CN112778323A - 一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法 - Google Patents

一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法 Download PDF

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CN112778323A CN202011614174.9A CN202011614174A CN112778323A CN 112778323 A CN112778323 A CN 112778323A CN 202011614174 A CN202011614174 A CN 202011614174A CN 112778323 A CN112778323 A CN 112778323A
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窦长清
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Abstract

本发明涉及一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，包括提取、萃取、纯化、精制、甘草多糖的提取的步骤。与现有技术比，本发明所述的方法流程清晰、方法易操作、成本低，纯化得到的产品颜色好、纯度高。同时最大限度的利用甘草，避免浪费。

Description

一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，属于医药化工技术领域。
背景技术
甘草其药用部位是根及根茎，为常用大宗药材，药食兼用品种，药典收录有三种，分别为乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草，从外观来看，三者非常相似，主成份相似，但是，光甘草定是光果甘草独有的化学成分，光甘草定(Glabridin)是一种美白效果十分出众的自然物质，在光果甘草中占0.2%左右，主要功效为：1、美白，抑制黑色素原；2、抗炎作用；3、抗氧化作用；4、抗菌。在那么多种化妆品原料中，光甘草定的价格算是相当昂贵的了，其中光甘草定90%的单价达21W/kg，进口的更加贵，价格堪比黄金，号称“美白黄金”。
甘草中除去含有甘草酸和甘草黄酮外，还含有一定量的甘草多糖（不同地区、不同生长年限含量相差较大，生长年限越长，含量越低），甘草多糖是从甘草中提取出的一类α-D-吡喃多糖，是一种天然植物多糖,具有抗病毒、免疫调节以及抗肿瘤的活性。
甘草提取完甘草酸后的光果甘草渣中含有甘草黄酮和甘草多糖，本发明用甘草渣提取制备光甘草定和甘草多糖，充分利用甘草，调高甘草的价值，提取方法简单。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种方法简单、成本低、最终产物含量高的从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，能有效利用光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、提取：称取光果甘草渣适量，采用乙醇进行第一次提取和第二次提取，合并两次提取液，合并后的提取液浓缩至膏状物；
2、萃取：取步骤1中的膏状物，加水，通过搅拌使膏状物悬浮，加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位；
3、纯化：选用大孔树脂填充柱（一次纯化大孔树脂装填于一个柱子内形成一次纯化大孔树脂填充柱，用于一次纯化；二次纯化大孔树脂装填于另一个柱子内形成二次纯化大孔树脂填充柱，用于二次纯化），对乙酸乙酯部位粗分：
a.一次纯化：将乙酸乙酯部位加入8-10倍量的95%乙醇，溶解，上样，一次纯化大孔树脂的重量是乙酸乙酯部位重量的10-15倍，洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；
b．二次纯化：取样品A，加入5-8倍量的95%乙醇，溶解，上样，二次纯化大孔树脂重量是样品A重量的15-20倍，洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品B；
4、精制：取样品B，加入5-8倍量的甲醇(这里是纯甲醇，以下同)，溶解，利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料重量为样品B重量的15-20倍（反相硅胶填料装填于反相色谱柱中），洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品C；液相检测，样品C中光甘草定含量大于90%（质量百分含量）；
5、甘草多糖的提取：取经步骤1提取后的剩余光果甘草渣，加入水并在90±5℃条件下进行第一次水提和第二次水提，合并两次水提物，同时合并步骤2萃取后的水层，浓缩，加入活性炭，加热，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，冷冻干燥，即得甘草多糖。
步骤1具体为：进行第一次提取：称取光果甘草渣适量，加入10-20倍80%-95%乙醇（这里的倍数是重量体积倍数，80%-95%乙醇：光果甘草渣：10-20：1，例如1kg光果甘草渣需加入10-20L 80%-95%乙醇）于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到一次提取液（指第一次提取得到的提取液）以及一次提取后的光果甘草渣（第一次提取后残留的光果甘草渣）；放出一次提取液，再对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入10-20倍80%-95%乙醇（这里的倍数是重量体积倍数，80%-95%乙醇：一次提取后的光果甘草渣：10-20：1，例如1kg一次提取后的光果甘草渣需加入10-20L80%-95%乙醇），于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到二次提取液（指第二次提取得到的提取液）以及剩余光果甘草渣（第二次提取后残留的光果甘草渣）；合并一次提取液和二次提取液得到合并后的提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩得到膏状物。
