CN110559688A - 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 - Google Patents
一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110559688A CN110559688A CN201910815896.1A CN201910815896A CN110559688A CN 110559688 A CN110559688 A CN 110559688A CN 201910815896 A CN201910815896 A CN 201910815896A CN 110559688 A CN110559688 A CN 110559688A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- oleanolic acid
- ursolic acid
- mobile phase
- phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 3beta-hydroxyolean-12-en-28-oic acid Chemical class C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 0.000 title claims abstract description 72
- JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N Epioleonolsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4CCC3C21C JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N Oleanolic acid Natural products CC1(C)CC2C3=CCC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC4(C)C3(C)CCC2(C1)C(=O)O YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N Oleanolinsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4=CCC3C21C MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 229940100243 oleanolic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 72
- HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N prosapogenin PS-A Natural products C12CC(C)(C)CCC2(C(O)=O)CCC(C2(CCC3C4(C)C)C)(C)C1=CCC2C3(C)CCC4OC1OCC(O)C(O)C1O HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N (3beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid Chemical class C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N 0.000 title claims abstract description 67
- PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N ursolic acid Chemical class CC1CCC2(CCC3(C)C(C=CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC34C)C2C1C)C(=O)O PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 67
- 229940096998 ursolic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 12
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 10
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 10
- 238000010262 high-speed countercurrent chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 6
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 6
- QSLMXDUZJAJNJO-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate phosphoric acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O.OP([O-])([O-])=O QSLMXDUZJAJNJO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 49
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000219173 Carica Species 0.000 description 2
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 2
- 241001092070 Eriobotrya Species 0.000 description 2
- 235000009008 Eriobotrya japonica Nutrition 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 238000004185 countercurrent chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- FRWNAQDBODEVAL-VMPITWQZSA-N (5e)-5-[(4-nitrophenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=C\1C(=O)NC(=S)S/1 FRWNAQDBODEVAL-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- QNMKGMUGYVWVFQ-UHFFFAOYSA-N 2alpha-Hydroxyursolic acid Natural products CC12CC(O)C(O)C(C)(C)C1CCC1(C)C2CC=C2C3C(C)C(C)(C)CCC3(C(O)=O)CCC21C QNMKGMUGYVWVFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 231100000439 acute liver injury Toxicity 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003579 anti-obesity Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- -1 pentacyclic triterpenoid compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
- B01D15/1807—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using counter-currents, e.g. fluidised beds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/265—Adsorption chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
