CN102302525B - 一种银杏叶组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种银杏叶组合物及其制备方法，该组合物含有24-45％总黄酮醇苷、4-18％银杏内酯、2-6％白果内酯，且银杏酸少于百万分之五。本发明提供了一种简单易行、可靠的方法，在提取过程中可同时获得一定比例的总黄酮及萜内酯，收率高，有效成分纯度高、杂质少，并能有效去除烷基酚酸类有害物质。

Description

一种银杏叶组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种银杏叶组合物及其制备方法和应用。

背景技术

银杏，为银杏科银杏属多年生落叶乔木银杏，在地球上存在约2亿多年，素有“天然活化石”之称。

银杏又名公孙树、白果树等，其种子白果仁作为止咳平喘、缩小便、止带浊的中药在我国已有很久历史。其叶子银杏叶又称白果叶，味苦、甘涩、性平、小毒。银杏叶的化学成分很复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类、萜类、醇类、生物碱类、聚异戊二烯类、多糖等具有药理作用的活性成分，有毒成分为银杏酸。

银杏叶药用最早载于《神农本草经》，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。我国药典中记载银杏叶有润肺、平喘、止痛之功效，用于肺虚咳嗽、冠心病心绞痛等。

现代研究证实，银杏叶提取物具有以下方面的应用：

1、治疗冠心病心绞痛：60年代我国利用银杏叶提取物“6911”治疗冠心病，银杏叶提取物对治疗冠心病心绞痛有明显的作用，可改善冠脉血流量、减少冠脉阻力、减少心肌耗氧量，可明显改善冠心病患者的临床症状，如对头晕、胸闷、心悸、气短、乏力等均有较好的改善作用；

2、治疗高脂血症，银杏叶提取物对高脂血症有治疗作用，可明显降低血脂水平，降低中老年人冠心病的发病率；

3、治疗脑血管疾病：通过对银杏叶提取物制剂的临床研究，发现他能够改善细胞血液循环、活化细胞代谢，因此对老年痴呆症、脑损伤后遗症、脑血栓等疾病的疗效显著；

4、抗癌作用：银杏叶提取物还能抑制亚硝胺等物质的致癌作用。

关于银杏叶提取物，国内有很多文献公开：

中国专利申请200710117950.2、“一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法”中公开了一种银杏叶提取物的制备方法，该方法是将银杏叶切碎，按照重量比加入5-8倍量的40-60％乙醇，回流提取2-4次，每次1-1.5小时；然后加入絮凝剂，静置6-10小时，滤过，上清液浓缩至相对密度1.03-1.09(50℃)；加入乙醇使药液含醇量为70-85％，静置12-24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；加水稀释至含生药4g/ml，上样至处理的聚酰胺柱，用8-20％乙醇洗脱，收集上样流出液和洗脱液，减压浓缩得药液I，用25-40％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用55-70％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行。药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液VI合并，滤过，减压浓缩。该方法得到的银杏叶提取物，其有效部位的总含量可以达到80％以上，其中总黄酮醇苷达到40％以上，萜类内酯达到10％以上。提取用乙醇浓度低，提取液中水溶性杂质增多，加大了后续处理的难度，不但增加了絮凝剂处理步骤，而且每步洗脱所得洗脱液均需用有机溶剂萃取纯化，增加了带入外来杂质的几率，工艺复杂。

中国专利申请CN200810068921.6、“银杏叶提取物与双嘧达莫的组合物制剂及其制备方法”，公开了银杏叶提取物的制备方法，包括：取银杏叶粉碎，用乙醇回流提取，提取液回收乙醇，得银杏叶醇提液备用；药渣用水提取，提取液与前述醇提液混合，混合液适当浓缩，用无机陶瓷膜进行过滤，过滤速度为10-15L/h，过滤后的药液直接通过已处理好的树脂柱进行吸附，流出液废弃，用pH值为2-6的去离子水或1-30％乙醇洗柱，再用pH值为4-6的60-95％乙醇洗脱，收集颜色较深部分洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥即得银杏叶粗提取物。这个工艺有水提过程，水提液、醇提液混合，过滤后直接上树脂柱处理，工艺过程较简单，但无除杂步骤，最终所得提取物纯度低，杂质含量较高。

中国专利申请CN03150054.4公开了一种银杏叶的提取方法：鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮含量。该提取方法既包括醇提又包含水提，上柱洗脱后再无后续纯化步骤，所得浓提取液杂质多。

中国专利申请CN200810022162.X公开了将银杏叶粉碎；将粉碎的银杏叶放入乙醇浸泡；将浸泡银杏叶中的乙醇回收；去除浸泡过银杏叶中的杂质；加入树脂第一次吸附银杏酸；用乙醇洗脱，得到洗脱液；加入树脂第二次吸附银杏酸；用乙醇洗脱，得到洗脱液；将乙醇回收；烘干即得到低酸银杏黄酮。为除去银杏酸，用了两次树脂，过程繁琐，增加了带入杂质(树脂残留)的几率。另外采用浸泡的方式进行提取，提取率偏低。

