CN110194758B - 一种从关木通中分离纯化马兜铃酸类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从关木通中快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，本发明基于pH区带逆流色谱技术，在上相固定相和下相流动相中分别加入一定量的三氟乙酸和三乙胺，从而将关木通药材中的马兜铃酸类化合物实现有效的分离纯化，所述方法包括：将关木通粉碎后使用乙醇加热回流提取，减压浓缩得浸膏，用水混旋，使用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压蒸干得马兜铃酸总提取物；将总马兜铃酸类成分采用pH区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应的组分，本发明制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，耗时短，环境友好，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种从关木通中分离纯化马兜铃酸类化合物的方法

技术领域

本发明属于化合物分离纯化技术领域，具体涉及一种从关木通中快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

关木通是马兜铃科植物东北马兜铃Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤茎，古书记载有通经下乳、利小便、清心火等功效，临床上常用于口舌生疮、心烦尿赤、水肿、热淋涩痛等症，曾作为中药木通的替代品广泛应用于临床。其主要成分为马兜铃酸类成分，包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa等。但是，上个世纪90年代，有学者发现临床上病人服用马兜铃属植物——中药广防己会导致肾功能急速衰竭。由此，引发了国内外对马兜铃科马兜铃属中草药的肾毒性的广泛关注和研究。研究表明，马兜铃酸类成分是此类植物产生毒性的罪魁祸首。虽然从2003年开始，中国药典陆续取消了含马兜铃酸的中草药，但是一些地方仍将存在混用的问题。因此，高纯度马兜铃酸类成分的分离纯化制备对中药及中成药的质量控制极为重要。

目前，马兜铃酸类成分主要是通过硅胶柱色谱、高效液相等方法从关木通中分离纯化，但是，发明人发现，上述分离纯化的方法存在分离效率低、溶剂消耗大等缺陷。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种从关木通中快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，本发明基于pH区带逆流色谱技术，在上相固定相和下相流动相中分别加入一定量的三氟乙酸和三乙胺，从而将关木通药材中的马兜铃酸类化合物实现有效的分离纯化，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明基于以下技术方案实现上述技术目的：

本发明的第一个方面，提供一种从关木通中快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，所述方法包括：

将关木通粉碎后使用乙醇加热回流提取，减压浓缩得浸膏，用水混旋得混合物，依次使用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压蒸干得马兜铃酸总提取物；

马兜铃酸类化合物是弱极性化合物，采用上述提取方法，能够有效富集提取马兜铃酸类化合物，同时减少关木通其他有效成分的提取。

将马兜铃酸总提取物采用pH区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应的组分；其中，所述分离采用石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系。

pH区带逆流色谱法是在普通制备型高速逆流色谱分离纯化有机酸类成分的应用基础上发展起来的一种特殊逆流色谱分离制备技术，依据化合物的pKa大小，被依次洗脱出来，尤其适合有机酸类物质的分离。pH区带逆流色谱法由于具备进样量高、分离效率高、分离效果好、杂质易收集、可实现pH监控、待分离组分被高度浓缩等优点，目前已被广泛应用于研究领域与实践中。由于马兜铃酸类化合物苯环上连接的基团不同，化合物的pKa大小有一定的差异，因此可以采用pH区带逆流色谱法进行富集和分离。

进一步的，所述石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系体积比为5:5:1:6-8:2:1:6；pH区带逆流色谱所用的溶剂体系是影响分离结果的重要因素，不同化合物之间，不具备借鉴意义。本发明所采用的石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水溶剂体系，具有环境友好、分离提取效率高，分离产物纯度高的特点。

进一步的，石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系分层后，形成上相固定相和下相流动相，在上相固定相中加入三氟乙酸；在下相流动相中加入三乙胺。更进一步的，上相固定相中三氟乙酸浓度为5-10mM(优选为10mM三氟乙酸)；下相流动相中三乙胺浓度为5-20mM(优选为10mM的三乙胺)。

上述方法在马兜铃酸类单体化合物分离制备中的应用也在本发明保护范围之内。所述马兜铃酸类化合物包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa。

本发明的有益技术效果：

本发明制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，耗时短，环境友好，能够在10个小时一次性制备得到4个纯度大于95％的马兜铃酸类化合物，明显优于现有的硅胶柱色谱或者高效液相色谱技术，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中关木通中分离马兜铃酸类化合物的pH区带逆流色谱图；

