CN112494528A - 柴胡总皂苷及其提取工艺与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柴胡总皂苷提取工艺，避免了传统的正丁醇萃取过程，采用大孔树脂联用的方法，经一系列条件优化，使最终精制品中皂苷含量达75％以上。本发明还使用高分辨质谱对其进行成分表征，在正负离子模式下共表征出33种皂苷类化合物。同时动物实验证明柴胡总皂苷能够明显抑制屋尘螨致敏哮喘小鼠炎性因子的增加，改善其肺组织的病理变化，且安全无毒副作用，可用于制备预防或治疗哮喘药物，具有良好的临床应用前景。

Description

柴胡总皂苷及其提取工艺与应用
技术领域
本发明属于天然药物技术，具体涉及一种柴胡总皂苷及其提取工艺，以及在制备治疗哮喘药物中的用途。
背景技术
支气管哮喘(Asthma)是由多种炎症细胞(如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)及其组分参与的气道慢性炎症，被世界医学界公认为四大顽症之一。其病理学改变以气道阻塞可逆性、气道高反应性、嗜酸性粒细胞浸润为主，肥大细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润为辅的慢性气道炎症为基本特征。
中医学上认为，支气管哮喘属于“哮病”范围，其病因病机为患者脾、肺、肾虚弱，无法布津及转化水谷，致使津液聚积成痰，伏藏于肺，从而阻塞气道，导致哮喘。目前对支气管哮喘的治疗，现代医学以抗炎、解痉、免疫治疗为最基本的方法，但现有药物由于副作用等原因，治疗效果与预期依旧有一定差距。此时，中医药在防治哮喘方面便显示出了一定的优势，具体体现在其是在整体观念指导下的辨证施治，运用中药多靶点的作用方式，延缓并阻止病情的发展，提高患者的生存质量，从而达到减少哮喘发作，维持长期稳定的目的，具有十分重要的意义。
中药柴胡，又名茈胡、地薰、山菜等。是伞形科植物柴胡(Bupleurum chinese DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根，其中前者习称“柴胡”，后者习称“南柴胡”，最早被记载于《神农本草经》，列为上品。其性味苦、微寒，归肝、胆经，常用于感冒发热、寒热往来、肝郁气滞等，常用炮制方法为“切段，生用或醋炙用”。柴胡中包含的化学成分复杂，其中三萜皂苷类化合物柴胡皂苷是其最主要的活性成分，它具有抗炎、抗菌及保肝等作用。研究表明，柴胡皂苷具有显著的抗炎作用，它对多种炎症过程，如炎性渗出、炎症介质释放、白细胞游走等均有抑制作用。柴胡总皂苷对于哮喘的治疗作用尚未被研究，因此我们在环保的理念下，优化并建立了柴胡总皂苷的提取精制工艺，并对得到的精制品进行化学成分和药理作用的进一步研究。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种较环保的柴胡总皂苷提取工艺，并提供了提取所得柴胡总皂苷在制备治疗哮喘药物中的用途。
技术方案：本发明所述的一种柴胡总皂苷提取工艺，包括以下步骤：
(1)称取柴胡，粉碎过筛，加入乙醇回流提取，抽滤，将滤液浓缩得浸膏，用水复溶作为上样液备用；
(2)用大孔树脂经平衡、上样、除杂、洗脱，进行柴胡总皂苷的初步富集；
(3)将洗脱液直接通过脱色树脂进行脱色，收集流出液浓缩得浸膏；
(4)加水复溶后冷冻干燥，得柴胡总皂苷。
步骤(1)中，粉碎后过60目筛，加入10～12倍体积60％～70％乙醇，用NaOH调节溶液pH值为8～10，浸泡1～2小时，80℃～90℃条件下回流提取1～2小时。优选的，步骤(1)中，粉碎后过60目筛，加入12倍体积65％乙醇，用NaOH调节溶液PH值为10，浸泡1.5小时，90℃条件下回流提取1.5小时。
步骤(1)中，抽滤得滤液，45℃～55℃条件下减压浓缩至无醇味，此步骤所得粗品总皂苷含量为5％～10％，将上述粗品用蒸馏水稀释作为上样液备用。优选的，步骤(1)中，抽滤得滤液，50℃条件下减压浓缩至无醇味，用蒸馏水稀释作为上样液备用。
步骤(2)中，将AB-8大孔树脂用95％乙醇浸泡24小时以上，蒸馏水洗至无醇味，湿法装柱，加8～10倍柱体积的蒸馏水进行平衡后上样，静置过夜。