中国专利申请CN200810030767.3公开了一种银杏叶提取物的制备工艺，其工艺步骤包括：取干银杏叶粉碎成细粉；当于细粉体积10-15倍的浓度为10-20％乙醇对银杏叶细粉进行搅拌提取得到提取液，提取温度为50-70℃，时间为1.5-3小时；将所得到的提取液直接过AB-8树脂；用浓度为60-80％的乙醇解析树脂，得到的洗脱液浓缩、干燥后得到所需的银杏叶提取物。提取用乙醇浓度过低，且无任何纯化步骤，水溶性杂质多。AB-8树脂对黄酮类物质有一定吸附作用，但对内酯作用弱。

中国专利申请CN200910154390.7公开了一种银杏提取物的生产工艺，将银杏叶原料加入8倍50-70％的乙醇对银杏叶分3次进行浸提，浸提温度70度，然后收集提取液，真空蒸发，回收乙醇，离心后收集上清液；将经过离心处理的提取液过径高比为1∶10的大孔树脂层析柱，用5-15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然后用70％的乙醇解吸，解吸完毕后，收集解吸液，将上述解吸液再过径高比为1∶30的大孔树脂层析柱，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏后，真空干燥即得银杏提取物。无纯化步骤，杂质多，树脂柱径高比偏高，不适于大生产。

中国专利申请CN200910217956.6公开了银杏叶提取工艺，将银杏叶粉碎后，经乙醇浸泡、浓缩过滤、乙醇冷藏、树脂吸附、乙醇洗脱等技术处理，得到银杏提取液。单纯浸泡，提取率低。

中国专利申请201010132782.6，名称为“一种治疗血管性痴呆的组合物及其制备方法”公开了银杏叶加8倍量体积的70％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收乙醇，药液通过D101大孔吸附树脂柱，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积的洗脱液，滤过，减压回收乙醇并干燥，得银杏叶总黄酮。仅能获得银杏叶总黄酮，不能同时得到萜内酯等其他有效成分。

中国专利申请CN201010148970.8，名称为“一种从银杏叶中提取总黄酮甙的方法”公开了如下方法：1)将干银杏碎叶于乙醇中，加热回流1-4h后过滤；2)所得滤渣用微波炉进行微波辐射处理后，将其与滤液合并加入水中，加热提取30-90min后过滤；3)浓缩步骤(2)所得滤液至流浸膏，加去离子水溶解，以醚萃取2-3次后，水相碱调pH＝8-9，过大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱液，浓缩，结晶，干燥。本发明采用微波辐射辅助提取与大孔树脂纯化处理相结合，产品提取率50％以上。用醚萃取，醚为低毒试剂，不适于大生产用。上树脂柱前调碱性，是使黄酮类物质易于吸附于大孔吸附树脂柱上，但会使内酯类物质被破坏掉。

针对上述方法的不足，发明人研究了一种简单易行、可靠的方法，在提取过程中可同时获得一定比例的总黄酮及萜内酯，收率高，有效成分纯度高、杂质少，并能有效去除烷基酚酸类有害物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种银杏叶组合物。

本发明还提供了一种银杏叶组合物的制备方法。

本发明还提供了一种银杏叶组合物的应用。

本发明提供的一种银杏叶组合物，该组合物中含有24-45％总黄酮醇苷、4-18％银杏内酯、2-6％白果内酯，且银杏酸少于百万分之五。

优选的，本发明提供的银杏叶组合物中含有24-39％总黄酮醇苷、6.5-18％银杏内酯、2-5％白果内酯，且银杏酸少于百万分之三。

进一步优选，本发明提供的银杏叶组合物中含有28-39％总黄酮醇苷、6.5-18％银杏内酯、3-4％白果内酯，且银杏酸少于百万分之一。

其中，总黄酮醇苷的苷元是由槲皮素、山奈素和异鼠李素按照重量比为0.9-1.3∶1∶0.35-0.8组成。

本发明提供的银杏叶组合物中，还含有6-15％的总氨基酸，6-18％的总糖。

上述提供的银杏叶组合物中，还含有药学上可接受的载体或稀释剂。

该组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或注射剂，所述注射剂为注射液、注射用无菌粉末、注射用冻干粉和注射用浓溶液。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

其中所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；

所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；

所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；

所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、二氧化硅、滑石粉或硬脂酸镁；

所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；

所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素或糖精钠。

本发明提供了一种银杏叶组合物优选为注射液，由20-45％总黄酮醇苷、4-18％银杏内酯、2-6％白果内酯与山梨醇、乙醇、丙二醇、羟丙基-β-环糊精中的一种或多种组成，每种辅料所占比例为1-5％，多种辅料总和不超过10％，且该注射液中的银杏酸少于百万分之五。