图2为本发明实施例1中关木通中马兜铃酸总提物和分离得到的各馏分的高效液相色谱图；其中，图2A:马兜铃酸总提物,图2B:马兜铃酸IIIa,图2C:马兜铃酸IVa,图2D:马兜铃酸II,图2E:马兜铃酸I。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，发明人发现，目前，马兜铃酸类成分主要是通过硅胶柱色谱、高效液相等方法从关木通中分离纯化，而上述分离纯化的方法存在分离效率低、溶剂消耗大等问题。

有鉴于此，本发明提供一种从关木通中快速分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，所述马兜铃酸类化合物包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa，所述方法包括：

S1、将关木通粉碎后使用60％～80％乙醇加热回流提取，减压浓缩得浸膏，用水混旋得混合物，依次使用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液减压蒸干得马兜铃酸总提取物；马兜铃酸类化合物是弱极性化合物，采用上述提取方法，能够有效富集提取马兜铃酸类化合物，同时减少关木通其他有效成分的提取。

S2、将马兜铃酸总提取物采用pH区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应的组分；其中，所述分离采用石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，加热回流提取条件具体为：

关木通与乙醇的质量体积比为1kg:7～9L(优选为1kg:8L)。

加热回流提取温度控制为：90～100℃(优选为100℃)，加热回流提取时间为1.5～2.5h(优选为2h)。

本发明的又一具体实施方式中，关木通药材与水的质量体积比为1kg:0.8～1.2L(优选为1kg:1L)。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系体积比为5:5:1:6-8:2:1:6(优选为5:5:1:6，v/v)；pH区带逆流色谱所用的溶剂体系是影响分离结果的重要因素，不同化合物之间，不具备借鉴意义。本发明所采用的石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水溶剂体系，具有环境友好、分离提取效率高，分离产物纯度高的特点。

本发明的又一具体实施方式中，石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系分层后，形成上相固定相和下相流动相，在上相固定相中加入三氟乙酸；在下相流动相中加入三乙胺。

本发明的又一具体实施方式中，上相固定相中三氟乙酸浓度为5-10mM(优选为10mM三氟乙酸)；下相流动相中三乙胺浓度为5-20mM(优选为10mM的三乙胺)。本发明中，在上相中加入三氟乙酸作为保留剂，在下相中加入三乙胺作为洗脱剂，需要说明的是，使用pH区带逆流色谱技术进行化合物分离过程中，溶剂体系和保留剂、洗脱剂的选用是相互配合、相互影响的，脱离本发明溶剂体系和保留剂、洗脱剂的使用范围或者替换溶剂体系和保留剂、洗脱剂中的组分，均无法有效形成pH区带，不能有效分离上述马兜铃酸四种成分。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2具体方法为：

将两相溶剂体系中已超声脱气的上相固定相以10～20ml/min(优选为20ml/min)的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，控制逆流色谱仪转速为800～900rpm(优选为850rpm)。

将马兜铃酸总提取物溶解后注入高速逆流色谱仪中，然后以1～3ml/min(优选为2ml/min)的速度泵入下相流动相。

调节紫外检测器波长为254nm，根据检测器紫外光谱图接收各馏分，分离得到各马兜铃酸类化合物。

本发明的又一具体实施方式中，所述马兜铃酸总提取物溶解具体方法为：取等量的加入三氟乙酸的上相和未加入三乙胺的下相混合后溶解马兜铃酸总提取物。

本发明的又一具体实施方式中，每克马兜铃酸总提取物使用5～10ml(优选为10ml)加入三氟乙酸的上相和5～10ml(优选为10ml)未加入三乙胺的下相的混合物进行溶解。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2还包括使用高效液相色谱分析马兜铃酸总提取物和各馏分，所述高效液相色谱条件为：Unitary C18柱(54.6mm×250mm,i.d.,μm)；流动相:乙腈/0.5％乙酸水溶液(45:55,v/v)；流速:1.0L/min；检测波长：250nm。分析马兜铃酸总提取物的目的在于分析总提取物中的成分的数目和分离度，检测pH区带逆流色谱馏分的纯度以及利用保留时间来归属各馏分中的化合物进而合并相同成分化合物。

本发明的又一具体实施方式中，上述方法在马兜铃酸类单体化合物分离制备中的应用也在本发明保护范围之内。所述马兜铃酸类化合物包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa。