- C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，所述方法为：在分液漏斗中加入羟丙基‑β‑环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；取齐墩果酸和熊果酸混合物用固定相和流动相的混合溶液溶解，得到样品溶液；取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液注入分离柱，紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，分别合并含目标物质的洗脱液，经后处理得到齐墩果酸、熊果酸；本发明操作简便，高效快捷，溶剂消耗少，齐墩果酸与熊果酸纯度高，且分离过程中样品回收率高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法
(二)背景技术
齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)均为五环三萜类化合物，在自然界中分布很广，两者互为同分异构体，分子式为C30H48O3，仅有一个甲基的位置不同，不易分离。它们在植物中广泛存在而且总是同时存在于同种植物。基于齐墩果酸和熊果酸相近的化学结构，二者通常表现出相同或相似的疗效和生物效应。他们具有抵抗化学致癌物诱导的急性肝损伤，慢性肝纤维和肝硬化的显著保肝作用已广为人知。齐墩果酸和熊果酸的其他许多药理作用已经被报道，如抗氧化，抗炎，抗肿瘤，抗HIV，抗菌，保胃和潜在的抗肥胖作用。鉴于三萜酸类化合物在中草药中的自然丰度低和没有紫外吸收或紫外吸收极低的特点，对齐墩果酸以及熊果酸的研究引起了国内外研究者的广泛关注。
逆流色谱(countercurrent chromatography)，是一种连续的不需要固体载体的现代色谱分离技术，相比高效液相色谱而言，可避免固相吸附带来的污染和样品损失，且进样量大，运行成本低，是分离同分异构体的一种理想的制备色谱技术。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种应用高速逆流色谱分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，利用环糊精对齐墩果酸和熊果酸有不同的识别作用从而将快速两者分开，具有更强的目的性，快捷高效，工艺简单。
本发明的技术方案如下：
一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，所述方法为：
(1)在分液漏斗中加入羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为高速逆流色谱的固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至2～8(优选6～7)后作为流动相；
所述羟丙基-β-环糊精水溶液的浓度为0.05～0.30mol/L，优选0.1～0.15mol/L；
所述混合溶剂体系中，羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷、乙酸乙酯的体积份数分别为10份、8.5～9.5份、0.5～1.5份，优选分别为10份、9份、1份；
(2)取齐墩果酸和熊果酸的混合物用固定相和流动相的混合溶液溶解，得到样品溶液；
所述固定相和流动相的体积比为1：1；
所述固定相和流动相的混合溶液的体积用量以齐墩果酸和熊果酸的混合物的质量计为0.3～0.7mL/mg；
(3)取固定相注满高速逆流色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液注入分离柱，波长200～254nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，分别合并含目标物质齐墩果酸、熊果酸的洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸、熊果酸；
所述样品溶液可通过进样圈注入或通过泵泵入逆流色谱仪；
所述样品溶液的进样体积通常小于分离柱柱体积的30％，优选进样体积为分离柱柱体积的5％～10％；
所述目标物质可通过薄层层析或高效液相色谱进行监测，分别合并与齐墩果酸、熊果酸标准品Rf值或保留时间相同的含齐墩果酸、熊果酸的洗脱液；
所述薄层层析的展开剂为环己烷、乙酸乙酯和冰醋酸体积比10：3：0.5的混合溶剂；
所述高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；流速：1mL/min；检测波长：210nm；进样量：20μL。
本发明的有益效果在于：本发明操作简便，高效快捷，溶剂消耗少，样品无损失；羟丙基-β-环糊精对齐墩果酸和熊果酸具有很强的识别作用，目的性强，分离效果明显优于传统分离方法。
(四)附图说明
图1：实施例1的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图2：实施例2的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图3：实施例3的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图4：实施例4的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图1～图4中，1号峰代表齐墩果酸，2号峰代表熊果酸；
图5：a齐墩果酸和熊果酸混合物的高效液相(HPLC)图；b图1～图4中1号峰的高效液相(HPLC)图；c图1～图4中2号峰的高效液相(HPLC)图。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例中采用分析型逆流色谱仪以及半制备型逆流色谱，逆流色谱仪分离系统由恒流泵、紫外检测器、记录仪等组成。
实施例1：
配制0.10mol/L羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至3后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸标准品混合物1.5mg，用0.5ml固定相和0.5ml流动相溶解，得到样品溶液。
采用分析型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸混合物进行分离，分离柱的柱体积为15ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为1000r/min，设置流动相的流速为0.5ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品Rf值(Rf＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸0.23mg，其中齐墩果酸的纯度99.61％，回收率为93.22％；同时合并与熊果酸标准品Rf值(Rf＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸0.65mg，其中熊果酸的纯度99.41％，回收率为92.23％；
高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。
实施例2：
配制0.1mol/L羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至5后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸标准品混合物20mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为105ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品Rf值(Rf＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸3.73mg，其中齐墩果酸的纯度99.21％，回收率为91.23％；同时合并与熊果酸标准品Rf值(Rf＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸11.26mg，其中熊果酸的纯度99.07％，回收率为93.51％；
高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。
实施例3：