80%-95%乙醇为乙醇水溶液，制备时乙醇与水的体积比为80-95:5-20。下文中的10%乙醇（乙醇与水的体积比为10:90）、20%乙醇（乙醇与水的体积比为20:80）、40%乙醇（乙醇与水的体积比为40:60）、60%乙醇（乙醇与水的体积比为60:40）、80%乙醇（乙醇与水的体积比为80:20）、95%乙醇（乙醇与水的体积比为95:5）、70%乙醇（乙醇与水的体积比为70:30）中%为体积比。
步骤2具体为：取步骤1得到的膏状物，加重量为膏状物的20-30倍的水（指水的重量是膏状物重量的20-30倍），通过搅拌使膏状物悬浮，加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位；同体积指乙酸乙酯的体积与水的体积相同。
步骤3中，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B；步骤4中， 60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。
步骤3中，经液相检测，样品B中光甘草定含量大于40%（质量百分含量）。步骤5中，利用紫外-可见分光光度计进行含量检测，甘草多糖含量大于60%（质量百分含量）。
步骤5具体为：进行第一次水提：取步骤1第二次提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的20-30倍的水（即水的重量是剩余光果甘草渣重量的20-30倍），在90±5℃条件下加热回流2-3h，得到一次水提物（指第一次水提得到的提取液）和第一次水提后的光果甘草渣（指第一次水提后残留的光果甘草渣），再进行第二次水提：向第一次水提后的光果甘草渣加入第一次水提后的光果甘草渣重量的20-30倍的水，在90±5℃条件下加热回流2-3h，得到二次水提物（指第二次水提得到的提取液）和第二次水提后的光果甘草渣（指第二次水提后残留的光果甘草渣）；一次水提物和二次水提物均为提取液；合并一次水提物和二次水提物，同时合并步骤2萃取后的水层（即步骤2乙酸乙酯萃取后的下层溶液），得到合并液（即合并液由一次水提物、二次水提物、步骤2萃取后的水层混合而成）；将合并液浓缩至最初体积（指浓缩前，合并液的体积）的0.1-0.3倍，得到浓缩液（因此，浓缩液的体积为合并液体积的0.1-0.3倍）；加入浓缩液重量0.1-0.5%的活性炭（即活性炭重量为浓缩液重量的0.1-0.5%），在70-80℃条件下加热50-70min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物（指浓缩液加入活性炭并加热、过滤、滤液浓缩所得到的不流动的膏状物）5-10倍的95%乙醇（倍数为重量体积倍数，95%乙醇体积：膏状物重量=5-10:1，例如膏状物为1kg，需加入5-10L的95%乙醇，95%乙醇由体积比为95:5的乙醇与水组成），充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，对沉淀物冷冻干燥，即得甘草多糖。
一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的制备方法，具体包括以下步骤：
1、提取：称取光果甘草渣适量，加入10-20倍80%-95%乙醇，在连续回流提取装置中，于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到一次提取液以及一次提取后的光果甘草渣；放出一次提取液，再对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入10-20倍80%-95%乙醇，于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到二次提取液以及剩余光果甘草渣；合并一次提取液和二次提取液得到合并后的提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩至膏状物。
2、萃取：取1步中的浓缩物（即膏状物），加重量为膏状物的20-30倍水，搅拌溶解（为絮状物，搅拌使其悬浮即可）加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取（实现分层，分为上层溶液和下层溶液，下层溶液即水层，用于步骤5），取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位。
3、纯化：选用大孔树脂填充柱，对乙酸乙酯部位粗分，包括一次纯化步骤和二次纯化步骤：
一次纯化：将乙酸乙酯部位加入8-10倍量的95%乙醇（倍数指重量体积比，95%乙醇体积：乙酸乙酯部位重量=8-10：1，例如1kg乙酸乙酯部位需加入8-10L 95%乙醇），溶解（如有不溶物，适当提高乙醇加入量，如还有不溶物，过滤），上样，一次纯化大孔树脂量是乙酸乙酯部位量的10-15倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（洗脱时，对洗脱溶剂的体积没有要求，利用TLC监控，乙醇浓度先低后高，即先滴入10%乙醇，再滴入20%乙醇，然后滴入40%乙醇，再滴入60%乙醇，之后滴入80%乙醇，最后滴入95%乙醇，洗脱速率无具体要求，一滴连着一滴，不要流成一条线即可），利用TLC薄层鉴别，60%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；