步骤(2)中，用10～12倍柱体积的蒸馏水和5％～10％乙醇溶液依次除杂，并用10～12倍柱体积的65％～75％乙醇溶液进行洗脱，此步骤所得精制品总皂苷含量为35％～40％，相较于粗品提高了7～8倍，但含量仍较低。优选的，步骤(2)中，用10个柱体积的蒸馏水和10％乙醇溶液依次除杂，并用10个柱体积的70％乙醇溶液进行洗脱。
步骤(3)中，将D900脱色树脂先用5％的盐酸浸泡2～3小时，水洗至中性，然后用5％的NaOH溶液浸泡2～3小时，再次水洗至中性后湿法装柱，将65％～75％乙醇洗脱液直接上柱脱色，收集流出液，浓缩得浸膏。优选的，步骤(3)中，将D900脱色树脂先用5％的盐酸浸泡2小时，水洗至中性，然后用5％的NaOH溶液浸泡2小时，再次水洗至中性后湿法装柱，将70％乙醇洗脱液直接上柱脱色，收集流出液，浓缩得浸膏。
经AB-8及D900两种树脂联用后最终所得精制品的总皂苷含量为75％以上，相较于单用大孔树脂提高了约两倍。经高效液相色谱检测，精制品中主要皂苷类成分为柴胡皂苷a与柴胡皂苷d，其含量分别为19.38％和29.13％，含量之和约占柴胡总皂苷的55％。
提取所得柴胡总皂苷，经紫外分光光度法测定，总皂苷含量为75％以上。
本发明还公开了所述柴胡总皂苷在制备治疗哮喘的药物中的应用。
本发明还公开了一种治疗哮喘的药物制剂，含有上述柴胡总皂苷和药学上可接受的辅料。
其中，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂、或矫味剂中的一种或几种。
所述制剂优选为口服制剂。所述口服制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液。
有益效果：本发明在提取过程中，避免了传统的正丁醇萃取过程，采用大孔树脂联用的方法，经一系列条件优化，使最终精制品中皂苷含量达75％以上。本发明还使用高分辨质谱对其进行成分表征，在正负离子模式下共表征出33种皂苷类化合物。同时动物实验证明柴胡总皂苷能够明显抑制屋尘螨致敏哮喘小鼠炎性因子的增加，改善其肺组织的病理变化，且安全无毒副作用，可用于制备预防或治疗哮喘药物，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为柴胡皂苷a与柴胡皂苷d混合标准品及精制品液相色谱图；
图2为柴胡总皂苷提取实验单因素考察结果；
图3为五种大孔树脂的静态吸附性能图；
图4为不同乙醇浓度对柴胡皂苷的洗脱曲线；
图5为70％乙醇溶液对柴胡皂苷的洗脱曲线；
图6为柴胡总皂苷的提取精制工艺总流程图；
图7为柴胡总皂苷在正负离子模式下的总离子流图；
图8为小鼠血清中IgE检测结果；
图9为小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞分类计数结果；
图10为小鼠肺组织切片HE染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
实施例1：柴胡总皂苷提取及精制工艺流程
称取粉碎后过60目筛的柴胡粉末于圆底烧瓶中，加入12倍体积65％乙醇，用NaOH调节溶液pH值为10后浸泡1.5小时，90℃条件下回流提取1.5小时，抽滤得滤液，50℃条件下减压浓缩至无醇味，用蒸馏水适当稀释作为上样液备用。将AB-8大孔树脂用95％乙醇浸泡24小时以上，蒸馏水洗至无醇味，湿法装柱，加八倍柱体积的蒸馏水进行平衡后上样，静置过夜。接下来用10个柱体积的蒸馏水和10％乙醇溶液依次除杂，并用10个柱体积的70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱液备用。将D900脱色树脂先用5％的盐酸浸泡2小时，水洗至中性，而后用5％的NaOH溶液浸泡2小时，再次水洗至中性后湿法装柱，将70％乙醇洗脱液直接上柱脱色，收集流出液，浓缩得浸膏，用水复溶后冻干，经紫外分光光度法测得，柴胡总皂苷提取物中皂苷含量为77.64％，经高效液相色谱检测(图1)，精制品中主要皂苷类成分为柴胡皂苷a与柴胡皂苷d，其含量分别为19.38％和29.13％，含量之和约占柴胡总皂苷的55％。
本发明的工艺参数由单因素实验(图2)及正交实验(表1)确定，正交实验结果见表2。分析得出影响柴胡总皂苷提取因素的主次顺序为：pH值>乙醇浓度>提取时间>温度。当pH值为10，乙醇浓度为65％，提取时间为1.5小时，温度为90℃时，提取率最高。纯化参数经大孔树脂筛选(图3)、除杂及洗脱溶剂浓度及用量的考察(图4、5)而确定。实验得出最终除杂溶剂为10个柱体积的蒸馏水和10％乙醇溶液，洗脱溶剂为10个柱体积的70％乙醇溶液。综上所述，最终的柴胡总皂苷提取精制工艺总流程如图6。