配制0.1mol/L羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9.5:0.5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至7后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸混合物20mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为105ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品Rf值(Rf＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸3.93mg，其中齐墩果酸的纯度98.79％，回收率为91.19％；同时合并与熊果酸标准品Rf值(Rf＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸11.68mg，其中熊果酸的纯度97.08％，回收率为93.99％；
高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。
实施例4：
配制0.15mol/L羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:8.5:2.5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至4后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸混合物30mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为200ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品Rf值(Rf＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸5.65mg，其中齐墩果酸的纯度98.90％，回收率为91.76％；同时合并与熊果酸标准品Rf值(Rf＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸13.14mg，其中熊果酸的纯度97.01％，回收率为90.85％；
高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。
对比例：
李海鹏等[李海鹏,徐怀德,孟祥敏,等.光皮木瓜齐墩果酸超声波辅助提取及纯化工艺[J].农业工程学报,2008,24(10):222-226.]以光皮木瓜为原料，采用大孔吸附树脂纯化齐墩果酸：采用对齐墩果酸具有较好的吸附和解吸效果的XDA-1型大孔树脂纯化提取的齐墩果酸：以90％浓度乙醇洗脱，洗脱流速1.0m L/min，纯化后得提取物中齐墩果酸纯度仅达26.55％。
林国荣等[林国荣,郭养浩.枇杷叶中熊果酸和科罗索酸分离工艺优化[J].食品工业科技,2014,35(24).]筛选了大孔树脂纯化枇杷叶中熊果酸条件：采用HZ816树脂进行柱分离，上柱流速为1BV/h，上样液熊果酸浓度为2mg/m L；洗脱流速为1BV/h，先后以38％、55％、95％乙醇洗脱，分离后得到熊果酸纯度为85.6％。
这些分离纯化齐墩果酸和熊果酸的方法的生产成本比较高，工艺繁琐复杂而且生产周期长，并且得到的熊果酸或者齐墩果酸纯度不高。而本发明中应用高速逆流色谱分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸，操作简单，分离时间短，回收率高，得到的齐墩果酸和熊果酸纯度高，具有一定的推广价值。
Claims (8)
1.一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)在分液漏斗中加入羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为高速逆流色谱的固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至2～8后作为流动相；
所述羟丙基-β-环糊精水溶液的浓度为0.05～0.30mol/L；
所述混合溶剂体系中，羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷、乙酸乙酯的体积份数分别为10份、8.5～9.5份、0.5～1.5份；
(2)取齐墩果酸和熊果酸混合物用固定相和流动相的混合溶液溶解，得到样品溶液；
(3)取固定相注满高速逆流色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液注入分离柱，波长200～254nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，分别合并含目标物质齐墩果酸、熊果酸的洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂得到齐墩果酸、熊果酸。
2.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述羟丙基-β-环糊精水溶液的浓度为0.1～0.15mol/L。
3.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合溶剂体系中，羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷、乙酸乙酯的体积份数分别为10份、9份、1份。
4.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定相和流动相的混合溶液中，固定相和流动相的体积比为1：1。
5.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定相和流动相的混合溶液的体积用量以齐墩果酸和熊果酸混合物的质量计为0.3～0.7mL/mg。
6.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述样品溶液通过进样圈注入或通过泵泵入逆流色谱仪。
7.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述样品溶液的进样体积小于分离柱柱体积的30％。
8.如权利要求1所述分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述目标物质通过薄层层析或高效液相色谱进行检测，分别合并与齐墩果酸、熊果酸标准品Rf值或保留时间相同的含齐墩果酸、熊果酸的洗脱液；
所述薄层层析的展开剂为环己烷、乙酸乙酯和冰醋酸体积比10：3：0.5的混合溶剂；
所述高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C18(2)column；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液体积比67：12：21的混合溶液，等度洗脱模式；流速：1mL/min；检测波长：210nm；进样量：20μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910815896.1A CN110559688A (zh) | 2019-08-30 | 2019-08-30 | 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910815896.1A CN110559688A (zh) | 2019-08-30 | 2019-08-30 | 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110559688A true CN110559688A (zh) | 2019-12-13 |
Family
ID=68776966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910815896.1A Pending CN110559688A (zh) | 2019-08-30 | 2019-08-30 | 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110559688A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107663222A (zh) * | 2016-07-27 | 2018-02-06 | 刘东波 | 一种天然α‑淀粉酶抑制剂及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1733794A (zh) * | 2005-08-25 | 2006-02-15 | 浙江大学 | 逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法 |
