CN103479702A - 一种红花黄色素的提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红花黄色素的提取方法及其应用，红花经水粗提、分离、过滤、醇沉、上聚酰胺柱经酸洗杂质及碱液洗脱、浓缩干燥得到红花黄色素。所得红花黄色素与可接受的注射剂辅料混合，按常规的注射剂制剂工艺制得注射剂。其中在聚酰胺柱洗脱时采用酸性洗脱液洗脱杂质；碱性洗脱液洗脱红花黄色素，碱性洗脱液优选pH值为9.50～10.50氨的乙醇溶液，由此方法制得的红花黄色素含量高。

Description

一种红花黄色素的提取方法及应用

技术领域

本发明属于医药产品研究开发技术领域，特别涉及从红花中提取红花黄色素的方法及应用。

技术背景

心血管疾病是危害人类健康的第一杀手，近年来，随着我国人口老龄化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生频率也逐年增加，严重威胁着人民的身体健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、抗缺氧作用，其中一些已经开发成治疗冠心病和心绞痛的新药。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、抗缺氧生理活性的有效物质，是获得新药的有效途径之一。目前，我国从天然产物中提取活性提取物质，用于开发成治疗冠心病。安全性好，毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗心肌缺血，用于治疗冠心病和心绞痛的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。

中药红花为菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花，是传统的活血化瘀药，具有活血化瘀、通经止痛的功效，临床上利用红花或含红花的方剂治疗冠心病、心绞痛等诸多血液循环障碍疾病有很好疗效，同时，总红花黄色素因具有很好的着色能力很强的稳定性，也作为食用色素而广泛应用。

早期从红花中提取红花黄色素的主要方法是水提醇沉法，所得产品纯度较低。近年来，利用大孔吸附树脂或膜技术进行纯化所得产品在纯度上有了很大的提高，但是收率较低，有效成分在纯化过程损失严重。例如CN1284794C中采用“提取-分离-醇沉-多次纯化-制剂”的工艺流程，采用此方法得到的提取物纯度较高，但需要纯化两次以上，且收率低于2％，难以创造经济效益。CN1935176B中也在用“提取-分离-纯化-制剂”的工艺流程，采用此方法得到的红花提取物含量较高，但纯化时所用陶瓷膜成本较高且所得提取物红花黄色素含量不高。CN101007828A中采用非极性大孔树脂层析和反渗透浓缩技术提取红花红色素，并在上柱前将提取液调为酸性，有利于杂质的洗脱。CN102382151A中采用酸性洗脱液洗脱杂质。《中国野生植物资源》第23卷第1期，吴冬青、林敏、许莹堂等，其中报道了用酸性乙醇溶液提取红花黄色素的方法。

在充分研究了现有技术的前提下，本发明人提出了一种新的红花黄色素提取方法，此方法提取工艺简单，洗脱效率高，成本低廉，所得红花黄色素含量达到在药品注射剂上应用的要求。

发明内容

本发明的目的是提供了一种红花黄色素提取物方法及应用，红花经过水粗提、大孔吸附树脂分离、过滤纯化、醇沉以及聚酰胺再纯化，得到红花黄色素，然后将其用于注射剂的生产。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现，具体实施步骤如下：

粗提：中药材红花用10倍水(重量体积比)提取得提取液，经过滤得滤液I；

分离：将滤液I上大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水、七个柱体积的30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液；

过滤：30％的乙醇洗脱液首先经过滤，再进行浓缩；

醇沉：将浓缩液加入95％乙醇调成70％～90％乙醇溶液，静置；

纯化：将醇沉液过滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II；

再纯化：将滤液II用酸调PH为2.00～5.00，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶6～1∶10)，先用酸的醇溶液洗脱，再用酸或酸水洗脱，然后用水洗脱，然后再用氨的醇溶液洗脱红花黄色素，洗脱下来的氨的醇溶液用酸调成中性，干燥得红花黄色素。

