CN112656828A

CN112656828A - 一种三七叶产品

Info

Publication number: CN112656828A
Application number: CN202011047152.9A
Authority: CN
Inventors: 李绪文; 金永日; 桂明玉
Original assignee: Jilin Ruinuo Technology Co ltd
Current assignee: Jilin Ruinuo Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112656828B

Abstract

本发明涉及一种利用三七叶制备的富含稀有人参皂苷的产品及其制备方法和用途。该产品中稀有人参皂苷含量高，基本不含常见人参皂苷。制备方法简单、无需使用有机溶剂、无溶剂残留。同时还提供一种具有优异抗肿瘤效果的稀有人参皂苷组合物。

Description

一种三七叶产品

技术领域

本发明涉及一种以三七叶为原料制备的产品，特别是一种富集稀有人参皂苷的三七叶产品。

背景技术

三七叶为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥叶，始载于《本草纲目》，其茎叶可供药用。三七叶具有止血、消肿、止痛之功效，对吐血、外伤出血、痈肿毒疮等具有很好的治疗作用。文献报道三七叶中含有多种活性成分，包括皂苷、黄酮、糖等多类化合物。现代药理研究表明，三七叶具有镇静、镇痛、降血脂、抗炎等药理作用。三七叶总皂苷为主要活性物质，其中人参皂苷Rb₃为主要成分。

20世纪60年代，研究发现，人参皂苷具有抗癌活性，人参皂苷成为抗癌天然药物研究的一个热门领域。后来，研究发现，人参皂苷经过转化后的次级代谢衍生物具有更强的生物活性(刘蓉：生物转化技术制备稀有人参皂苷的研究进展)。这种次级代谢衍生物被命名为“稀有人参皂苷”，目前，已经发现了60多种稀有人参皂苷，其中包括Rk₂、Rg₃、Rh₂、Rg₅、Rh₁、Rh₃、Rk₁等多种具备不同抗癌活性的稀有人参皂苷。与稀有人参皂苷相对应人们把直接从五加科植物中提取出来的人参皂苷称为“原型人参皂苷”，把其中含量较高的人参皂苷称为常见人参皂苷，主要有Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd等。

稀有人参皂苷是人参皂苷中的重要活性成分。研究表明，稀有人参皂苷除了具有较强的抗肿瘤作用外还具有降血压、提高免疫力、抗炎等多种药理活性。三七叶中稀有人参皂苷的含量很少或根本不含，因此至今为止尚没有含有大量稀有人参皂苷的三七叶产品问世。

2000年，我国已经批准人参皂苷Rg3为处方药，2006年，我国研发的人参皂苷Rh2药品也已批准上市。但在稀有人参皂苷的产业化方面仍处于起步阶段，国内生产高纯度人参皂苷单体的企业严重不足，具备稀有人参皂苷产业化生产能力的企业更少。主要原因是：由于稀有人参皂苷为人参皂苷的次级代谢产物，不仅含量非常少，而且制备困难，分离工艺复杂，收率低。未来抢先具备产业化生产稀有人参皂苷能力的企业必然具有市场话语权。由于三七叶中基本不含稀有人参皂苷，因此只能通过诸如化学反应、生物转化等手段获得这些皂苷。只有积极开展稀有人参皂苷的转化研究才能对大规模产业化制备稀有人参皂苷提供必要的技术支持。

人参皂苷的转化方法主要包括化学法、微生物法和酶法。微生物法和酶法因其具有对环境友好、专一性强、转化效率高等优点被科研人员广泛使用。

化学法：由于人参皂苷连接的糖基在遇到酸或碱时糖苷键会发生断裂。在较温和的条件下，人参皂苷的糖苷键依次断裂，得到相应的次生人参皂苷，但若是水解反应的条件过于剧烈，例如使用硫酸或盐酸等强酸作为反应试剂时，人参皂苷的糖链部分会发生完全水解得到人参皂苷元即原人参二醇，甚至得到苷元的结构发生改变了的人参二醇。郭迎迎等将人参皂苷Rd溶解于pH为2.0的甲酸溶液中，60℃水浴加热5h，利用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术对人参皂苷Rd酸水解产物进行分离鉴定，通过水解产物的鉴定推断了人参皂苷Rd的化学转化方式。宋长春等将西洋参茎叶总皂苷利用氢氧化钠加热碱水解，然后再利用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析以及重结晶等方法，制备得到了纯度较高的人参皂苷20(S)人参皂苷Rh₁和20(S)人参皂苷Rh₂。

微生物转化法：微生物转化人参皂苷是指利用微生物在适宜的条件下，将底物经过特殊的代谢途径转化为目标产物的过程。近年来，利用微生物转化人参皂苷而提高其药理活性越来越受到人们的关注。微生物转化法具有操作简单，条件温和，人参皂苷的转化效率高，无需提纯粗酶和不会带来二次污染等优点。自1987至今已经对多种天然来源的人参皂苷单体或总皂苷进行了微生物转化的研究。蔡小雨等通过药用真菌发酵，显著提高了西洋参总皂苷中稀有人参皂苷的含量，总皂苷中稀有人参皂苷的含量增加了20-150％，稀有人参皂苷F₁、C-K和Rg₂等人参皂苷含量明显升高。明有山等筛选出一株霉菌，水解人参皂苷Re生成Rg₁，经过制备柱层析得到纯度为81.98％的人参皂苷Rg₁，产率为71.83％。于珊珊等从土壤中筛选出了一种TH-20菌株，能够同时转化二醇型和三醇型人参皂苷，可分别将Rb₁、Re和Rg₁转化为Rd、Rg₂和PPT。金艳等从橙汁中分离到的菌株CZ2能够转化人参皂苷Rb₁生成F₂、Gyp-XVII。张丽娜等以西洋参提取物为底物进行微生物转化人参皂苷研究，利用高效液相色谱(HPLC)法对人参皂苷Re及其发酵产物进行分析，结果表明，高效菌株S329可以将人参皂苷Re转化人参皂苷Rh₁，转化率为27.65％。Cui Lei等利用内生菌JG09将人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、Rg₁转化为相应稀有人参皂苷F₂、C-K和Rh₁，人参皂苷F₂和C-K的最大转化率分别可达到94.53％和66.34％