本发明还提供了一种银杏叶组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：称取银杏叶，用3-6倍量的65-80％乙醇回流提取2次，每次1-2小时，合并提取液，在pH值7.0-8.0的条件下静置12-36小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加水稀释后调pH值4.0-5.5，离心，离心液上大孔吸附树脂柱，依次用纯化水、浓度为2.5-3.5％(g/ml)的乙酸钠溶液、纯化水、浓度为20％的乙醇冲洗，然后用浓度为70-75％的乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药3.8-4.2g/ml，加入乙醇使含醇量达80-90％，调节pH值7.0-8.0，静置24-36小时，浓缩，干燥，粉碎，制成制剂。

上述方法中：

所述大孔吸附树脂柱的型号为HPD450。

本发明还提供了上述银杏叶组合物在制备治疗静脉栓塞、视网膜静脉中央阻塞、改善视力障碍的药物中的应用。

本发明提供的银杏叶组合物及其制备方法的优点在于：

1、本发明提供的制备方法与中国专利200710117950.2的区别在于：

1)乙醇浓度略有不同：

提取过程中，乙醇浓度低于65％，水溶性杂质增加，造成后续过程增加纯化的步骤(萃取)，生产时间延长，易污染。本发明工艺采用65-80％乙醇提取，能有效保留有效成分，同时除掉大部分杂质。

2)调节pH值：

静置前调pH值是为了去除色素类等杂质成分；上树脂柱前调pH值是为了调整溶解性，利于有效成分易于吸附于大孔吸附树脂柱上。同时pH值的调节对总黄酮和内酯的含量影响也较大，在有效去除杂质，最大限度保留有效成分时的酸碱度值的确定很重要。

3)过大孔吸附树脂后用水、乙酸钠、乙醇洗脱：

200710117950.2号专利采用聚酰胺树脂柱，更适于对极性大的有机物的吸附；本发明采用大孔吸附树脂柱，适于水溶性成分的分离，尤其是大分子亲水成分，如多糖、黄酮、三萜类化合物。因而本发明更能有效的分离纯化得到所有目标成分，同时乙酸钠洗脱步骤更是显著去除了酚酸类毒性成分。

本发明提供的提取方法可同时提取一定比例的黄酮与内酯有效成分，有效去除烷基酚酸类有害物质，各批次间有效成分含量稳定。缩短生产时间，避免污染。收率高，杂质少。对静脉栓塞引起的疾病有显著疗效，应用安全。

2、本发明提供的银杏叶组合物各成分固定，比例关系明确，临床疗效显著。

目前银杏叶制剂中各成分复杂多变、比例关系不明确，本发明通过大量试验研究，确定了各成分的最佳配比，使其在静脉栓塞引起的疾病方面的临床治疗效果更佳，尤其对视网膜静脉中央阻塞的治疗尤其显著。

3、将本发明的银杏叶组合物制备成注射剂：与现有技术中的银杏叶提取物注射剂相比，本发明注射剂各成分比例关系明确，稳定性好，质量均一，溶液颜色浅，临床疗效好，应用更安全。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：银杏叶组合物

一、称取银杏叶1kg，适度破碎(0.5cm以下)，回流提取两次，第一次加入5倍量65％乙醇浸泡2小时，回流提取2小时；第二次加入4倍量65％乙醇，回流提取1.5小时，合并提取液，备用；

二、35℃下调节提取液pH值至7.6，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味；然后加水稀释至含生药2g/ml后调pH值至5.0，离心，离心液上HPD450大孔吸附树脂柱，依次用树脂1倍量纯化水、树脂2倍量浓度为3.0％(g/ml)的乙酸钠溶液冲洗树脂柱、然后用纯化水冲洗树脂柱直到冲洗液pH为中性，再用树脂1.5倍量浓度为20％乙醇冲洗树脂柱，最后用树脂5倍量浓度为70％乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药4g/ml，加入乙醇使含醇量达到90％，调节pH值至7.5，静置24小时，浓缩干燥，粉碎，得银杏叶组合物0.35kg。

三、含量检测：

1、总黄酮醇苷照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为368nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；

2)对照品溶液的制备：分别取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液；

3)供试品溶液的制备：取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液(或对照提取物溶液)与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素与异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：

总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。

2、萜类内酯照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丁醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。

2)对照品溶液的制备：分别取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

3)供试品溶液的制备：取本品约0.15g，精密称定，加水10ml，至水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得。

3、总糖

1)实验试剂及仪器

XP205型电子天平(十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO)；UV-1100型紫外可见光分光光度计(北京科丰恒业仪器仪表有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500W，频率40KHZ)；SHB-III循环水式多用真空泵及低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；所用化学试剂均为分析纯(北京现代东方精细有限公司)

2)测定方法

①对照品溶液的制备：取在80℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL含无水葡萄糖200μg)。