二次纯化：取样品A，加入5-8倍量的95%乙醇（倍数指重量体积比，95%乙醇体积：样品A重量=5-8：1，例如1kg样品A需加入5-8L 95%乙醇），溶解（如有不溶物，适当提高乙醇加入量，如还有不溶物，过滤），上样，二次纯化大孔树脂量是样品A量的15-20倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（洗脱时，对洗脱溶剂的体积没有要求，利用TLC监控，乙醇浓度先低后高，即先滴入20%乙醇，再滴入40%乙醇，然后滴入60%乙醇，再滴入70%乙醇，之后滴入80%乙醇，最后滴入95%乙醇，洗脱速率无具体要求，一滴连着一滴，不要流成一条线即可），利用TLC薄层鉴别，70%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B。液相检测，光甘草定含量大于40%。
4、精制：取样品B，加入5-8倍量的甲醇（倍数指重量体积比，甲醇体积：样品B重量=5-8：1，例如1kg样品B需加入5-8L甲醇），溶解（如有不溶物，适当提高甲醇加入量，如还有不溶物，过滤），利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料量为样品B量的15-20倍，洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇（洗脱时，对洗脱溶剂的体积没有要求，利用TLC监控，甲醇浓度先低后高，即先滴入20%甲醇，再滴入40%甲醇，然后滴入50%甲醇，再滴入60%甲醇，之后滴入70%甲醇，最后滴入纯甲醇，洗脱速率无具体要求，一滴连着一滴，不要流成一条线即可），利用TLC薄层鉴别，60%甲醇馏分和70%甲醇馏分均含有光甘草定，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。液相检测，光甘草定含量大于90%。
20%甲醇（甲醇与水的体积比为20:80）、40%甲醇（甲醇与水的体积比为40:60）、50%甲醇（甲醇与水的体积比为50:50）、60%甲醇（甲醇与水的体积比为60:40）、70%甲醇（甲醇与水的体积比为70:30）中百分比为体积比。
纯化和精制步骤中大孔树脂和反相硅胶填料，可以多次重复使用。
5、甘草多糖的提取：取第1步提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的20-30倍的水，在90±5℃条件下加热回流2-3h，放出液体（一次水提物），对第一次水提后的光果甘草渣进行第二次水提，方法同第一次水提，合并两次水提物，同时合并第2步萃取后的水层，浓缩至最初体积的0.1-0.3倍，加入浓缩液重量0.1-0.5%的活性炭，在70-80℃条件下加热50-70min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物5-10倍（这里的倍数为重量体积比，95%乙醇：膏状物重量=5-10:1，例如膏状物为1kg，需95%乙醇5-10L）的95%乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，冷冻干燥，即得甘草多糖。利用紫外-可见分光光度计进行含量检测，甘草多糖含量大于60%。
优选地，步骤1）中，乙醇含量为85-95%，倍量为10-15倍。步骤2）中，水的加入量为膏状物的25-30倍。步骤3）中，一次纯化大孔树脂为AB-8、D-101、XAD-16、HPD-600和H3520中的任一种，二次纯化大孔树脂为AB-8、D-101和HPD-600中任一种。步骤5）中，第一次水提和第二次水提的提取温度均为90-95℃，提取时间均为2.5h-3h，活性炭使用量为浓缩液重量的0.1-0.3%。
本发明采用的原料-光果甘草渣，是由光果甘草经过提取甘草酸后所得的甘草渣，其为现有技术，不再赘述。该原料可以直接商业化购买或自制。
与现有技术比，本发明所述的方法流程清晰、方法易操作、成本低，纯化得到的产品颜色好、纯度高。同时最大限度的利用甘草，避免浪费。
附图说明
图1为光甘草定对照品的液相色谱图；
图2为实施例1中样品B的液相检测结果图；
图3 为实施例1中样品C的液相检测结果图；
图4为光果甘草渣的液相检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明不局限于下述具体实施例。
图1为光甘草定对照品的液相色谱图，其为光甘草定对照品（该对照品中光甘草定浓度为0.1mg/ml）的液相检测结果，用于实现光甘草定的定位；图2为实施例1样品B的液相检测结果图；图3为实施例1样品C的液相检测结果图； 图4为光果甘草渣的液相检测结果图，说明光草甘草渣中含有光甘草定。
实施例1：
1、提取：先进行第一次提取：称取光果甘草渣10kg，加入10倍95%乙醇，在连续回流提取装置中，于70℃条件下加热回流2h，得到一次提取液以及一次提取后的光果甘草渣，放出一次提取液；对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入10倍95%乙醇，于70℃条件下加热回流2h，得到二次提取液以及剩余光果甘草渣；合并一次提取液和二次提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩至膏状。
2、萃取：取1步中的浓缩物，加重量为膏状物的25倍水，搅拌溶解（为絮状物，搅拌使其悬浮即可）加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位。
3、纯化：即选用D-101大孔树脂填充柱（一次纯化大孔树脂和二次纯化大孔树脂均为D-101，两次纯化均采用D-101大孔树脂填充柱），对乙酸乙酯部位粗分；
