90％乙醇或甲醇溶解，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；所述乙醇或甲醇的重量为浸膏重量的10-40倍；

(4)取活性炭装柱，将步骤(3)得到的醇溶液上样，用乙醇或甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液；所述活性炭与步骤(1)中所述枇杷叶的重量比为：0.2-5∶1；洗脱采用乙醇或甲醇浓度为80-95％；

(5)将步骤(4)收集的洗脱液浓缩干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物；或将步骤(4)收集的洗脱液浓缩至醇浓度为20-50％，放置6-12小时，过滤，将沉淀物干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物。

2.根据权利要求1所述的枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中活性炭与所述枇杷叶的重量比为1∶3。

3.根据权利要求1所述的枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：步骤(5)为：将步骤(4)收集的洗脱液浓缩醇至浓度为30-35％，放置6-12小时，过滤，将沉淀物干燥，得枇杷叶总三萜酸提取物。

4.根据权利要求1至3任一所述的枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中提取方法为每千克枇杷叶加入4-10L浓度为60-95％的乙醇或甲醇，热回流或浸渍或渗漉提取2-4次，热回流提取每次1-3小时，浸渍或渗漉提取每次15天，合并提取液。

5.根据权利要求1至3任一所述的枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中洗脱采用重量为活性炭重量8-15倍的80-90％乙醇进行洗脱；或先采用重量为活性炭重量10-20倍的10-75％乙醇进行洗脱，后采用重量为活性炭重量8-15倍的80-90％乙醇进行洗脱，收集80-90％的乙醇洗脱液。

6.根据权利要求4所述的枇杷叶总三萜酸提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的提取方法为每千克枇杷叶加入8L浓度为90％的乙醇提取2小时，过滤，滤渣加入6L浓度为90％的乙醇提取1小时，过滤，合并两次提取液。