②供试品溶液的制备：精密称定本品7mg，加2ml水溶解后用3倍量水饱和正丁醇萃取6次至正丁醇层无色，离心(转速5000，时间4min)，精密吸取0.5mL水层，用水溶解并稀释至50倍，即得。

③测定法：精密吸取对照品和供试品溶液各2ml，依次加5％苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀，置100℃水浴中保温15min，取出放入冰水浴中冷却至室温，在波长490nm处测定吸光度。

4、总氨基酸

1)实验仪器及试剂

XP205型电子天平(十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO)；UV-1100型紫外可见光分光光度计(北京科丰恒业仪器仪表有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500W，频率40KHZ)；SHB-III循环水式多用真空泵及低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；所用化学试剂均为分析纯(北京现代东方精细有限公司)

2)检测方法：

①对照品溶液的制备：精密称取各氨基酸对照品适量，用1％稀盐酸溶解并定容至100ml，配制成10mg/ml的氨基酸混合标准品原液(天冬氨酸0.5146mg/ml，谷氨酸0.5266mg/ml，天冬酰胺1.5180mg/ml，丝氨酸0.5009mg/ml，甘氨酸0.5128mg/ml，苏氨酸0.5147mg/ml，胱氨酸0.5077mg/ml，丙氨酸0.5080mg/ml，精氨酸0.5450mg/ml，酪氨酸0.5154mg/ml，甲硫氨酸0.5130mg/ml，缬氨酸0.5008mg/ml，色氨酸0.4947mg/ml，苯丙氨酸0.5189mg/ml，异亮氨酸0.2124mg/ml，亮氨酸0.4996mg/ml，脯氨酸0.5048mg/ml)；精密吸取1ml对照品原液，用水稀释，调pH至中性(10％NaOH)定容至100ml，即得。

②供试品溶液制备：精密称定本品7mg，加2ml水溶解，量取1ml溶液于带盖试管中，加入6mol/L盐酸溶液9ml，充氮气封口，盖紧瓶盖，置于110℃恒温干燥箱中水解24h，取出后将样品倒入蒸发皿中，70℃水浴中蒸干，然后加水超声10min，定容至2ml，精密吸取水解液0.5ml，用水稀释5倍，即得。

③测定法：精密吸取对照品和供试品溶液各2ml于25ml比色管中，依次加2％茚三酮溶液1.5mL，磷酸盐缓冲液1mL，摇匀，置100℃水浴中保温18min，取出放入冰水浴中冷却至室温，定容，摇匀，稳定15min，在波长570nm处测定吸光度。

5、总银杏酸

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90∶10)为流动相；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。

2)对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。

3)供试品溶液的制备：取本品粉末约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60-90℃)50ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60-90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。

4)测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。

6、杂质成分检测

6.1炽灼残渣：取本品1.0g置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在500-600℃炽灼使完全炭化，移至干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500-600℃炽灼至恒重，称重。该重量与取样量的比值为炽灼残渣值。

6.2重金属及有害元素(电感耦合等离子体质谱法)

1)标准品储备液的制备：分别精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含铅、砷、镉、汞、铜为1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液，即得。

2)标准品溶液的制备：精密量取铅、砷、镉、铜标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml含铅、砷0ng、1ng、5ng、10ng、20ng，含镉0ng、0.5ng、2.5ng、5ng、10ng，含铜0ng、50ng、100ng、200ng、500ng的系列浓度混合溶液。另精密量取汞标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5ng的溶液，本液应临用配制。

3)内标溶液的制备：精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量，用水稀释制成每1ml各含1μg的混合溶液，即得。

4)供试品溶液的制备取供试品于60℃干燥2小时，粉碎成粗粉，取约0.5g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5-10ml。密闭并按各微波消解仪的相应要求及一定的消解程序进行消解。消解完全后，消解液冷却至60℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50ml量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液(1μg/ml)，200μl，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

除不加金单元素标准溶液外，余同法制备试剂空白溶液。

5)测定法：以测量值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，读取3次读数的平均值。从标准曲线上计算相应的浓度。在相同的分析条件下进行空白试验，扣除空白干扰。

6.3大孔吸附树脂残留检查：照残留溶剂测定法(《中国药典》2010年版二部附录VIIIP第二法)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以键合/交联聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氢火焰离子化检测器，柱温，程序升温，起始温度为60℃，维持16分钟，再以每分钟20℃升温至200℃，维持2分钟；检测器温度300℃；进样口温度240℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟。理论板数以邻二甲苯峰计算应不低于40000，各待测峰之间的分离度应符合规定。

2)对照品溶液的制备：精密称取正己烷，苯，甲苯，对二甲苯，邻二甲苯，苯乙烯，1，2-二乙基苯和二乙烯苯对照品适量，加N，N-二甲基乙酰胺制成每1ml中分别含20μg、4μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作为对照品储备液。精密吸取上述储备液2ml，置50ml量瓶中，加25％N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。