一次纯化：将乙酸乙酯部位加入10倍量的95%乙醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），上样，D-101大孔树脂量是乙酸乙酯部位量的10倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇的体积分别为2个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、3个柱体积、3个柱体积、5个柱体积，此洗脱过程中流速均为3.6ml/min），，利用TLC薄层鉴别，60%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；
二次纯化：取样品A，加入8倍量的95%乙醇，溶解，上样，D-101大孔树脂量是样品A量的15倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇的体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、3个柱体积、3个柱体积、4个柱体积,此洗脱过程中流速均为3.0ml/min），利用TLC薄层鉴别，70%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B。液相检测，光甘草定含量为46%，重量为201g，提取率为90%。
4、精制：取样品B，加入5倍量的甲醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料量为样品B量的15倍，洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇（20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇的体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、4个柱体积、5个柱体积，此洗脱过程中流速均为2.4ml/min），利用TLC薄层鉴别，60%甲醇馏分和70%甲醇馏分均含有光甘草定，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并，60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。液相检测，光甘草定含量92%，重量为90g，提取率为90%。
5、甘草多糖的提取：进行第一次水提：取第1步提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的20倍的水，在95℃条件下加热回流2.5h，得到一次水提物和第一次水提后的光果甘草渣，放出液体（一次水提物）；再进行第二次水提，第二次水提的过程为：向第一次水提后的光果甘草渣加入其重量的20倍的水，在95℃条件下加热回流2.5h，得到二次水提物和第二次水提后的光果甘草渣；合并一次水提物和二次水提物，同时合并第2步萃取后的水层，浓缩至最初体积的0.1倍，加入溶液（即浓缩液）重量0.1%的活性炭，在70℃条件下加热70min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物5倍的95%乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，对沉淀物冷冻干燥，即得甘草多糖1420。利用紫外-可见分光光度计进行含量检测，甘草多糖含量65%。
实施例2：
1、提取：先进行第一次提取：称取光果甘草渣10kg，加入12倍90%乙醇，在连续回流提取装置中，于73℃条件下加热回流2.5h，得到一次提取液以及一次提取后的光果甘草渣，放出一次提取液；对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入12倍90%乙醇，于73℃条件下加热回流2.5h，得到二次提取液以及剩余光果甘草渣；合并一次提取液和二次提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩至膏状。
2、萃取：取1步中的浓缩物，加重量为膏状物的30倍水，搅拌溶解（为絮状物，搅拌使其悬浮即可）加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位。
3、纯化：选用AB-8大孔树脂填充柱，对乙酸乙酯部位粗分：将乙酸乙酯部位加入8倍量的95%乙醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），上样，AB-8大孔树脂量是乙酸乙酯部位量的13倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（体积分别为2个柱体积、2个柱体积、2.5个柱体积、3个柱体积、3.5个柱体积、5个柱体积，流速为3.4ml/min），利用TLC薄层鉴别，60%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；取样品A，加入8倍量的95%乙醇，溶解，上样，AB-8大孔树脂量是样品A量的18倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、4个柱体积、4个柱体积,流速为3.0ml/min），利用TLC薄层鉴别，70%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B。液相检测，光甘草定含量为48%，重量为190g，提取率为91%。
4、精制：取样品B，加入8倍量的甲醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料量为样品B量的18倍，洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇（体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、1个柱体积、5个柱体积、5个柱体积，流速为2.4ml/min），利用TLC薄层鉴别，60%甲醇馏分和70%甲醇馏分均含有光甘草定，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并，60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。液相检测，光甘草定含量91%，重量为90g，提取率为89%。