表1柴胡总皂苷提取正交试验因素水平表
Figure BDA0002869330590000041
表2柴胡总皂苷提取正交实验结果
Figure BDA0002869330590000042
Figure BDA0002869330590000051
实施例2：柴胡总皂苷精制品化学成分表征
一：样品前处理
称取适量实施例1制备所得柴胡总皂苷精制品，加入50％甲醇，使最终浓度为500μg/mL，室温下超声提取30分钟，12000r/min离心10分钟，取上清转移至进样小瓶中，进行UPLC-QTOF/MS分析。
二：液相色谱/质谱(LC/MS)分析条件
色谱条件：Waters ACQUITY UPLCTM BEH色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm)，流动相：A(0.1％甲酸水溶液，v/v)，B(乙腈溶液)。正负离子梯度洗脱程序相同，具体信息见表3，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，样品盘温度为4℃，进样体积为2μL。
表3流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002869330590000052
质谱条件：AB SCIEX TripleTOFTM 5600+系统，氮气作雾化气和锥孔气，电喷雾离子源采用正离子(ESI+)/负离子(ESI-)扫描模式，质量扫描范围为100-1250m/z，质谱参数设置见表4。二级碎片信息通过IDA(信息依赖性采集)扫描模式获得，质量扫描范围为50-1250m/z。应用Analyst TF系统(version 1.7.1,AB SCIEX)采集数据，采用Peak View软件(version 1.2,AB SCIEX)进行数据分析。
柴胡总皂苷精制品在正负离子模式下的总离子流图见图7。首先建立柴胡药材的化学成分质谱数据库，基于此对柴胡总皂苷提取物进行表征，所得的33种化合物皆为皂苷类成分，其相对保留时间、分子式、准分子离子、碎片离子等具体信息见表5、6，这同时也证明了由实施例1得到的总皂苷精制品中其他类型化合物杂质较少。
表4质谱条件参数
Figure BDA0002869330590000061
表5正离子模式下11种化合物的定性表征结果
Figure BDA0002869330590000062
Figure BDA0002869330590000071
表6负离子模式下28种化合物的定性表征结果
Figure BDA0002869330590000072
Figure BDA0002869330590000081
Figure BDA0002869330590000091
实施例3：柴胡总皂苷对哮喘的活性研究
一：实验材料
1.1实验仪器
酶标仪、高速低温离心机、正置生物显微镜、数字病理切片扫描仪、磁力搅拌器、移液枪等。
1.2实验动物
清洁级C57BL/6J雌性小鼠60只，6-8周龄，体重18-20g，置于中国药科大学实验动物中心饲养。按照《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》对实验小鼠进行饲养。实验期间，普通饲料和普通饮用水进行喂养，昼夜12h交替，温度湿度适宜。
1.3相关试剂配制
(1)致敏剂：用生理盐水溶解屋尘螨冻干粉末，使得最终浓度为0.2mg/ml(50μL/只)。
(2)地塞米松(DXM)溶液：精密称量地塞米松1.2mg，溶解于12mL生理盐水中(0.02mg/20g/200μL)。
(3)柴胡总皂苷溶液(低剂量)：精密称量实施例1柴胡总皂苷162mg，溶解于54mL生理盐水中(0.6mg/20g/200μL)。
(4)柴胡总皂苷溶液(中剂量)：精密称量实施例1柴胡总皂苷324mg，溶解于54mL生理盐水中(1.2mg/20g/200μL)。
(5)柴胡总皂苷溶液(高剂量)：精密称量实施例1柴胡总皂苷648mg，溶解于54mL生理盐水中(2.4mg/20g/200μL)。