3)供试品溶液的制备：取本品约0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入25％的N，N-二甲基乙酰胺溶液5ml，密封瓶口，摇匀，即得。

4)测定法：分别精密量取顶空气体1ml，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

检测结果：总黄酮醇苷(％)：28.6(其中槲皮素的含量为4.50％、山柰素的含量为4.55％、异鼠李素的含量为2.35％)；银杏内酯(％)：7.5；白果内酯(％)：3.6；总糖(％)：14.3；总氨基酸(％)：10.4；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.45；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例2：银杏叶组合物

1、称取银杏叶1kg，适度破碎(0.3cm以下)，回流提取两次，第一次加入6倍量80％乙醇浸泡1.5小时，回流提取1.5小时，第二次加入3倍量80％乙醇回流提取1小时，合并提取液，备用；

2、提取液33℃下调节pH值至7.9，静置18小时，滤过，回收乙醇至无醇味，然后加水稀释至含生药2.1g/ml后调pH值至4.0，离心，离心液上大孔吸附树脂柱(型号为HPD450)，依次用树脂1倍量纯化水、树脂2倍量浓度为3.2％(g/ml)的乙酸钠溶液冲洗树脂柱、然后用纯化水冲洗树脂柱直到冲洗液pH 7.0，再用树脂1.5倍量的浓度为20％乙醇冲洗树脂柱，最后用树脂5倍量的浓度为75％乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药3.8g/ml，加入乙醇使含醇量达到85％，调节pH值至7.8，静置30小时，浓缩干燥，粉碎，得银杏叶组合物0.42kg。

3、含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：38.9(其中槲皮素的含量为7.40％、山柰素的含量为5.74％、异鼠李素的含量为2.36％)；银杏内酯(％)：6.5；白果内酯(％)：3.3；总糖(％)：11.7；总氨基酸(％)：9.6；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.38；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例3：银杏叶组合物

1、称取银杏叶1kg，适度破碎(0.2cm以下)，回流提取两次，第一次加入4倍量75％乙醇浸泡2小时，回流提取2小时，第二次加入5倍量70％乙醇回流提取1.5小时，合并提取液，备用；

2、提取液37℃下调节pH值至7.0，静置24小时，滤过，回收乙醇至无醇味，然后加水稀释至含生药1.8g/ml后调pH值至4.5，离心，离心液上大孔吸附树脂柱，依次用树脂1倍量的纯化水、树脂2倍量的浓度为2.9％(g/ml)的乙酸钠溶液冲洗树脂柱、然后用纯化水冲洗树脂柱直到冲洗液pH 7.0，再用树脂1.5倍量的浓度为20％乙醇冲洗树脂柱，最后用树脂5倍量的浓度为70％乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药4.2g/ml，加入乙醇使含醇量达到80％，调节pH值至7.3，静置24小时，浓缩干燥，粉碎，得银杏叶组合物0.38kg。

3、含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：42.8(其中槲皮素的含量为6.7％、山柰素的含量为6.1％、异鼠李素的含量为4.25％)；银杏内酯(％)：11.2；白果内酯(％)：4.2；总糖(％)：12.9；总氨基酸(％)：10.1；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.42；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例4：银杏叶注射液

取实施例1组合物，加水溶解，滤过，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，调节pH值至5.0，加水至规定量，过滤，灌装，灭菌，得注射液。

经检测，含总黄酮醇苷0.90mg/ml，银杏内酯0.24mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，总糖0.45mg/ml，总氨基酸0.33mg/ml。

实施例5：银杏叶注射液

取实施例1组合物，加水溶解，滤过，加入各4％的山梨醇和乙醇溶液，搅拌，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，调节pH值至5.6，加水至规定量，过滤，灌装，灭菌，得注射液。

经检测，含总黄酮醇苷0.88mg/ml，银杏内酯0.23mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，总糖0.44mg/ml，总氨基酸0.32mg/ml。

实施例6：银杏叶注射液

取实施例2组合物，加水溶解，滤过，加入5％山梨醇和3％乙醇溶液，搅拌，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，调节pH值至5.8，加水至规定量，过滤，灌装，灭菌，得注射液。

经检测，含总黄酮醇苷0.85mg/ml，银杏内酯0.14mg/ml，白果内酯0.07mg/ml，总糖0.26mg/ml，总氨基酸0.21mg/ml。

实施例7：银杏叶注射液

取实施例1组合物，加水溶解，滤过，加入1.8％羟丙基-β-环糊精溶液，搅拌，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，调节pH值至5.5，加水至规定量，过滤，灌装，灭菌，得注射液。

经检测，含总黄酮醇苷0.84mg/ml，银杏内酯0.22mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，总糖0.42mg/ml，总氨基酸0.31mg/ml。