5、甘草多糖的提取：先进行第一次水提：取第1步提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的30倍的水，在90℃条件下加热回流3h，得到一次水提物和第一次水提后的光果甘草渣，放出液体（一次水提物），再进行第二次水提，第二次水提的过程为：向第一次水提后的光果甘草渣加入其重量的30倍的水，在90℃条件下加热回流3h，得到二次水提物和第二次水提后的光果甘草渣；合并一次水提物和二次水提物，同时合并第2步萃取后的水层，浓缩至最初体积的0.2倍，加入溶液（即浓缩液）重量0.2%的活性炭，在75℃条件下加热60min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物8倍的95%乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，冷冻干燥，即得甘草多糖1470g。利用紫外-可见分光光度计进行含量检测，甘草多糖含量63%。
实施例3：
1、提取：称取光果甘草渣10kg，加入15倍85%乙醇，在连续回流提取装置中，于75℃条件下加热回流3h，得到一次提取液以及一次提取后的光果甘草渣，放出一次提取液，此为第一次提取过程；再对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入15倍85%乙醇，于75℃条件下加热回流3h，得到二次提取液以及剩余光果甘草渣；合并一次提取液和二次提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩至膏状。
2、萃取：取1步中的浓缩物，加重量为膏状物的28倍水，搅拌溶解（为絮状物，搅拌使其悬浮即可）加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位。
3、纯化：选用HPD-60大孔树脂填充柱，对乙酸乙酯部位粗分：将乙酸乙酯部位加入8倍量的95%乙醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），上样，HPD-60大孔树脂量是乙酸乙酯部位量的15倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、4个柱体积、5个柱体积，流速为4.0ml/min），利用TLC薄层鉴别，60%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；取样品A，加入8倍量的95%乙醇，溶解，上样，HPD-60大孔树脂量是样品A量的20倍（重量），洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇（体积分别为1.5个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、2.5个柱体积、4个柱体积、4个柱体积,流速为3.6ml/min），利用TLC薄层鉴别，70%乙醇馏分和80%乙醇馏分均含有光甘草定，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B。液相检测，光甘草定含量为45%，重量为195g，提取率为88%。
4、精制：取样品B，加入8倍量的甲醇，溶解（有极少量不溶物，过滤），利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料量为样品B量的20倍，洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇（体积分别为1个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、2个柱体积、3.5个柱体积、5个柱体积，流速为2.0ml/min），利用TLC薄层鉴别，60%甲醇馏分和70%甲醇馏分均含有光甘草定，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并，60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。液相检测，光甘草定含量92%，重量为83g，提取率为87%。
5、甘草多糖的提取：取第1步提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的20倍的水，在93℃条件下加热回流170min，得到一次水提物和第一次水提后的光果甘草渣，放出液体（一次水提物），此为第一次水提的过程。再进行第二次水提：向第一次水提后的光果甘草渣加入其重量的20倍的水，在93℃条件下加热回流170min，得到二次水提物和第二次水提后的光果甘草渣；合并一次水提物和二次水提物，同时合并第2步萃取后的水层，浓缩至最初体积的0.2倍，加入溶液（即浓缩液）重量0.3%的活性炭，在80℃条件下加热50min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物10倍的95%乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，冷冻干燥，即得甘草多糖1440g。利用紫外-可见分光光度计进行含量检测，甘草多糖含量为65%。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、提取：称取光果甘草渣适量，采用乙醇进行第一次提取和第二次提取，合并两次提取液，合并后的提取液浓缩至膏状物；