酶转化法：由于酶法具有专一性强、反应条件温和、转化效率高、无污染等优点，在人参皂苷的结构修饰和代谢研究中被认为是最有效的工具。利用糖苷酶对糖链进行结构修饰来改善化合物的生物活性，以满足医药行业的发展，也是目前人参皂苷研究的重点。Shin等发现热解纤维菌中的葡萄糖苷水解酶能够水解皂苷C-20位外侧的L-阿拉伯糖和D-葡萄糖，因此，含有L-阿拉伯糖的人参皂苷Rc可以通过这种酶转化成C-K。童庆宣等利用一种蜗牛酶，转化三七叶二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷C-K，经硅胶柱分离得到纯度高于98％的人参皂苷C-K。王宇等利用糖苷酶对三七叶三醇型人参皂苷进行转化，制备了稀有人参皂苷F₁和Rh₁。目前，以常见人参皂苷作为底物并对其进行修饰，是稀有人参皂苷制备的有效途径。以人参皂苷Rb₂、Rb₃和Rc为底物，对其进行C-3位和C-20位的修饰，能够得到不同种类的稀有人参皂苷如Rg₃、Rh₂、F₂和PPD等产物。这些稀有人参皂苷的制备工艺越来越完善，其药理活性也较为清晰。

中国专利CN109824750A中公开了一种以三七叶总皂苷为原料制备稀有人参皂苷方法，该方法以三七叶总皂苷为原料，经过溶解、阳离子催化树脂催化、浓缩水解、真空减压干燥或冷冻干燥得到稀有人参皂苷总产物。此方法需要经过多步反应，工艺复杂，成本较高，且容易引入有害物质。

中国专利CN101139562A中以真菌发酵转化三七叶总皂苷制备稀有人参皂苷，其制备工艺较为复杂，且其生产的主要为稀有人参皂苷Compound K即C-K。

化学法转化稀有人参皂苷存在反应条件难以控制、产物复杂、污染环境等弊端；酶法存在对温度敏感，经常导致失活，对反应条件具有较高要求的缺陷，而微生物转化存在选择性差、微生物不易获得且有些微生物不可以应用到食品工业中等缺点。

更为重要的是上述三种方法中无论是化学法、微生物法还是酶法，获得的是人参皂苷皂苷元结构未发生改变的次级人参皂苷，主要是20(S)/R-Rg₂、20(S)/R-Rh₁、20(S)/R-Rh₂、20(S)/R-Rg₃、PPD、PPT、C-K、Rs₁、Rs₂、C-Y等，并不能获得人参皂苷的皂苷元结构发生改变了的Δ20(21)-和Δ20(22)稀有人参皂苷Rg₆、F₄、Rk₃、Rh₄、Rk₁、Rg₅、Rk₂、Rh₃等稀有人参皂苷。

到目前为止如何有效利用三七叶，以及如何获得稀有人参皂苷含量高的三七叶产品，现有技术中并没有好的解决方案。

因此现有技术中急需一种简便、容易实施、污染小、有机溶剂使用少、纯天然的三七叶加工方法，其可以增加稀有人参皂苷的含量，提高三七叶的生物活性。

发明内容

现有技术中三七叶的加工产品，有药材三七叶、三七叶提取物、三七叶总皂苷以及由此获得的有效部位或单体等。三七叶提取物的制备方法一般是用水或乙醇水进行提取，弃掉药渣，提取液直接回收溶剂，真空干燥后获得提取物；三七叶总皂苷的制备方法一般是用水进行提取，提取液利用大孔吸附树脂吸附其中的人参皂苷，再用乙醇将人参皂苷洗脱下来后减压回收乙醇，真空干燥，获得三七叶总皂苷。有效部位或单体一般是进一步利用柱层析等方法从总皂苷中获得。

CN109481483A中将三七叶与水混合进行煎煮，过滤，得到的滤液用大孔吸附树脂吸附滤液中的有效成分，然后用体积分数50-80％的乙醇进行洗脱，减压回收乙醇，真空干燥，获得得到富含三七叶皂苷Rb₃的洗脱液；该制备方法利用的是水提取液，药渣当做废物被弃去。

本课题组长期从事三七叶中人参皂苷的提取以及含量测定，总皂苷、有效部位以及单体的制备等多项研究工作，在用水回流提取三七叶中的人参皂苷时，意外发现，随着加热回流时间的延长，水液中的常见人参皂苷含量不升反降；水液中开始出现稀有人参皂苷且其含量早期逐渐升高，后期逐渐降低，最终基本消失的变化规律；而药渣中的常见人参皂苷含量符合预期地一直降低直至消失，但同样意外地药渣中开始出现稀有人参皂苷且其含量逐渐升高，升高到一定数值后基本保持不变。具体地加热至一定时间后，尤其是常压48小时后，水相和药渣中基本不含常见人参皂苷，药渣中的稀有人参皂苷的含量达到较高水平，以Rh₂为例，可以达到1％或2％以上。

