CN103376300B - 注射用丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法，所述检测方法步骤如下：步骤1，对照品溶液的制备；步骤2，取丹参多酚酸溶解，得水解前未水解样品溶液；步骤3，取丹参多酚酸溶解，然后水解，得水解样品溶液；步骤4，测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的没食子酸；儿茶素；鞣花酸；步骤5，比较色谱图判断丹参多酚酸中是否存在鞣质类成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药检测领域，具体涉及一种注射用丹参多酚酸中鞣质类物质的排除性检测方法。
背景技术
鞣质，又称单宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。根据鞣质的化学结构可分为两大类：可水解鞣质和缩合鞣质。可水解鞣质依水解后所得酚酸类的不同，又可分为没食子酸鞣质和逆没食子酸鞣质(鞣花酸鞣质)。由于鞣质都是以没食子酸、鞣花酸和儿茶素为构成单位，通过各种结合方式形成二聚体、三聚体，进而形成低聚体及多聚体。所以通过测定样品中水解前后没食子酸、儿茶素、鞣花酸的情况，可以间接反映样品中鞣质的情况。
鞣质常常被作为杂质除去，因为在中药制剂中，鞣质不但会对制剂的稳定性和澄明度产生影响，甚至会引起许多严重的生理反应。它能与组织蛋白结合形成硬结，导致注射局部组织肿瘤、坏死[2]；它还会加速红细胞的凝聚，并能与血红蛋白形成药物性沉淀[3]。近年来中药注射剂的安全性问题已经引起了人们的普遍关注，由于在丹参的原药材中存在鞣质类物质，因此，对于注射用丹参多酚酸，鞣质类物质经过制剂工艺后的排除性检测就显得分外重要。
丹参多酚酸为一种活血、化瘀、通脉的药物。其中含有多种酚酸类成分，用于冠心病稳定型心绞痛，分级为I、II级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸。
药理试验表明，丹参多酚酸对冠状动脉结扎引起的犬急性心肌梗死有降低心电图ST段抬高程度，减少梗死面积，降低血清LDH的作用，对ADP诱导的大鼠血小板凝集有一定的抑制作用，对大鼠动静脉旁路血栓形成有抑制作用。
丹参多酚酸的制备属于现有技术，其在制备过程中根据不同工艺可能出现杂质鞣质类成分，目前丹参多酚酸去除鞣质的方法主要有明胶沉淀法、碱性醇沉法和聚酰胺吸附法等，但是由于丹参多酚酸样品中成分较为复杂，分离效果不好，如果操作不当，可能引入鞣质。
目前市场上已经有注射用丹参多酚酸：
【药品名称】
通用名称：注射用丹参多酚酸
汉语拼音：ZhusheyongDanshenDuofensuan
【成份】丹参多酚酸；辅料为甘露醇。
【性状】本品为浅棕色至棕色的粉末或疏松状物；有引湿性。
【功能主治】活血通络。用于中风病中经络(轻中度脑梗死)恢复期瘀血阻络证，症见半身不遂，口舌歪斜，舌强言謇，偏身麻木等症状。
【制备】取一定量丹参原药材，加水煎煮三次，合并煎液，冷却，静置，离心或过滤去除沉淀，过聚酰胺柱，洗脱液过AB-8型大孔吸附树脂，用水洗脱，弃去水液，用乙醇进行洗脱，减压回收乙醇至无醇味，调节pH近中性，最后加入甘露醇，包装，即得。
为检测丹参多酚酸中包括注射用丹参多酚酸中的鞣质成分，本发明提供一种丹参多酚酸样品中鞣质的检测方法，该方法可对鞣质类三种物质同时进行检测，方便了操作。
发明内容
本发明提供一种丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别制成相应的对照品溶液；
步骤2，取丹参多酚酸溶于丙酮，得水解前未水解样品溶液；
步骤3，取丹参多酚酸溶于丙酮，加酸水解，得水解样品溶液；
步骤4，采用C18色谱柱，流动相甲醇-磷酸水溶液等度洗脱，检测器为紫外检测器，测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的没食子酸；
步骤5，采用C18色谱柱，流动相甲醇-磷酸水溶液梯度洗脱，检测器为紫外检测器测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的儿茶素；
步骤6，采用C18色谱柱，流动相乙腈-磷酸水溶液等度洗脱，检测器为紫外检测器测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的鞣花酸；
步骤7，比较未水解样品溶液和水解样品溶液与对照品溶液的色谱图判断丹参多酚酸溶液中是否存在鞣质类成分。
其中，
步骤1对照品溶液的制备，方法如下：
分别精密称取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别加甲醇制成相应的对照品溶液，得没食子酸质量浓度为0.5451mg.mL-1、儿茶素质量浓度为0.5079mg.mL-1、鞣花酸质量浓度为0.5067mg.mL-1的对照品溶液。
步骤2未水解样品溶液的制备：精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
步骤3水解样品溶液的制备：精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h。后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
其中，没食子酸液相色谱条件：色谱柱为VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相为：2∶98-40∶60的甲醇-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.01-0.1％，住温：25-35℃，检测波长为256-280。