上述方法所得红花黄色素与药用辅料按常规的注射剂制剂工艺制成注射剂。

本发明的另一个优选方案，其中过滤30％的乙醇洗脱液时，优选超滤膜。本发明的又一个优选方案，其中对过滤后的30％乙醇洗脱液进行浓缩时，优选采用纳滤膜进行浓缩。

本发明的又一个优选方案，其中醇沉的乙醇浓度为70％～80％，优选乙醇浓度为80％时进行醇沉。

本发明的又一个优选方案，其中采用聚酰胺柱的径高比优选1∶8。

本发明的又一个优选方案，其中采用1％～10％的酸的醇溶液，酸为盐酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、水杨酸中的一种或几种的混合，醇为甲醇、乙醇中的一种或两种的混合；

其中采用酸洗脱聚酰胺柱时，酸是PH值为2.00～5.00的盐酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、水杨酸中的一种或几种的混合物或其中一种的水溶液或其中几种的组合的水溶液，优选乙酸或乙酸的水溶液；

氨的醇溶液是PH值为8.50～12.50的氨的甲醇溶液、氨的乙醇溶液、氨的丙醇溶液、氨的异丙醇溶液中的一种或几种混合液，优选氨的乙醇溶液。

本发明的又一优选方案，提取得到的红花黄色素可以制成粉针剂、大输液、小水针，优选粉针剂。

本发明采用聚酰胺纯化过程中，上柱药液用酸调其PH值为2.00～5.00，然后用酸的醇溶液洗脱，再用酸洗脱，这样在洗掉了杂质的同时，仅损失较少的红花黄色素。发明人经过多次试验，选择用1～4个柱体积1％～10％的酸的醇溶液和3～5个柱体积的PH值为2.00～5.00的酸或酸的水溶液洗脱可以得到较好的结果，再用1～3个柱体积的水冲洗柱，用3～5个柱体积的PH值为8.50～12.50的氨的醇溶液洗脱，可以将红花黄色素很好的洗脱下来。采用上述方法可以很好的达到分离纯化的目的，且得到的提取物中红花黄色素含量较高。

具体实验结果如下：

表1为采用聚酰胺柱纯化时，不同浓度的酸的醇的洗脱液，相同PH值的酸或酸的水洗脱液，相同PH值的氨的醇洗脱液洗脱，所得红花黄色素含量的变化，具体实施方法如下：取四份相同的滤液II，分别用浓度为1％、3％、8％、10％的盐酸的乙醇溶液洗脱杂质。

聚酰胺湿法装柱(柱的径高比1∶8)，将滤液II的PH值用盐酸调为3.00，然后依次用2个柱体积的乙酸的乙醇溶液，4个柱体积乙酸液洗脱杂质，2个柱体积水洗脱，4个柱体积的PH值为9.50的氨的乙醇溶液洗脱，将洗脱下来的4个柱体积的氨的乙醇溶液合并，调为中性，浓缩干燥，得红花黄色素。

表1不同PH值的酸的醇的洗脱液对提取物中红花黄色素的含量的影响

表2为采用聚酰胺柱纯化时，相同浓度的酸的醇的洗脱液，不同PH值的酸性洗脱液，相同PH值的碱性洗脱液洗脱，所得红花黄色素含量的变化，具体实施方法如下：取四份相同的滤液II，分别用PH值为2.00、3.10、3.30、5.00的盐酸洗脱杂质。

聚酰胺湿法装柱(柱的径高比1∶8)，将滤液II用盐酸将其PH值调为3.00，然后依次用3个柱体积的5％的盐酸的乙醇溶液洗脱，4个柱体积盐酸溶液洗脱杂质，2个柱体积水洗脱，4个柱体积的PH值为10.50的氨的乙醇溶液洗脱，将洗脱下来的4个柱体积的氨的乙醇溶液合并，调为中性，浓缩干燥，得红花黄色素。

表2不同PH值酸性洗脱液对提取物中红花黄色素的含量的影响

表3为采用聚酰胺柱纯化时，相同PH值的酸的醇的洗脱液，相同PH值的酸或酸的水洗脱液，改变碱性洗脱液的PH值，对红花黄色素含量的影响，具体实施方法如下：取四份相同的滤液II，分别用PH值为8.50、9.50、10.50、12.50的氨的乙醇溶液洗脱红花黄色素。

聚酰胺湿法装柱(柱的径高比1∶8)，用盐酸将滤液II的PH值调为3.00，然后依次用1个柱体积6％的乙酸的乙醇溶液，4个柱体积PH值为3.10的盐酸溶液洗脱杂质，2个柱体积水洗脱，4个柱体积的氨的乙醇溶液洗脱，将洗脱下来的4个柱体积的氨的乙醇溶液合并，调为中性，浓缩干燥，得红花黄色素。