在这种意想不到的实验结果的启发下通过大量的研究筛选过程，完成了本发明。

稀有人参皂苷包括20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂、Rh₃，常见人参皂苷包括Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。

本申请提供了一种以三七叶为原料制备的产品，包含比天然三七叶具有更高含量的稀有人参皂苷，基本不含有常见人参皂苷。

所述产品优选的为药渣。

上述产品中包括多种稀有人参皂苷，具体的可以为20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂、Rh₃中的一种或多种，上述产品中基本不含有常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。

优选的稀有人参皂苷的总量高于5％，优选的为高于7％或9％。

优选的稀有人参皂苷中Rh₂含量高于1％，更优选的高于2％。

优选的稀有人参皂苷中Rg₃含量高于2％，更优选的高于3％。

优选的稀有人参皂苷中Rg₅含量高于1％。

优选的常见人参皂苷总含量低于1％，更优选的低于0.8％或0.6％，最优选的低于0.4％和0.3％。

优选的常见人参皂苷Rc含量低于1％，更优选的低于0.8％或0.6％，最优选的低于0.4％和0.3％。

优选的常见人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rd各自的含量低于0.5％，更优选的低于0.4％或0.3％，最优选的低于0.2％、0.1％或0.05％。

本申请还涉及一种制备高含量稀有人参皂苷的产品的制备方法，其制备方法为以下的任一一种：

A：将三七叶干燥粉碎，加入适量水，在常压下加热回流48小时以上，优选的为60小时、72小时、84小时、96小时108小时或120小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；

B：将三七叶干燥粉碎，加入适量水，高温高压下煎煮2小时以上，优选的4小时以上，优选的为6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上、16小时以上、18小时以上、20小时以上、22小时以上、24小时以上、28小时以上、30小时以上、32小时以上、34小时以上、36小时以上、38小时以上、40小时以上、42小时以上、44小时以上、48小时以上或者50小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品。

所述的高温是指100℃以上，优选的为不低于110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、或150℃。

在制备方法A中，液料比可以为(30-5):1，优选的为(25-8):1，更优选的为(20-9):1或(15-10):1，优选为10:1。

在制备方法B中，液料比可以为(30-5):1，优选的为(25-6):1，更优选的为(20-7):1或(18-10):1，优选为15:1。

在制备方法A中，优选的为将三七叶先用水浸泡；更优选的为将三七叶浸泡6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上或24小时以上，然后进行加热回流；加热回流结束后趁热过滤，最优选的为加热回流结束后立即趁热过滤。

在制备方法B中，优选的为先将水加热后投料，优选的为将水加热至60℃以上后投料，更优选的为将水加热至90℃后加料；最优选的为先将水加热至100℃后加料。煎煮结束后趁热过滤，最优选的为煎煮结束后立即趁热过滤。

所述药渣中20(S)-Rg₃含量范围为0.2％-2.0％；20(R)-Rg₃含量范围为0.2％-1.0％；Rk₁含量范围为0.1％-1.0％；Rg₅含量范围为0.1％-1.5％；20(S)-Rh₂含量范围为0.2％-2.5％；20(R)-Rh₂含量范围为0.2％-2.5％；Rk₂含量范围为0.09％-1.5％；Rh₃含量范围为0.15％-2.0％。

任选的对药渣进行进一步制备，可以为粉剂、散剂、饮片、糖浆、口服液、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、缓释剂、速释剂、控释剂、注射液、注射粉针剂、贴剂、栓剂、滴剂。

任选的对药渣进一步地有机溶剂或含水有机溶剂提取，得到具有高含量稀有人参皂苷的提取物。

优选的提取物中含有多种稀有人参皂苷，具体的可以为20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂、Rh₃中的一种或多种，稀有人参皂苷的总含量超过15％、20％、25％、28％、29％或30％。优选的，提取物中Rg₃的含量不低于4％、6％、7％或8％；和/或Rg₅的含量不低于2％；和/或Rh₂的含量不低于9％、10％、11％或12％；和/或Rk₂的含量不低于2％或3％；和/或Rh₃的含量不低于4％或5％。

更优选的，提取物中基本不含有常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。常见人参皂苷的含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。更优选的，低于0.8％、0.6％、0.5％、或0.1％。

所述有机溶剂可以为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、丙酮。

所述提取物中20(S)-Rg₃含量范围为2％-5％；20(R)-Rg₃含量范围为2％-5％；Rk₁含量范围为1％-3％；Rg₅含量范围为2％-5％；20(S)-Rh₂含量范围为4％-8％；20(R)-Rh₂含量范围为4％-8％；Rk₂含量范围为2％-4％；Rh₃含量范围为3％-6％。

本申请还提供了一种组合物，该组合物中包含稀有人参皂苷，优选的，该组合物具有协同抗肿瘤活性。

所述稀有人参皂苷包含Rg₃和Rg₅的组合物，其重量比为(1-20)：(1-20)，优选的为(1-10)：(1-10)、(6-9)：(3-5)、(4-8)：(2-4)；

所述稀有人参皂苷包含Rh₂和Rg₅的组合物，其重量比为(1-20)：(1-10)，优选的为(1-5)：(1-5)、(9-13)：(1-2)。

组合物中的稀有人参皂苷，任选的还包括S-Rg₃、R-Rg₃、Rk₁、Rg₅、S-Rh₂、R-Rh₂、Rk₂、Rh₃中的一种或多种稀有人参皂苷。

优选的，还包括20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂和/或Rh₃。

优选的，所述组合物中，基本不包含常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。常见人参皂苷的含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。更优选的，低于0.8％、0.6％、0.5％、或0.1％。