(6)1％戊巴比妥钠(麻醉剂)：精密称量戊巴比妥钠0.12g，溶解于12mL生理盐水中(100μL/只)。
(7)PBS溶液：称取8.0gNaCL，0.2g KCL，0.2g KH2PO4，2.0g Na2HPO4·12H2O，加入1L蒸馏水溶解。
二：实验方法
2.1屋尘螨诱导的小鼠哮喘模型的建立
将小鼠适应性喂养一周后随机分为6组，即空白组、模型组、地塞米松(DXM)组、柴胡总皂苷低剂量组(CHL)、柴胡总皂苷中剂量组(CHM)和柴胡总皂苷高剂量组(CHH)。除空白组外，所有组别在第0、3、5、10、12、14天用屋尘螨诱导哮喘模型，具体操作方法为腹腔注射100μL麻醉剂，待小鼠麻醉后，取50μL致敏剂，滴鼻和气道滴注双效致敏。给药组每天灌胃给予对应浓度的药物200μL，地塞米松组在第10-16天腹腔注射给药200μL。
2.2样品采集
样品采集前一天，将小鼠禁食12小时。摘眼球取血，将血液静置30分钟后，3000rpm，10分钟离心取上清，-80℃存放备用。取血后脱颈椎处死，固定小鼠于实验操作台上，暴露其气管，用0.8mL预冷的PBS溶液反复灌洗三次，收集肺泡灌洗液，1000rpm，离心5分钟，收集上清液，-80℃存放备用，下层细胞进行瑞氏-吉萨姆染色。取小鼠右肺上叶置于通用型组织固定液中固定，用于HE染色。
2.3统计学处理
使用SPSS软件进行统计学分析，两个独立样本比较采用t检验，采用平均数±标准差(x±SD)表示，#(P<0.05)及*(P<0.05)表示与模型组相比，样本差异显著，##(P<0.01)及**(P<0.01)表示与模型组相比，样本差异极显著。
2.4检测项目
2.4.1小鼠血清IgE水平，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
2.4.2细胞分类计数：肺泡灌洗液离心后的下层细胞加入15μLPBS，涡旋或移液枪吹打重悬，移取10μL于载玻片上点样，37℃烘干。将载玻片置于染色盒上，进行瑞氏-吉姆萨染色。每张片子滴加A液150μL，染色1分钟，加入B液450μL，染10分钟，用洗耳球不断吹匀，水轻轻冲洗15秒，晾干。于正置显微镜下观察200个细胞，并计算嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞所占的比例。
2.4.3肺组织HE染色
a.固定：4％多聚甲醛固定至少24小时以上。
b.脱水，透明：依次放入70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇中各1小时，最后用二甲苯透明处理。
c.浸蜡，包埋：软蜡中浸1小时，硬蜡中浸泡30分钟，包埋结束后切成5μm的薄片进行染色。
d.苏木素-伊红(HE)染色：二甲苯浸泡脱蜡10分钟×2次，依次在100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇浸泡各1分钟水化，清水冲洗；苏木素染色10分钟，清水冲洗；1％盐酸乙醇浸泡10秒，清水冲洗；伊红染色30秒，清水冲洗；梯度乙醇脱水(85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇各2分钟)；浸泡在二甲苯I中5分钟，二甲苯Ⅱ中5分钟，透明切片；最后中性树胶封片。
e.NanoZoomer数字病理切片扫描仪观察：观察肺组织切片肺泡壁有无充血、炎细胞浸润；有无肺气肿；肺内血管、支气管周围有无炎细胞浸润；肺内小支气管壁杯状细胞数量有无增多，管腔内有无炎性渗出等。
三：实验结果
3.1小鼠血清IgE水平检测结果
由图8可知，模型组小鼠血清中的IgE异常升高，显著高于空白对照组(P＜0.01)，阳性药地塞米松组和柴胡总皂苷干预组IgE水平有一定程度的降低，其中给药组中剂量与高剂量组相比于模型组有显著性差异(P＜0.01)，且体现出一定的剂量依赖性，提示柴胡总皂苷可以通过抑制IgE的分泌，缓解炎症，起到治疗哮喘的作用。
3.2小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的比例