表3不同PH值碱性洗脱液对提取物中红花黄色素的含量的影响。

采用紫外吸光光度法测定上述总红花黄色素的含量，吸收波长为332nm，按外标法计算供试品溶液中相当于羟基红花黄色素A的量。

采用高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量，检测波长为403nm，C₁₈柱，流动相A：0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液(磷酸调节PH值为4.00)；流动相B：乙腈。流速为1.0ml/min。理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算，应不低于3000。

本发明工艺简单，成本低廉，由于采用酸性洗脱液洗杂质，碱性洗脱液洗脱红花黄色素的新洗脱方法，较目前的提取方法，具有纯化次数少，聚酰胺洗脱过程收率高的优点。

具体实施方式

本发明所述的涉及一种红花黄色素的提取方法及应用包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限定本发明。

实施例I：

药材红花1kg，用10L的80℃水提取一小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为10万的超滤膜过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇80％的溶液进行醇沉，12小时后，用0.45μm的微孔滤膜进行压滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用乙酸调PH值为5.00，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶8)进行分离，依次以2个柱体积10％的乙酸的乙醇溶液洗脱、4个柱体积乙酸洗脱、2个柱体积水洗柱、4个柱体积PH值为10.50的氨的乙醇溶液洗脱，收集4个柱体积的氨的乙醇洗脱液，用乙酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量92％，羟基红花黄色素A含量31％。

实施例II：

药材红花1kg，用10L的70℃水提取1小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为10万的超滤膜过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇80％的溶液进行醇沉，12小时后，过滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用盐酸调PH值为3.30，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶8)进行分离，依次以1个柱体积8％的盐酸的乙醇溶液洗脱、4个柱体积PH值为3.30的盐酸洗杂质、2个柱体积水洗柱、4个柱体积PH值为9.50的氨的乙醇溶液洗脱，收集4个柱体积的氨的乙醇洗脱液，用稀盐酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量90％，羟基红花黄色素A含量27％。

实施例III：

药材红花1kg，用10L的30℃水提取1小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为20万的超滤膜过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇70％的溶液进行醇沉，24小时后，用0.22μm的微孔滤膜进行压滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用柠檬酸调PH值为4.50，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶9)进行分离，依次以2个柱体积1％的柠檬酸的乙醇溶液洗脱、3个柱体积PH值为4.50的柠檬酸水溶液洗杂质、1个柱体积水洗柱、4个柱体积PH值为12.50的氨的异丙醇溶液洗脱，收集4个柱体积的氨的异丙醇洗脱液，用柠檬酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量85％，羟基红花黄色素A含量21％。

实施例IV：

药材红花1kg，用10L的40℃水提取1小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为5万的超滤膜过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇90％的溶液进行醇沉，24小时后，过滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用稀硫酸调PH值为2.00，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶9)进行分离，依次以4个柱体积1％的苹果酸的甲醇溶液洗脱、5个柱体积PH值为2.00的硫酸水溶液洗杂质、1个柱体积水洗柱、5个柱体积PH值为12.50的氨的甲醇溶液洗脱，收集5个柱体积的氨的甲醇洗脱液，用稀硫酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量83％，羟基红花黄色素A含量21％。

实施例V

药材红花1kg，用10L的50℃水提取1小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经袋式过滤器过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇90％的溶液进行醇沉，24小时后，过滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用酒石酸调PH值为4.50，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶10)进行分离，依次以2个柱体积5％的酒石酸的丙醇溶液洗脱、5个柱体积PH值为4.50的酒石酸水溶液洗杂质、1个柱体积水洗柱、3个柱体积PH值为8.50的氨的丙醇溶液洗脱，收集3个柱体积的氨的丙醇洗脱液，用酒石酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量80％，羟基红花黄色素A含量19％。

实施例VI

药材红花1kg，用10L的20℃水提取1小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为1万的超滤膜过滤，减压浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇90％的溶液进行醇沉，24小时后，过滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用草酸调PH值为4.00，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶7)进行分离，依次以4个柱体积3％的草酸的乙醇溶液洗脱、3个柱体积PH值为4.00的草酸水溶液洗杂质、3个柱体积水洗柱、4个柱体积PH值为11.00的氨的乙醇溶液洗脱，收集4个柱体积的氨的乙醇洗脱液，用草酸水溶液调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量82％，羟基红花黄色素A含量20％。