本发明中所述的Rg₃、Rh₁、或Rh₂包括R构型和/或S构型，R构型和S构型的比例为1:100-100:1，优选的为1：10-10:1，更优选的为1:1。

本发明中所述的Rg₃包括20(S)-Rg₃和/或20(R)-Rg₃；Rh₂包括20(S)-Rh₂和/或20(R)-Rh₂。

本申请还提供了一种包含上述任意一项组合物的三七叶产品，优选的，其是以天然三七叶为原料制备的产品，优选的为药渣或提取物。

优选的，该产品的性能和参数，具备上述任一一项的特征。

上述所述三七叶，包括干燥或新鲜的三七叶。

本申请还提供了上述产品或组合物在治疗和/或预防肿瘤中的用途，所述肿瘤可以为肺癌、结肠癌、神经胶质瘤。

本申请的上述任一产品或组合物，在制备食品、保健食品或者药品中的应用，具体应用于现有技术已知的降血糖、抗疲劳、抗病毒、治疗糖尿病、心血管、中枢神经、生物代谢、生殖功能、免疫功能、肾功能等疾病的食品、保健食品或者药品中；其中可以包含药学或者食品上可接受的载体或者添加剂。

本申请的上述任一产品或组合物，其中可以包含药学上可接受的载体。

任选的，产品或组合物的给药途径可以为口服、注射或经皮给药。

任选的，产品或组合物的剂型为粉剂、散剂、饮片、糖浆、口服液、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、缓释剂、速释剂、控释剂、注射液、注射粉针剂、贴剂、栓剂、滴剂。

附图说明

图1：100℃煎煮三七叶药渣和水中Rg₃含量变化；

图2：100℃煎煮三七叶药渣和水中Rh₂含量变化；

图3：100℃煎煮三七叶药渣和水中Rg₃和Rh₂总量变化；

图4：100℃煎煮三七叶药渣和水中Rk₁和Rg₅总量变化；

图5：100℃煎煮三七叶药渣和水中8种稀有人参皂苷总量变化；

图6：100℃煎煮三七叶药渣和水中7种常见人参皂苷总量变化；

图7A和7B分别为115℃、120℃下药渣中8种稀有人参皂苷总量变化；

图8A和8B分别为125℃、130℃下药渣中8种稀有人参皂苷总量变化；

图9A和9B分别为135℃，140℃下药渣中8种稀有人参皂苷总量变化；

图10为145℃下药渣中8种稀有人参皂苷总量变化；

图11：115℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图12：120℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图13：125℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图14：130℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图15：135℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图16：140℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图17：145℃药渣中Rg₃以及Rh₂含量变化

图18A和18B分别为115℃、120℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；

图19A和19B分别为125℃、130℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；

图20A和20B分别为：135℃，140℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；

图21为145℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明作进一步说明。

高效液相色谱法测定常见人参皂苷含量：

色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，柱温为25℃，流速1ml/min，检测波长203nm，进样量20μL。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～35	19.5	80.5
35～35.1	19.5→20	80.5→80
			35.1～55	20	80
55～55.1	20→29	80→71
			55.1～84	29→36	27→64
84～90	36	64

对照品溶液的制备：

取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成如下浓度的混标溶液：

人参皂苷Rg₁浓度为0.201mg/ml

人参皂苷Re浓度为0.205mg/ml

人参皂苷Rb₁浓度为0.121mg/ml

人参皂苷Rc浓度为0.156mg/ml

人参皂苷Rb₂浓度为0.174mg/ml

人参皂苷Rb₃浓度为0.111mg/ml

人参皂苷Rd浓度为0.201mg/ml

供试品溶液的制备：

1、药渣

取供试品(三七叶药渣)3.0g，精密称定，甲醇回流提取两次，每次2小时，甲醇用量均为250ml，过滤，药渣弃去，滤液减压回收甲醇，残渣用甲醇溶解，定容至100ml容量瓶。

2、水液

取25ml水液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，定容到25ml容量瓶。

高效液相色谱法测定稀有人参皂苷含量：

色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充物(柱长250mm，内径4.6mm，粒度5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，柱温25℃，流速0.8ml/min，检测波长203nm，进样量20μL。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	29	71
10～25	29→40	71→60
			25～50	40→60	60→40
50～60	60→73	40→27
			60～75	73	27

对照品溶液的制备：

取人参皂苷20(S)-Rg₂、人参皂苷20(S)-Rh₁、20(R)人参皂苷R-Rh₁、人参皂苷Rg₆、人参皂苷F₄、人参皂苷Rk₃、人参皂苷Rh₄、人参皂苷20(S)-Rg₃、人参皂苷20(R)-Rg₃、人参皂苷Rk₁、人参皂苷Rg₅、人参皂苷20(S)-Rh₂、人参皂苷20(R)-Rh₂、人参皂苷Rk₂、人参皂苷Rh₃对照品适量，精密称定，加甲醇制成如下浓度的混标溶液：