实施例8：银杏叶注射液

取实施例3组合物，加水溶解，滤过，加入4％丙二醇溶液，搅拌，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，调节pH值至4.7，加水至规定量，过滤，灌装，灭菌，得注射液。

经检测，含总黄酮醇苷0.88mg/ml，银杏内酯0.23mg/ml，白果内酯0.09mg/ml，总糖0.27mg/ml，总氨基酸0.21mg/ml。

对比例1：(参考中国专利200710117950.2的实施例1的方法)

1、取银杏叶切碎，按重量比加入8倍量的55％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并、滤过，减压浓缩；

2、加入0.2倍量体积的1％的明胶，静置8小时，滤过，上清液浓缩至相对密度约1.06(50℃)；

3、加入乙醇使药液含醇量为80％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

4、加水稀释，上样至处理的聚酰胺柱，用8％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用25％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用55％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

5、药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，60℃真空干燥，得银杏叶组合物。

6、含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：21.8；银杏内酯(％)：5.7；白果内酯(％)：0.8；总糖(％)：5.2；总氨基酸(％)：4.4；银杏酸(百万分之)：1.1；炽灼残渣(％)：066；铅(百万分之)：1；镉(千万分之)：1；砷(千万分之)：4；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：5。

对比例2：(参考中国专利200710117950.2的实施例2的方法)

1、取银杏叶切碎，按重量比加入8倍量的60％的乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并、滤过，减压浓缩；

2、加入0.4倍量体积的0.5％的海藻酸溶液，静置10小时，滤过，上清液浓缩至相对密度约1.09(50℃)；

3、加入乙醇使药液含醇量为70％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

4、加水稀释至含生药4g/ml，上样至已处理的聚酰胺柱，用20％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用40％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用70％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

5、药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得银杏叶提取物。

6、含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：23.6；银杏内酯(％)：6.4；白果内酯(％)：0.7；总糖(％)：4.8；总氨基酸(％)：4.3；银杏酸(百万分之)：1.2；炽灼残渣(％)：062；铅(百万分之)：1；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：5；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：2。

对比例3：(参考中国专利200710117950.2的实施例3的方法)

1、取银杏叶切碎，按重量比加入6倍量的40％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并、滤过，减压浓缩；

2、加入0.3倍量体积的1.5％聚乙烯吡咯烷酮溶液，静置8小时，滤过，上清液浓缩至相对密度约1.03(50℃)；

3、加入乙醇使药液含醇量为70％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

4、加水稀释含生药4g/ml，上样至处理的聚酰胺柱，用10％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用30％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用60％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

5、药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，60℃真空干燥，得银杏叶提取物。

6、含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：27.8；银杏内酯(％)：6.2；白果内酯(％)：0.5；总糖(％)：4.5；总氨基酸(％)：3.7；银杏酸(百万分之)：1.6；炽灼残渣(％)：0.68；铅(百万分之)：2；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：3。

对比例4：03150054.4的方法

将鲜银杏叶1000g，用打浆机粉碎成糊状，加5000ml 70％的乙醇及1g硫酸氢钠回流提取3h，过滤再将滤渣同样提取2次过滤，合并三次滤液加饱和石灰水调pH值至10，产生污绿色沉淀，静置4h以上，过滤，加盐酸调节pH值5.5，减压回收乙醇得到黑棕色粘稠物约300g，加1500ml热蒸馏水煮沸5分钟，过滤，滤渣用同样提取两次合并黄色水提液在0℃冷藏过夜过滤后上大孔树脂柱(用800g树脂可完全吸附)控制滴速至水流尽后先以30％乙醇洗杂质，至流出液无色后，再以50％乙醇洗脱至流出液无色为止，对50％乙醇洗脱液回收乙醇至无醇味，得到浓银杏叶提取液约450ml。

含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：22.5；银杏内酯(％)：2.6；白果内酯(％)：1.8；总糖(％)：5.8；总氨基酸(％)：5.3；银杏酸(百万分之)：8；炽灼残渣(％)：0.71；铅(百万分之)：2；镉(千万分之)：1；砷(千万分之)：5；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：8；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：0.0002；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：0.0005；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：0.0005。

对比例5：200910154390.7的方法

将银杏叶原料加入8倍65％的乙醇对银杏叶分3次进行浸提，浸提温度为70℃，然后收集提取液，真空蒸发，回收乙醇，离心后收集上清液；将经过离心处理的提取液过径高比为1∶10的大孔树脂层析柱，用5～15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然后用70％的乙醇解吸，解吸完毕后，收集解吸液，将上述解吸液再过径高比为1∶30的大孔树脂层析柱，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏后，真空干燥即得银杏提取物。

含量检测，方法同实施例1，结果如下：

总黄酮醇苷(％)：23.3；银杏内酯(％)：3.8；白果内酯(％)：1.4；总糖(％)：3.7；总氨基酸(％)：3.1；银杏酸(百万分之)：6；炽灼残渣(％)：0.68；铅(百万分之)：1；镉(千万分之)：1；砷(千万分之)：8；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：10；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：0.001；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：0.0012；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：0.0008。