实施例VII：

药材红花1kg，用10L的60℃水提取一小时，共提取两次。合并两次提取液，过滤，得到滤液I，上HPD600大孔吸附树脂柱(柱的径高比1∶9)分离，依次以一个柱体积水洗柱、七个柱体积30％乙醇洗脱。收集合并30％乙醇洗脱液，经截留分子量为10万的超滤膜过滤，纳滤膜浓缩，收集纳滤膜的截留物，加入95％乙醇调成含乙醇80％的溶液进行醇沉，12小时后，用0.65μm的微孔滤膜进行压滤，滤液浓缩至无醇得到滤液II，用乙酸和盐酸调PH值为2.50，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶8)进行分离，依次以5个柱体积3％的乙酸和氯化氢的乙醇溶液洗脱、4个柱体积PH值为2.50的乙酸和盐酸的混合洗脱液洗杂质、2个柱体积水洗柱、4个柱体积PH值为10.50的氨的乙醇溶液洗脱，收集4个柱体积的氨的乙醇洗脱液，用乙酸调节PH值为中性，喷雾干燥得提取物，该提取物中总红花黄色素含量82％，羟基红花黄色素A含量25％。

实施例VIII：称取上述实验所提取得到的红花黄色素500g，加入到500g甘露醇与8L注射用水的混合液中，待其充分混合后，无菌过滤，灌装，冻干，压盖，检测，包装得成品。

Claims (13)

1.一种红花黄色素的提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)红花用10倍量(重量体积比)的水提取1～2小时，共提取两次，合并两次提取液，过滤，得滤液I；

(2)滤液I上大孔树脂柱分离，依次以一个柱体积水、七个柱体积30％乙醇洗脱，合并七个柱体积30％乙醇洗脱液；

(3)30％乙醇洗脱液经过滤、浓缩后，加入95％乙醇调成含乙醇70～90％的溶液进行醇沉，过滤得滤液II；

(4)将滤液II的PH值调为2.00～5.00，上聚酰胺柱(柱的径高比1∶6～1∶10)进行纯化，按下列顺序进行洗脱：

1～4个柱体积1％～10％的酸的醇溶液；

3～5个柱体积PH值为2.00～5.00的酸或酸的水溶液洗脱；

1～3个柱体积的水洗脱；

3～5个柱体积PH值8.50～12.50的氨的醇溶液洗脱，收集氨的醇溶液的洗脱液，用酸调成中性并浓缩，喷雾干燥得红花黄色素。

2.根据权利要求1所述步骤(3)，其特征在于用超滤膜进行过滤。

3.根据权利要求1所述步骤(3)，其特征还在于采用纳滤膜进行浓缩。

4.根据权利要求1所述步骤(4)，其特征在于酸的醇溶液优选3％～8％酸的醇溶液。

5.根据权利要求1所述步骤(4)，其特征在于酸优选PH值为3.10～3.30的酸或酸的水溶液。

6.根据权利要求1所述步骤(4)，其特征在于氨的醇溶液优选PH值为9.50～10.50的氨的醇溶液。

7.根据权利要求1所述步骤(4)中的喷雾干燥得到的红花黄色素与药用辅料按常规的注射剂制剂工艺制成注射剂。

8.根据权利要求4所述的酸的醇溶液，其中酸为盐酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、水杨酸中的一种或几种的混合，优选乙酸。

9.根据权利要求4所述的酸的醇溶液，其中醇为甲醇、乙醇中的一种或两种的混合，优选乙醇。

10.根据权利要求5所述的酸，其为盐酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、水杨酸中的一种或几种的混合物或其中一种的水溶液或其中几种的组合物的水溶液，优选乙酸或乙酸的水溶液。

11.根据权利要求6所述的氨的醇溶液，其为氨的甲醇溶液、氨的乙醇溶液、氨的丙醇溶液、氨的异丙醇溶液中的一种或几种混合溶液。

12.根据权利要求7所述的注射剂，优选粉针剂。

13.根据权利要求11所述氨的醇溶液，优选氨的乙醇溶液。