人参皂苷20(S)-Rg₂浓度为0.2268mg/ml

人参皂苷20(S)-Rh₁浓度为0.1792mg/ml

人参皂苷20(R)-Rh₁浓度为0.1692mg/ml

人参皂苷Rg₆浓度为0.1632mg/ml

人参皂苷F₄浓度为0.1240mg/ml

人参皂苷Rk₃浓度为0.1248mg/ml

人参皂苷Rh₄浓度为0.1256mg/ml

人参皂苷20(S)-Rg₃浓度为0.1296mg/ml

人参皂苷20(R)-Rg₃浓度为0.0596mg/ml

人参皂苷Rk₁浓度为0.1580mg/ml

人参皂苷Rg₅浓度为0.1560mg/ml

人参皂苷20(S)-Rh₂浓度为0.1388mg/ml

人参皂苷20(R)-Rh₂浓度为0.1324mg/ml

人参皂苷Rk₂浓度为0.1324mg/ml

人参皂苷Rh₃浓度为0.0688mg/ml

供试品溶液的制备：

1、药渣

2、水液

实施例1：常压下煎煮三七叶—水液和药渣中人参皂苷分布

以干燥三七叶为原料，称取1200g三七叶，粉碎，加入10倍量的水浸泡12小时，100℃(常压)加热回流提取，在0小时(浸泡12小时开始加热回流前)、开始加热后30min、60min、A(90min，刚开始沸腾)、沸腾后1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、252小时取样，过滤，得水液和药渣，药渣烘干得干燥药渣。以15种稀有人参皂苷和7种常见人参皂苷为标准品，通过HPLC法分析水液和药渣中稀有人参皂苷和常见人参皂苷的含量。1200g人参叶加热回流108小时获得干燥药渣560g，得离心水19800ml。

I、水液中人参皂苷含量变化

表1 100℃回流三七叶252小时水液中常见人参皂苷含量变化(mg/ml，84小时之后均为0)

	0min	30min	60min	沸腾	1h	2h	3h	4h	6h	8h	10h	12h	14h	16h	18h	24h	36h	48h
																			Rg1	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Re	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																			Rb<sub>1</sub>	0.002	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.061	0.000
Rc	0.888	0.768	0.814	0.815	0.973	1.018	1.027	0.448	0.400	0.422	0.383	0.358	0.311	0.246	0.114	0.102	0.059	0.000
																			Rb<sub>2</sub>	0.057	0.031	0.032	0.046	0.058	0.071	0.075	0.160	0.136	0.134	0.127	0.111	0.103	0.096	0.076	0.069	0.050	0.014
Rb<sub>3</sub>	0.243	0.116	0.134	0.187	0.370	0.474	0.522	0.911	0.789	0.780	0.752	0.680	0.611	0.578	0.482	0.423	0.328	0.117
																			Rd	0.016	0.009	0.013	0.013	0.031	0.043	0.050	0.088	0.075	0.079	0.077	0.088	0.067	0.066	0.057	0.074	0.055	0.030
总量(mg/ml)	1.207	0.924	0.993	1.061	1.433	1.606	1.674	1.607	1.400	1.415	1.339	1.237	1.092	0.986	0.729	0.668	0.552	0.161

	60h	72h	84h	96h	108h	120h	132h	144h	156h	168h	180h	192h	204h	216h	228h	240h	252h
																		Rg<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Re	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		Rb<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rc	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		Rb<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rb<sub>3</sub>	0.014	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		Rd	0.007	0.007	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
总量(mg/ml)	0.021	0.007	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

表2 100℃回流三七叶252小时药渣中常见人参皂苷含量变化(％，72小时后均为0)

通过上表，可以看出，沸腾3小时以内，水液中常见人参皂苷的含量逐渐升高，之后常见人参皂苷含量开始下降，60小时仅有2种常见人参皂苷检出，仅为0.021％，84小时无常见人参皂苷检出，之后常见人参皂苷含量检测一直为0。与其相应的三七叶药渣中常见人参皂苷也逐渐降低，72小时仅有2种常见人参皂苷检出，含量为0.072％，84小时常见人参皂苷含量为0，之后常见人参皂苷含量检测一直为0。

表3 100℃回流三七叶252小时水液中15种稀有人参皂苷的含量(mg/ml，)

表4 100℃回流三七叶252小时药渣中15种稀有人参皂苷的含量(％)

	0min	30min	60min	沸腾	1h	2h	3h	4h	6h	8h	10h	12h	14h	16h	18h	24h	36h
																		S-Rg<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		R-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rg<sub>6</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rk<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.002	0.004	0.007	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		Rh<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rg<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.005	0.012	0.016	0.051	0.051	0.092	0.117	0.240	0.169	0.197	0.248	0.382	0.578
																		R-Rg<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.008	0.009	0.011	0.043	0.039	0.069	0.086	0.185	0.199	0.242	0.317	0.502	0.671
Rk<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.002	0.004	0.005	0.015	0.017	0.030	0.040	0.104	0.060	0.080	0.102	0.166	0.262
																		Rg<sub>5</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.002	0.005	0.008	0.028	0.028	0.051	0.066	0.155	0.097	0.115	0.144	0.243	0.376
S-Rh<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.016	0.031	0.041	0.058	0.058	0.108	0.137	0.197	0.206	0.237	0.294	0.257	0.394
																		R-Rh<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.010	0.022	0.031	0.038	0.040	0.077	0.100	0.173	0.256	0.308	0.401	0.349	0.499
Rk<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.007	0.012	0.016	0.006	0.010	0.019	0.025	0.087	0.038	0.040	0.052	0.117	0.175
																		Rh<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.012	0.024	0.030	0.031	0.036	0.070	0.089	0.119	0.131	0.153	0.189	0.190	0.258
Rg<sub>3</sub>总量	0.000	0.000	0.000	0.000	0.013	0.020	0.027	0.094	0.090	0.161	0.203	0.425	0.368	0.439	0.565	0.884	1.249
																		Rh<sub>2</sub>总量	0.000	0.000	0.000	0.000	0.026	0.052	0.071	0.096	0.098	0.185	0.237	0.370	0.462	0.545	0.695	0.606	0.893
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.039	0.073	0.099	0.190	0.188	0.346	0.440	0.795	0.830	0.984	1.260	1.490	2.142
																		Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.003	0.009	0.013	0.043	0.045	0.081	0.106	0.259	0.157	0.195	0.246	0.409	0.638
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
																		总量(％)	0.000	0.000	0.000	0.000	0.063	0.121	0.164	0.270	0.279	0.516	0.660	1.260	1.156	1.372	1.747	2.206	3.213