实验例1：银杏叶提取物的成分分析

将实施例1-3和对比例1-5的银杏叶提取物浓缩至生药重量的三分之一(此浓度下内酯不易析出，再浓缩内酯成分易析出)，然后对其进行分析，具体成分的分析方法见实施例1，结果见表1。

表1：成分分析

注：“——”代表未检测。

结果显示：本发明各有效成分含量均高于对比例，杂质含量低于对比例1-5。

实验例2：对注射液中含量的检测：

注射液含量测定方法基本同组合物的，仅总黄酮醇苷的供试品制备有所不同：

总黄酮醇苷测定中供试品溶液的制备：精密量取本品10ml，加甲醇16ml，18％盐酸溶液6ml，置水浴中加热回流1.5小时，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验例3：对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

1、实验动物：大鼠雄性，体重200-240g，经检查无明显歪颈，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圆，对光反应灵敏。

2、实验分组：

适应性饲养3天后，连续测量3天眼压，剔除平均眼压高于或低于大鼠正常眼压波动范围者，挑选出70只合格者纳入实验。随机分为7组，分别为实施例7组、市售品组、对比例3组、对比例4组、对比例5组、阳性对照组和阴性对照组，每组各10只。所有大鼠右眼做急性高眼压缺血再灌注模型，左眼未处理。

3、实验方法：

3.1缺血再灌注模型的制备：

麻醉动物，待瞳孔散开后，在手术显微镜下将连接氯化钠注射液瓶输液管的7号小儿头皮针刺入大鼠前房，避免损伤虹膜及晶体，氯化钠注射液瓶升高至距离实验眼150cm处，此高度可在眼内形成110mmHg的眼压，此时肉眼可见球结膜苍白，眼底镜可见视网膜缺血，维持60分钟。而后降低氯化钠注射液瓶高度使其与实验动物眼部达到同一水平，拔出针头，此时可见眼结膜充血，视网膜血液，立即重新再灌注，视网膜动脉及静脉立即恢复高眼压前的充盈状态。术后大鼠双眼涂抗生素眼膏，待清醒后回笼，持续喂养28天。

3.2给药：

灌胃给药，实施例1组每日给予实施例1样品，市售品组给予市售银杏叶提取物样品(总黄酮醇苷24.4％，银杏内酯4.8％)，3个对比例组分别给予对比例3-5中的样品，该样品均为对应的对比例按照实施例7的方法制备成的制剂，给药剂量均为5mg/ml。阳性对照组每日给予灯盏细辛5mg/kg，阴性对照组每日给予生理盐水5ml/kg，连续给药28天。

各组实验期满后取视网膜作全层铺片，甲酚固紫染色后行RGCL神经元计数。每张待测视网膜铺片通过视乳头对称画线，将其分为颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限，并将每一象限视网膜分为3等份，即中央、中间和周边3区，各分区随机取3个点，每点面积为32500μm²，然后对每点的视网膜神经元细胞进行计数，然后换算成每平方毫米的细胞数，将每区3点细胞密度的均数作为该区的神经元密度。

通过形态学易于辨认RGCL中的血管内皮细胞，具有浓染的核并且无尼氏物质的细胞为胶质细胞，这两种细胞均不纳入RGCL神经元计数。

4、统计学处理：SPSS11.0统计软件处理。

5、结果：

表1：大鼠双眼RGCL神经元计数

分组	右眼	左眼
			阳性对照组	3484.3±10.9	3476.2±19.5
实施例1组	3470.0±12.5	3476.6±17.3
			市售品组	2544.5±9.9	3477.5±16.8
对比例3组	2762.6±14.2	3475.9±17.8
			对比例4组	2650.8±17.1	3476.4±18.1
对比例5组	2683.9±15.3	3478.1±17.2
			阴性对照组	1983.2±20.6	3480.5±16.5

结果见表1，阳性对照组大鼠右眼(实验眼)和左眼(自身对照眼)的RGCL神经元计数分别为(3476.2±19.5)个/mm²和(3484.3±10.9)个/mm²，双眼比较无显著性差异，且从中央区到周边区神经元计数逐渐减少。实施例1组右眼与左眼RGCL神经元计数无显著性差异，与阳性对照组比较无显著性差异，与市售品组及对比例3-5组相比有显著性差异(p＜0.05)，与阴性对照组比较有极显著性差异(p＜0.01)。