下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

1)提取

关木通药材1kg粉碎后用8L70％的乙醇，在100℃条件下加热回流提取2小时，提取液过滤后50℃减压浓缩至无醇味。浓缩后的浸膏用1L水混旋，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯萃取液然后减压蒸干得到马兜铃酸总提取物(26g)。

2)两相溶剂体系的配置

将石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水按照体积比5:5:1:6的比例配置溶剂系统，放置在分液漏斗中，摇匀，静置分层后，分成上相固定相和下相流动相。然后分别在上相中加入10mM的三氟乙酸，下相中加入10mM的三乙胺。

3)样品溶解

取获得的马兜铃酸总提取物1.0g，用10ml的下相和10ml加了三氟乙酸(10mM)的上相溶解样品。

4)分离制备过程

将两相溶剂体系中已经超声脱气的上相以20ml/min的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，调节主机转速到800rpm。将溶解的样品用注射器进入进样环中，旋转六通阀使样品注入高速逆流色谱仪中，然后以2ml/min的速度泵入下相。调节紫外检测器的波长在254nm，对流出来的组分进行监测。每隔三分钟收集一个馏分，pH区带逆流色谱图如图1所示，收集到的馏分用HPLC进行检测并合并相同成分。高效液相色谱条件为：Unitary C18柱(54.6mm×250mm,i.d.,μm)；流动相:乙腈/0.5％乙酸水溶液(45:55,v/v)；流速:1.0L/min；检测波长：250nm。

5)纯度测定

采用高效液相色谱仪对分离得到的成分进行测定，按照峰面积归一化法分析纯度，结果显示，分离得到的四种马兜铃酸类化合物纯度均大于95％。

6)结构鉴定

采用质谱、核磁共振波谱对四个化合物的结构进行鉴定，通过与已报道的文献比较，确定四个化合物分别为马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa，其结构式如下所示：

本实施例所提供的方法效率高、耗时短、环境友好，能够在10个小时一次性制备得到4个纯度大于95％的马兜铃酸类化合物，明显优于现有的硅胶柱色谱或者高效液相色谱技术。

实施例2

1)提取

关木通药材1kg粉碎后用8L75％的乙醇，在100℃条件下加热回流提取2小时，提取液过滤后50℃减压浓缩至无醇味。浓缩后的浸膏用1L水混旋，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯萃取液然后减压蒸干得到马兜铃酸总提取物(25g)。

2)两相溶剂体系的配置

将石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水按照体积比5:5:1:6的比例配置溶剂系统，放置在分液漏斗中，摇匀，静置分层后，分成上相固定相和下相流动相。然后分别在上相中加入10mM的三氟乙酸，下相中加入5mM的三乙胺。

3)样品溶解

取获得的马兜铃酸总提取物1.0g，用10ml的下相和10ml加了三氟乙酸(10mM)的上相溶解样品。

4)分离制备过程

将两相溶剂体系中已经超声脱气的上相以20ml/min的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，调节主机转速到800rpm。将溶解的样品用注射器进入进样环中，旋转六通阀使样品注入高速逆流色谱仪中，然后以2ml/min的速度泵入下相。调节紫外检测器的波长在254nm，对流出来的组分进行监测。每隔三分钟收集一个馏分，收集到的馏分用HPLC进行检测并合并相同成分。高效液相色谱条件为：Unitary C18柱(54.6mm×250mm,i.d.,μm)；流动相:乙腈/0.5％乙酸水溶液(45:55,v/v)；流速:1.0L/min；检测波长：250nm。

5)纯度测定

采用高效液相色谱仪对分离得到的成分进行测定，按照峰面积归一化法分析纯度，结果显示，分离得到的四种马兜铃酸类化合物纯度均大于95％。

6)结构鉴定

采用质谱、核磁共振波谱对四个化合物的结构进行鉴定，通过与已报道的文献比较，确定四个化合物分别为马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa。

实施例3

1)提取

关木通药材1kg粉碎后用8L70％的乙醇，在100℃条件下加热回流提取2.5小时，提取液过滤后50℃减压浓缩至无醇味。浓缩后的浸膏用1L水混旋，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯萃取液然后减压蒸干得到马兜铃酸总提取物(28g)。