以稀有人参皂苷Rg₃和Rh₂为例，在回流36小时之前，稀有人参皂苷在水液中的含量都是增高的，之后开始降低，至120小时之后含量很低，可以忽略不计。与之相对应的是，过滤后的药渣中，Rg₃和Rh₂的含量逐渐升高，稀有人参皂苷Rg₃含量接近3％；Rg₃和Rh₂的总量接近5％；稀有人参皂苷中Rk₁和Rg₅总量可以达到2％以上。稀有人参皂苷中Rg₅的含量可以达到1.0％以上。

为了最大限度富集稀有人参皂苷，减少稀有人参皂苷进入水液中造成的损失，同时缩短制备时间，又以三七叶为原料，进行了高温高压煎煮实验。

实施例2：高温高压下煎煮三七叶—水液和药渣中人参皂苷分布

称取三七叶，粉碎，加入适量水，高温高压煎煮，在设定时间点取样，过滤，得水样和药渣，药渣烘干得干燥药渣。通过HPLC法分析水液和干燥药渣中稀有人参皂苷和常见人参皂苷的含量。

煎煮温度分别设计为115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃和145℃，液料比设计为5:1、10:1、15:1，温度设计为3-20小时(与温度有关)进行筛选实验，筛选最佳煎煮工艺。

实验结果表明，高温高压条件下，常见人参皂苷和稀有人参皂苷的变化规律与100℃常压回流相同，只是煎煮时间缩短很多。

以下针对115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃和145℃，液料比设计为15:1下的实验数据进行整理和分析。

表5：115℃高温高压煎煮三七叶药渣中7种常见人参皂苷含量(％)

表6：115℃高温高压煎煮三七叶水中7种常见人参皂苷含量(mg/ml，2h、6h和20小时三个时间点为例)

	2h	6h	20h
				Rg<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000
Re	0.000	0.000	0.000
				Rb<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000
Rc	0.096	0.074	0.000
				Rb<sub>2</sub>	0.025	0.021	0.000
Rb<sub>3</sub>	0.211	0.186	0.000
				Rd	0.019	0.016	0.000
总量(mg/ml)	0.351	0.297	0.000

表7：115℃高温高压煎煮三七叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)

表8：115℃高温高压煎煮三七叶水中15种稀有人参皂苷含量(mg/ml，2h、6h和20小时三个时间点为例)

	2h	6h	20h
				S-Rg<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000
S-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000
				R-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000
Rg<sub>6</sub>	0.000	0.000	0.000
				F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000
Rk<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000
				Rh<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000
S-Rg<sub>3</sub>	0.060	0.114	0.008
				R-Rg<sub>3</sub>	0.026	0.038	0.001
Rk<sub>1</sub>	0.023	0.046	0.002
				Rg<sub>5</sub>	0.027	0.058	0.004
S-Rh<sub>2</sub>	0.036	0.140	0.008
				R-Rh<sub>2</sub>	0.024	0.052	0.002
Rk<sub>2</sub>	0.011	0.045	0.002
				Rh<sub>3</sub>	0.012	0.069	0.004
Rg<sub>3</sub>总量	0.086	0.152	0.009
				Rh<sub>2</sub>总量	0.060	0.192	0.010
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub>	0.146	0.344	0.019
				Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub>	0.050	0.104	0.006
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000
				总量(mg/ml)	0.219	0.562	0.031

通过表5-表8可以看出，在高温高压煎煮下，其常见人参皂苷的变化情况与100℃常压煎煮相似。随着时间的进展，水中和药渣中的常见人参皂苷含量逐渐降低，直至检测不出含量。而水中稀有人参皂苷的变化情况是稀有人参皂苷从无到有，开始时含量逐渐增加，但是增加到一定程度后含量又开始逐渐降低，到了煎煮20小时已经无法检测出来。药渣中的稀有人参皂苷的变化情况是从无到有，开始含量逐渐增加，但是增加到一定程度后不发生含量逐渐降低的情况，而是保持一个相对稳定的数值不变，其最高含量可达到7％以上。在此后的120℃、125℃、130℃、135℃、140℃和145℃实验过程中观察到同样的趋势，只是随着温度的升高，水液中常见人参皂苷和稀有人参皂苷以及药渣中常见人参皂苷消失的时间不断缩短，同时药渣中稀有人参皂苷总量达到峰值的时间也不断缩短。当温度设计成150℃以上时各种人参皂苷的变化规律没有改变，只是药渣中生成的稀有人参皂苷总量明显下降，因此煎煮温度不宜超过150℃。

表9：135℃高温高压煎煮三七叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)