由图9可知，小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞百分比模型组显著高于空白对照组(P＜0.01)，提示肺部正发生炎症反应。阳性药地塞米松组及柴胡总皂苷干预组嗜酸性粒细胞百分比相比于模型组显著降低(P＜0.01)。淋巴细胞和巨噬细胞百分比模型组显著低于空白对照组(P＜0.01)，阳性药地塞米松组及柴胡总皂苷干预组则有不同程度的回升。以上结果说明柴胡总皂苷对哮喘的肺部炎症浸润有一定的缓解作用。
3.3各组小鼠肺组织HE染色结果
由图10可知，小鼠的空白对照组表现为支气管、肺泡结构清晰，未见炎症。模型组较对应的空白对照组，表现出炎症反应，支气管周围可见炎性细胞浸润，以单核细胞为主，可见嗜酸性细胞，支气管、肺泡结构不清楚，上皮细胞脱落坏死，支气管腔内有渗出物等。阳性药地塞米松组和柴胡总皂苷干预组均表现出一定程度的炎症减轻，说明柴胡总皂苷对对哮喘具有一定的缓解作用。通过综合比较肺组织病理学变化、血清免疫球蛋白IgE变化水平、肺泡灌洗液中细胞分类计数等指标。发现柴胡总皂苷可以在一定程度上减轻哮喘症状。
实施例4：柴胡总皂苷制剂的制备
柴胡总皂苷提取物固体20mg，与糖粉20mg、水5mg、采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂。
柴胡总皂苷提取物20mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂。
柴胡总皂苷提取物固体20mg，与糊精等颗粒剂常用的辅料采用常规技术制成颗粒剂，再灌入硬胶囊皮中制成胶囊剂。
柴胡总皂苷提取物固体20mg，与淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用30％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。
柴胡总皂苷提取物固体20mg，与淀粉45mg，水45mg混合采用常规技术制成口服液。

Claims (10)

1.一种柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取柴胡，粉碎过筛，加入乙醇回流提取，抽滤，将滤液浓缩得浸膏，用水复溶作为上样液备用；
(2)用大孔树脂经平衡、上样、除杂、洗脱，进行柴胡总皂苷的初步富集；
(3)将洗脱液直接通过脱色树脂进行脱色，收集流出液浓缩得浸膏；
(4)加水复溶后冷冻干燥，得柴胡总皂苷。
2.根据权利要求1所述的柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，步骤(1)中，粉碎后过筛，加入10～12倍体积60％～70％乙醇，调节溶液pH值为8～10，浸泡1～2小时，80℃～90℃条件下回流提取。
3.根据权利要求1所述的柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，步骤(1)中，抽滤得滤液，45℃～55℃条件下减压浓缩至无醇味用蒸馏水稀释作为上样液备用。
4.根据权利要求1所述的柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，步骤(2)中，将AB-8大孔树脂用95％乙醇浸泡24小时以上，蒸馏水洗至无醇味，湿法装柱，加8～10倍柱体积的蒸馏水进行平衡后上样，静置过夜。
5.根据权利要求1所述的柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，步骤(2)中，用10～12倍柱体积的蒸馏水和5％～10％乙醇溶液依次除杂，并用10～12倍柱体积的65％～75％乙醇溶液进行洗脱。
6.根据权利要求1所述的柴胡总皂苷提取工艺，其特征在于，步骤(3)中，将D900脱色树脂先用5％的盐酸浸泡2～3小时，水洗至中性，然后用5％的NaOH溶液浸泡2～3小时，再次水洗至中性后湿法装柱，将65％～75％乙醇洗脱液直接上柱脱色，收集流出液，浓缩得浸膏。
7.权利要求1提取所得柴胡总皂苷，其特征在于，总皂苷含量为75％以上。
8.权利要求7所述柴胡总皂苷在制备治疗哮喘的药物中的应用。
9.一种治疗哮喘的药物制剂，其特征在于，含有权利要求7所述柴胡总皂苷和药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂、或矫味剂中的一种或几种；所述制剂为口服制剂。
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