2、萃取：取步骤1中的膏状物，加水，通过搅拌使膏状物悬浮，加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位；
3、纯化：用大孔树脂填充柱，对乙酸乙酯部位粗分：
a.一次纯化：将乙酸乙酯部位加入8-10倍量的95%乙醇，溶解，上样，一次纯化大孔树脂的重量是乙酸乙酯部位重量的10-15倍，洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇，收集60%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；
b．二次纯化：取样品A，加入5-8倍量的95%乙醇，溶解，上样，二次纯化大孔树脂重量是样品A重量的15-20倍，洗脱溶剂为乙醇-水，比例依次为20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和95%乙醇，收集70%乙醇馏分和80%乙醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品B；
4、精制：取样品B，加入5-8倍量的甲醇，溶解，利用反相色谱柱分离，反相硅胶填料重量为样品B重量的15-20倍，洗脱溶剂为甲醇-水，依次为20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和纯甲醇，收集60%甲醇馏分和70%甲醇馏分，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得样品C；液相检测，样品C中光甘草定含量大于90%；
5、甘草多糖的提取：取经步骤1提取后的剩余光果甘草渣，加入水并在90±5℃条件下进行第一次水提和第二次水提，合并两次水提物，同时合并步骤2萃取后的水层，浓缩，加入活性炭，加热，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，对沉淀物冷冻干燥，即得甘草多糖。
2.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤1具体为：
进行第一次提取：称取光果甘草渣适量，加入10-20倍80%-95%乙醇，于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到一次提取液以及一次提取后的光果甘草渣；放出一次提取液，再对一次提取后的光果甘草渣进行第二次提取，第二次提取的过程为：向一次提取后的光果甘草渣加入10-20倍80%-95%乙醇，于70-75℃条件下加热回流2-3h，得到二次提取液以及剩余光果甘草渣；合并一次提取液和二次提取液得到合并后的提取液，合并后的提取液在75±2℃条件下浓缩得到膏状物。
3.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤2具体为：
取步骤1得到的膏状物，加重量为膏状物的20-30倍的水，通过搅拌使膏状物悬浮，加入同体积的乙酸乙酯，充分搅拌，萃取，取上层溶液，在75±2℃条件下浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位；同体积指乙酸乙酯的体积与水的体积相同。
4.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤3中，70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品A；70±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品B；步骤4中， 60±2℃减压浓缩，冷冻干燥，得样品C。
5.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤3中，经液相检测，样品B中光甘草定含量大于40%。
6.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤5具体为：进行第一次水提：取步骤1提取后的剩余光果甘草渣，加入剩余光果甘草渣重量的20-30倍的水，在90±5℃条件下加热回流2-3h，得到一次水提物和第一次水提后的光果甘草渣，再进行第二次水提：向第一次水提后的光果甘草渣加入第一次水提后的光果甘草渣重量的20-30倍的水，在90±5℃条件下加热回流2-3h，得到二次水提物和第二次水提后的光果甘草渣；一次水提物和二次水提物均为提取液；合并一次水提物和二次水提物，同时合并步骤2萃取后的水层，得到合并液；将合并液浓缩至最初体积的0.1-0.3倍，得到浓缩液；加入浓缩液重量0.1-0.5%的活性炭，在70-80℃条件下加热50-70min，过滤，滤液浓缩至不流动的膏状，加入膏状物5-10倍的95%乙醇，充分搅拌，静置过夜，过滤沉淀物，对沉淀物冷冻干燥，即得甘草多糖。
7.根据权利要求2所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤1中，乙醇含量为85-95%，倍量为10-15倍。
8.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤2中，水的加入量为膏状物的25-30倍。
9.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤3中，一次纯化大孔树脂为AB-8、D-101、XAD-16、HPD-600和H3520中的任一种，二次纯化大孔树脂为AB-8、D-101和HPD-600中任一种。
10.根据权利要求1所述的一种从光果甘草渣制备光甘草定和甘草多糖的方法，其特征在于，步骤5中，第一次水提和第二次水提的提取温度均为90-95℃，提取时间均为2.5h-3h，活性炭使用量为浓缩液重量的0.1-0.3%。
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