	0min	15min	30min	40min	50min	1h	2h	3h	4h	5h	6h	7h	8h
														S-Rg<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
														R-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rg<sub>6</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
														F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rk<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
														Rh<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rg<sub>3</sub>	0.055	0.107	0.162	0.204	0.239	0.294	0.729	0.832	0.833	0.904	0.851	0.925	0.844
														R-Rg<sub>3</sub>	0.043	0.142	0.287	0.376	0.421	0.293	0.632	0.684	0.705	0.773	0.761	0.880	0.820
Rk<sub>1</sub>	0.014	0.033	0.054	0.077	0.097	0.178	0.388	0.462	0.479	0.559	0.549	0.607	0.582
														Rg<sub>5</sub>	0.026	0.054	0.088	0.107	0.134	0.199	0.493	0.601	0.627	0.751	0.747	0.813	0.796
S-Rh<sub>2</sub>	0.099	0.199	0.315	0.383	0.445	0.557	1.346	1.586	1.592	1.785	1.664	1.797	1.645
														R-Rh<sub>2</sub>	0.079	0.271	0.561	0.735	0.813	0.600	1.222	1.344	1.376	1.507	1.458	1.644	1.517
Rk<sub>2</sub>	0.034	0.073	0.117	0.140	0.173	0.249	0.585	0.701	0.725	0.832	0.812	0.873	0.810
														Rh<sub>3</sub>	0.065	0.134	0.202	0.247	0.298	0.369	0.948	1.164	1.187	1.387	1.349	1.428	1.370
Rg<sub>3</sub>总量	0.098	0.249	0.449	0.580	0.660	0.587	1.361	1.516	1.538	1.677	1.612	1.805	1.664
														Rh<sub>2</sub>总量	0.178	0.470	0.876	1.118	1.258	1.157	2.568	2.930	2.968	3.292	3.122	3.441	3.162
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub>	0.276	0.719	1.325	1.698	1.918	1.744	3.929	4.446	4.506	4.969	4.734	5.246	4.826
														Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub>	0.040	0.087	0.142	0.184	0.231	0.377	0.881	1.063	1.106	1.310	1.296	1.420	1.378
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
														总量(％)	0.415	1.013	1.786	2.269	2.620	2.739	6.343	7.374	7.524	8.498	8.191	8.967	8.384

表10：140℃高温高压煎煮三七叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)

表11 145℃高温高压煎煮三七叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)

	0min	10min	20min	2h	3h	4h	5h	7h
									S-Rg<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									R-Rh<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rg<sub>6</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rk<sub>3</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									Rh<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
S-Rg<sub>3</sub>	0.548	0.599	0.623	0.625	0.631	0.627	0.576	0.518
									R-Rg<sub>3</sub>	0.430	0.492	0.514	0.574	0.649	0.720	0.707	0.763
Rk<sub>1</sub>	0.291	0.332	0.350	0.455	0.520	0.600	0.619	0.706
									Rg<sub>5</sub>	0.373	0.428	0.450	0.591	0.688	0.825	0.873	1.050
S-Rh<sub>2</sub>	1.387	1.495	1.541	1.566	1.579	1.578	1.451	1.306
									R-Rh<sub>2</sub>	1.234	1.396	1.450	1.552	1.672	1.766	1.719	1.751
Rk<sub>2</sub>	0.632	0.690	0.711	0.793	0.858	0.926	0.939	0.992
									Rh<sub>3</sub>	0.980	1.114	1.147	1.314	1.420	1.599	1.647	1.820
Rg<sub>3</sub>总量	0.978	1.091	1.137	1.199	1.280	1.347	1.283	1.281
									Rh<sub>2</sub>总量	2.621	2.891	2.991	3.118	3.251	3.344	3.170	3.057
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub>	3.599	3.982	4.128	4.317	4.531	4.691	4.453	4.338
									Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub>	0.664	0.760	0.800	1.046	1.208	1.425	1.492	1.756
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									总量(％)	5.875	6.546	6.786	7.470	8.017	8.641	8.531	8.906

表12 135℃高温高压煎煮三七叶药渣中7种常见人参皂苷含量(％)

表13 140℃高温高压煎煮三七叶药渣中7种常见人参皂苷含量(％)

	0min	10min	20min	40min	1h	3h	4h	5h	6h	7h	10h
												Rg<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Re	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
												Rb<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rc	0.173	0.130	0.062	0.037	0.021	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
												Rb<sub>2</sub>	0.058	0.039	0.016	0.015	0.009	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rb<sub>3</sub>	0.334	0.231	0.109	0.082	0.057	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
												Rd	0.020	0.016	0.012	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
总量(％)	0.585	0.416	0.199	0.134	0.087	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

表14 145℃高温高压煎煮三七叶药渣中7种常见人参皂苷含量(％)

	0min	10min	20min	2h	3h	4h	5h	7h
									Rg<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Re	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									Rb<sub>1</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rc	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									Rb<sub>2</sub>	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
Rb<sub>3</sub>	0.020	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
									Rd	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
总量(％)	0.020	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

通过上表可以看出，在药渣中不包含常见人参皂苷，其含量为0；在药渣中富集了稀有人参皂苷，其含量逐渐上升。

在140℃条件下，药渣中稀有人参皂苷的总量达到最大值，可以达到9％以上，其最佳煎煮时间分别为6小时或以上。

对于稀有人参皂苷Rg₃来说，最适宜温度为140℃和135℃，其药渣中的含量可以达到1.6％和1.8％；最佳煎煮时间分别为3小时或以上和5小时或以上。

上述实验结果表明，高温高压煎煮比100℃常压回流制备时间更短，制备得到的稀有人参皂苷含量基本一致。

实施例3：降低水中稀有人参皂苷含量的实验条件筛选

比较了常压煎煮时三七叶提取浸泡与否，高温高压煎煮时常温投料与高温投料，煎煮结束后当日离心与次日离心，放凉后离心与趁热离心等因素对水中稀有人参皂苷含量的影响。实验结果表明，趁热立即离心水中的稀有人参皂苷含量更低，药渣中的稀有人参皂苷含量升高。升温60℃以上加料优于常温加料，药渣中的稀有人参皂苷含量升高。100℃常压煎煮三七叶时提前浸泡也可以提高药渣中稀有人参皂苷的含量。