实验例4：对缺血型视网膜中央静脉阻塞的治疗作用

一般资料：随机抽取通过眼底荧光造影确诊为缺血性视网膜中央静脉阻塞或其分支阻塞的病例90例，均为单眼发病，男41例，女49例，年龄42-70岁。将患者分为3组，观察1组30例，男13例，女17例，年龄最大70岁，最小45岁，病程13天-4个月，视力0.02-0.3。观察2组30例，男15例，女15例，年龄最大70岁，最小42岁，病程15天-4个月，视力0.02-0.3。对照组30例，男13例，女17例，年龄最大68岁，最小45岁，病程15天-4个月，视力0.02-0.3。3组性别、年龄、病程和视力等比较均具可比性。

诊断标准：参照《眼科全书》诊断标准：1)视力严重受损；2)视网膜有多量出血和棉絮斑，视盘和视网膜明显水肿；3)荧光血管造影有视网膜毛细血管无灌注区、动静脉短路。所有病例经检查无合并其他眼底疾病。

治疗方法：观察1组给予实施例6样品，观察2组给予市售品，对照组给予血栓通注射液，每天1次，每次20ml，均加入5％葡萄糖注射液稀释至250ml后使用。10天1个疗程。治疗3个疗程后观察视力及眼底荧光造影情况。

疗效判定标准：1)治愈：视力或矫正视力恢复至1.0以上，症状消失，视网膜及视盘水肿消退，眼底荧光血管造影无明显无灌注区，中心或旁中心暗点消失；2)显效：视力提高4行以上，症状明显减轻，黄斑有轻度水肿，视网膜水肿明显好转，出血及渗出大部分吸收，眼底荧光血管造影无灌注区较就诊时明显减小；3)好转：视力提高2-3行，黄斑水肿减轻，眼底出血部分吸收，留有较多硬性渗出；4)无效：视力无提高，眼底渗出及出血无明显变化，静脉扩张，远端有血管闭塞，有新生血管形成。

统计学处理：对计数资料采用X²检验。

结果：3组均无治愈病例。观察1组总有效率为87％，观察2组总有效率为83％，对照组为80％，观察1组和2组与对照组间比较无显著性差异；观察1组显效率为63％，观察2组显效率为37％，对照组为27％，观察1组与观察2组比较有显著性差异，观察2组与对照组比较无显著性差异。观察1组治疗后视力达0.4-0.9的为17例，观察2组10例，对照组8例，观察1组与观察2组比较有显著性差异，观察2组与对照组比较无显著性差异。3组在用药过程中均未发现明显不良反应。

结果表明，本发明提供的组合物具有抗缺氧缺血诱导的视网膜细胞损害的重要作用，对缺血型视网膜中央静脉阻塞有显著治疗作用。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种银杏叶组合物，其特征在于，该组合物中含有24-39%总黄酮醇苷、6.5-18%银杏内酯、2-5%白果内酯，6-15%的总氨基酸，6-18%的总糖，且银杏酸少于百万分之三，其由以下方法制备：称取银杏叶，用3-6倍量的65-80%乙醇回流提取2次，每次1-2小时，合并提取液，在pH值7.0-8.0的条件下静置12-36小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加水稀释后调pH值4.0-5.5，离心，离心液上大孔吸附树脂柱，依次用纯化水、浓度为2.5-3.5%的乙酸钠溶液、纯化水、浓度为20%的乙醇冲洗，然后用70-75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药3.8-4.2g/ml，加入乙醇使含醇量达80-90%，调节pH值7.0-8.0，静置24-36小时，浓缩，干燥，粉碎，混合得组合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物中含有28-39%总黄酮醇苷、6.5-18%银杏内酯、3-4%白果内酯，且银杏酸少于百万分之一。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，总黄酮醇苷的苷元是由槲皮素、山奈素和异鼠李素按照重量比为0.9-1.3:1:0.35-0.8组成。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有药学上可接受的载体或稀释剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，该组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或注射剂，所述注射剂为注射液、注射用无菌粉末、注射用冻干粉和注射用浓溶液。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，该组合物为注射液，由20-45%总黄酮醇苷、4-18%银杏内酯、2-6%白果内酯与山梨醇、乙醇、丙二醇或羟丙基-β-环糊精中的一种或多种组成，每种辅料所占比例为1-5%，多种辅料总和不超过10%，且该注射液中的银杏酸少于百万分之五。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的组合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

称取银杏叶，用3-6倍量的65-80%乙醇回流提取2次，每次1-2小时，合并提取液，在pH值7.0-8.0的条件下静置12-36小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加水稀释后调pH值4.0-5.5，离心，离心液上大孔吸附树脂柱，依次用纯化水、浓度为2.5-3.5%的乙酸钠溶液、纯化水、浓度为20%的乙醇冲洗，然后用70-75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，回收乙醇至无醇味，浓缩至含生药3.8-4.2g/ml，加入乙醇使含醇量达80-90%，调节pH值7.0-8.0，静置24-36小时，浓缩，干燥，粉碎，混合得组合物。

8.权利要求1-6任一项所述的组合物在制备治疗静脉栓塞、视网膜静脉中央阻塞、改善视力障碍的药物中的应用。