2)两相溶剂体系的配置

将石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水按照体积比8:2:1:6的比例配置溶剂系统，放置在分液漏斗中，摇匀，静置分层后，分成上相固定相和下相流动相。然后分别在上相中加入10mM的三氟乙酸，下相中加入10mM的三乙胺。

3)样品溶解

取获得的马兜铃酸总提取物1.0g，用10ml的下相和10ml加了三氟乙酸(10mM)的上相溶解样品。

4)分离制备过程

将两相溶剂体系中已经超声脱气的上相以20ml/min的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，调节主机转速到800rpm。将溶解的样品用注射器进入进样环中，旋转六通阀使样品注入高速逆流色谱仪中，然后以2ml/min的速度泵入下相。调节紫外检测器的波长在254nm，对流出来的组分进行监测。每隔三分钟收集一个馏分，收集到的馏分用HPLC进行检测并合并相同成分。高效液相色谱条件为：Unitary C18柱(54.6mm×250mm,i.d.,μm)；流动相:乙腈/0.5％乙酸水溶液(45:55,v/v)；流速:1.0L/min；检测波长：250nm。

5)纯度测定

采用高效液相色谱仪对分离得到的成分进行测定，按照峰面积归一化法分析纯度，结果显示，分离得到的四种马兜铃酸类化合物纯度均大于95％。

6)结构鉴定

采用质谱、核磁共振波谱对四个化合物的结构进行鉴定，通过与已报道的文献比较，确定四个化合物分别为马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种从关木通中分离纯化马兜铃酸类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、将关木通粉碎后使用乙醇加热回流提取，减压浓缩得浸膏，用水混旋得混合物，依次使用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液减压蒸干得马兜铃酸总提取物；

S2、将马兜铃酸总提取物采用pH区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应的组分；其中，所述分离采用石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系；

所述步骤S1中，加热回流提取条件具体为：关木通与乙醇的质量体积比为1kg:7～9L；加热回流提取温度控制为：90～100℃，加热回流提取时间为1.5～2.5h；关木通药材与水的质量体积比为1kg:0.8～1.2L；

所述步骤S2中，石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系体积比为5:5:1:6-8:2:1:6；石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系分层后，形成上相固定相和下相流动相，在上相固定相中加入三氟乙酸；在下相流动相中加入三乙胺；

上相固定相中三氟乙酸浓度为10mM；下相流动相中三乙胺浓度为10mM。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，加热回流提取条件具体为：

关木通与乙醇的质量体积比为1kg:8L；

加热回流提取温度控制为：100℃，加热回流提取时间为2h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，关木通药材与水的质量体积比为1kg:1L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水体系体积比为5:5:1:6。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体方法为：

将两相溶剂体系中已超声脱气的上相固定相以10～20ml/min的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，控制逆流色谱仪转速为800～900rpm；

将马兜铃酸总提取物溶解后注入高速逆流色谱仪中，然后以1～3ml/min的速度泵入下相流动相；

调节紫外检测器波长为254nm，根据检测器紫外光谱图接收各馏分，分离得到各马兜铃酸类化合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体方法为：

将两相溶剂体系中已超声脱气的上相固定相以20ml/min的速度泵入高速逆流色谱仪的分离管中，控制逆流色谱仪转速为850rpm；

将马兜铃酸总提取物溶解后注入高速逆流色谱仪中，然后以2ml/min的速度泵入下相流动相。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述马兜铃酸总提取物溶解具体方法为：取等量的加入三氟乙酸的上相和未加入三乙胺的下相混合后溶解马兜铃酸总提取物；

每克马兜铃酸总提取物使用5～10ml加入三氟乙酸的上相和5～10ml未加入三乙胺的下相的混合物进行溶解。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每克马兜铃酸总提取物使用10ml加入三氟乙酸的上相和10ml未加入三乙胺的下相的混合物进行溶解。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S2还包括使用高效液相色谱分析马兜铃酸总提取物和各馏分，所述高效液相色谱条件为：Unitary C18柱54.6mm×250mm，i.d.，μm；流动相：乙腈和0.5％乙酸水溶液体积比45:55；流速：1.0L/min；检测波长：250nm。

10.权利要求1-9任一项所述方法在马兜铃酸类单体化合物分离制备中的应用，所述马兜铃酸类单体化合物包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸Iva；

其中，马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa和马兜铃酸Iva的结构式为：

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