实施例4：从药渣中制备提取物

设定液料比为15:1，取适量三七叶，加水，分别在115℃～145℃下煎煮4～20小时(对应不同的煎煮温度)，过滤，弃去离心水，得到药渣，将药渣干燥后得干燥药渣。

取干燥药渣200g，以10倍量乙醇回流提取5次，提取液减压回收乙醇，真空干燥获得提取物，测定提取物中各种稀有人参皂苷的含量。

药渣产率＝药渣重量/西洋参叶重量×100％

提取物产率＝提取物重量/药渣重量×100％

经HPLC测定，其中主要成分包含8种稀有人参皂苷，基本不含常见人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。

表15：不同温度下煎煮三七叶获得的药渣和提取物质量

表16：提取物中15种稀有人参皂苷的含量(％)：

_____________________________________________________________________

由此可见，在高温高压煎煮下，提取物中的稀有人参皂苷的含量均可以达到29％以上，这是令人惊讶的。且在120℃至125℃时，其含量可以达到32％以上，Rg₃的总量可以达到7％以上，甚至8％以上；Rk₁+Rg₅的总量达到4％以上，甚至达到6％以上。

实施例5：鲜参三七叶常压回流和高温高压实验

以鲜三七叶为原料，100℃加热回流或高温高压煎煮，获得的实验结果其趋势与干燥三七叶相似。水液中常见人参皂苷含量逐渐降低，而药渣中常见人参皂苷含量也逐渐降低，稀有人参皂苷含量逐渐升高。

实施例6：不同比例稀有人参皂苷类成分对于癌细胞的抑制作用

在96孔板中接种A549人肺癌细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO₂)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取物用DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。样本对A549肿瘤细胞IC₅₀值如表17所示。

在96孔板中接种DLD1人结肠癌细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO₂)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取用DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。样本对DLD1肿瘤细胞IC₅₀值如表17所示。

在96孔板中接种U251人胶质瘤细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO₂)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取用DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。24组样本对U251肿瘤细胞IC₅₀值如表17所示。

表17不同比例稀有人参皂苷类组分对于癌细胞的抑制作用

(IC<sub>50</sub>,μg/mL)	A549	DLD1	U251
				Rg<sub>5</sub>	116.30	236.18	108.96
Rg<sub>3</sub>	216.23	169.36	90.65
				F<sub>4</sub>	135.62	265.58	186.42
Rh<sub>2</sub>	105.85	296.81	189.78
				Rh<sub>4</sub>	302.63	198.28	109.49
Rk<sub>3</sub>	264.15	>500	199.35
				Rg<sub>5</sub>:Rg<sub>3</sub>＝10:1	47.26	51.62	46.95
Rg<sub>5</sub>:Rg<sub>3</sub>＝1:10	60.14	43.59	31.29
				Rh<sub>2</sub>:Rg<sub>5</sub>＝15:1	51.33	50.13	47.83
Rh<sub>2</sub>:Rg<sub>5</sub>＝1:10	69.5	56.34	73.45
				140℃提取物	92.65	129.34	88.13

通过筛选试验，筛选出了不同稀有人参皂苷组合中对癌细胞抑制活性较好的组合，其对于三种癌细胞均显示出协同的抗肿瘤活性。

以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代。虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims

1.一种制备高含量稀有人参皂苷产品的方法，其特征在于，其制备方法为A或B：

B：将三七叶干燥粉碎，加入适量水，高温高压下煎煮2小时以上，优选的为4小时以上，优选的为6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上、16小时以上、18小时以上、20小时以上、22小时以上、24小时以上、28小时以上、30小时以上、32小时以上、34小时以上、36小时以上、38小时以上、40小时以上、42小时以上、44小时以上、48小时以上或者50小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；；所述高温为100℃以上，优选的为不低于110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃或150℃。

2.如权利要求1中的制备方法，其特征在于：

3.如权利要求1或2中的制备方法，其特征在于：任选的对药渣进一步地用有机溶剂或含水有机溶剂提取，得到具有高含量稀有人参皂苷的提取物。

4.如权利要求1-3任一项中的制备方法，其特征在于：

提取物或药渣中含有8种稀有人参皂苷，具体的可以为20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂、Rh₃，基本不含有常见人参皂苷，常见人参皂苷包括：Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。

药渣中稀有人参皂苷的总含量高于5％，常见人参皂苷总含量低于1％；

提取物中稀有人参皂苷的总含量不低于15％，常见人参皂苷的总含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

5.一种以三七叶为原料制备的产品，包含高含量的稀有人参皂苷，基本不含有常规人参皂苷；其中稀有人参皂苷包括20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅、20(S)-Rh₂、20(R)-Rh₂、Rk₂、Rh₃中的一种或多种，常见人参皂苷包括：Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd。

6.如权利要求5所述的以三七叶为原料制备的产品，稀有人参皂苷的总含量高于5％，常见人参皂苷总含量低于1％。

7.一种组合物，该组合物中包括稀有人参皂苷，其包含以下任一项所述的组合物：

Rg₃和Rg₅的组合物，其重量比为(1-20)：(1-20)，优选的为(1-10)：(1-10)、(6-9)：(3-5)、(4-8)：(2-4)；

Rh₂和Rg₅的组合物，其重量比为(1-20)：(1-10)，优选的为(1-5)：(1-5)、(9-13)：(1-2)。

8.一种包含权利要求7所述组合物的三七叶产品。

9.如权利要求8所述的三七叶产品，其特征在于为以三七叶为原料制备的药渣或提取物。

10.权利要求5-9中任一项所述的产品或组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。