| US20120135094A1 (en) * | 2009-05-14 | 2012-05-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Oregano and mint anti-inflammatory compositions and methods |
| CN102871848A (zh) * | 2012-10-15 | 2013-01-16 | 西安雅芝生物科技有限公司 | 五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体及其制备方法 |
| CN104326898A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-02-04 | 浙江工业大学 | 一种外消旋2-苯基丁酸的手性拆分方法 |
| CN106680399A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-05-17 | 天津市第中心医院 | 一种同时测定莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸和熊果酸含量的方法 |
| CN109111496A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-01-01 | 青海清华博众生物技术有限公司 | 沙棘中三萜酸的提取纯化方法和三萜酸及三萜皂苷和应用 |
-
2019
- 2019-08-30 CN CN201910815896.1A patent/CN110559688A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1733794A (zh) * | 2005-08-25 | 2006-02-15 | 浙江大学 | 逆流色谱法从柿叶中分离制备熊果酸及其衍生物的方法 |
| US20120135094A1 (en) * | 2009-05-14 | 2012-05-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Oregano and mint anti-inflammatory compositions and methods |
| CN102871848A (zh) * | 2012-10-15 | 2013-01-16 | 西安雅芝生物科技有限公司 | 五环三萜类化合物环糊精包合物前体脂质体及其制备方法 |
| CN104326898A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-02-04 | 浙江工业大学 | 一种外消旋2-苯基丁酸的手性拆分方法 |
| CN106680399A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-05-17 | 天津市第中心医院 | 一种同时测定莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸和熊果酸含量的方法 |
| CN109111496A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-01-01 | 青海清华博众生物技术有限公司 | 沙棘中三萜酸的提取纯化方法和三萜酸及三萜皂苷和应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 国家药典委员会编: "《中华人民共和国药典 2015年版 一部》", 30 June 2015, 北京：中国医药科技出版社 * |
| 曾元儿主编: "《中国药典2010年版（一部）化学成分分析简明手册》", 30 September 2010, 广州：中山大学出版社 * |
| 杨明主编: "《中药药剂学》", 31 July 2016 * |
| 邓修编著: "《中药制药工程与技术》", 31 May 2008 * |
| 郭淑英、冯波: "HPLC法同时测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量", 《中国药房》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107663222A (zh) * | 2016-07-27 | 2018-02-06 | 刘东波 | 一种天然α‑淀粉酶抑制剂及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113817004B (zh) | 一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法 | |
| CN105541601B (zh) | 一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用 | |
| CN104892687A (zh) | 高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法 | |
| CN101337876B (zh) | 一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法 | |
| CN109293509B (zh) | 一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法 | |
| CN108276271B (zh) | 一种从迷迭香中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法 | |
| CN110559688A (zh) | 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 | |
| CN1394870A (zh) | 一种分离纯化丹参酮的方法 | |
| CN114988979B (zh) | 一种宏量分离制备高纯度番茄红素的方法 | |
| CN110194758B (zh) | 一种从关木通中分离纯化马兜铃酸类化合物的方法 | |
| CN1706858A (zh) | 用栀子果实制备栀子苷、京尼平－1－β－D－龙胆双糖苷的方法 | |
| CN114989152B (zh) | 铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法 | |
| CN101805352B (zh) | 一种制备毛萼乙素的方法 | |
| CN111440184B (zh) | 一种制备高纯度鼠尾草酚的方法 | |
| CN110684001A (zh) | 一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素a的方法 | |
| CN101723927B (zh) | 一种儿茶素单体egcg工厂化生产分离纯化方法 | |
| CN108440612A (zh) | 一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法 | |
| CN109369382B (zh) | 一种银杏酸类成分的制备方法 | |
| CN103232504A (zh) | 一种制备木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法 | |
| CN102127124B (zh) | 一种羟基红花黄色素a的制备方法 | |
| CN106977484A (zh) | 一种茶黄素复合物的制备方法 | |
| CN114456138B (zh) | 一种从佛手提取物中分离三种香豆素类化合物的方法 | |
| CN109053417B (zh) | 一种高纯度银杏酸的制备方法 | |
| CN108864256B (zh) | 一种分离纯化恩拉霉素a和恩拉霉素b的方法 | |
| CN111718356B (zh) | 一种分离制备墨旱莲单体的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191213 |