优选的：色谱柱为VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相为甲醇-0.05％磷酸水溶液(5∶95)等度洗脱，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm。
儿茶素液相色谱条件：色谱柱为VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相为甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm。梯度洗脱条件如下：
鞣花酸液相色谱条件：色谱柱为VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相为10∶90-40∶60的乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.1-0.3％，柱温：25-50℃，检测波长为240-270。
优选的，色谱柱为VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸溶液(18∶82)，流速为1.0mL.min-1；柱温40℃；检测波长254nm。
以上经过处理的样品分别进样，进样体积：5uL。进样方法如下：
第一组：取没食子酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第二组：取儿茶素标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第三组：取水解后样品、水解后样品加儿茶素标准品5滴、水解后样品加儿茶素15滴分别进样检测；
第四组：取鞣花酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第五组：取水解后样品、水解后样品加鞣花酸标准品5滴、水解后样品加鞣花酸标准品15滴分别进样检测。
进样后分别得到图1-图5，对色谱图进行比较，根据对照品溶液的色谱图，判断未水解样品溶液和水解样品溶液中是否存在鞣质类成分，经过分析水解前后的丹参多酚酸样品的色谱图中，在没食子酸标准品的色谱峰位置，没有相应峰出现；但水解后样品中，儿茶素、鞣花酸标准品位置的附近有可疑峰存在，当在水解后的样品中加入相应标准品再次测定，可确认可疑峰并非儿茶素和鞣花酸的峰。
因此，可以认为样品中的鞣质类物质已经被除去，得到的丹参多酚酸中没有鞣质类物质或含量极低。
本发明可以定性的判断药物丹参多酚酸中是否含有鞣质类物质，如果有这类物质，也可以定量的分析其含量，因此本发明是一种灵敏度极高的可同时检测多种鞣质类物质的方法。
本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1.仪器和材料
Waters2695型高效液相色谱单元，配Waters2489型紫外检测器(美国WATERS公司)；AL204型万分之一电子分析天平；XS105型十万分之一电子分析天平(瑞士METTLER公司)；KQ-100E型超声波清洗器；DK-S28型电热恒温水浴锅。
丹参多酚酸(天津天士力之骄药业有限公司提供)；没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，纯度大于90.1％，批号：110831-200803)；儿茶素对照品(中国食品药品检定研究院，纯度大于94.4％，批号：110877-201102)；鞣花酸对照品(天津一方科技有限公司，纯度大于98％)；丙酮；盐酸；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；磷酸(色谱纯)；超纯水。
2.实验方法
2.1色谱条件
2.1.1没食子酸液相色谱条件[6]
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：甲醇-0.05％磷酸水溶液(5∶95)等度洗脱；流速：0.8mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样体积：3uL。
2.1.2儿茶素液相色谱条件
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速：0.8mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样体积：5uL。
表1梯度洗脱条件
2.1.3鞣花酸液相色谱条件[7]
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：乙腈-0.2％磷酸溶液(18∶82)；流速：1.0mL.min-1；柱温：40℃；检测波长：254nm；进样体积：10uL。
2.2对照品及样品溶液制备
2.2.1对照品溶液的制备
分别精密称取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别加甲醇制成相应的对照品溶液，得没食子酸质量浓度为0.5451mg.mL-1、儿茶素质量浓度为0.5079mg.mL-1、鞣花酸质量浓度为0.5067mg.mL-1的对照品溶液。
2.2.2未水解样品溶液的制备
精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3水解样品溶液的制备
精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h。后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
3实验结果见附图1-5
水解前后的丹参多酚酸样品的色谱图中，在没食子酸标准品的色谱峰位置，没有相应峰出现；而在儿茶素、鞣花酸标准品位置的附近有有可疑峰存在，样品中加入相应标准品再次测定，确认了可疑峰并非儿茶素和鞣花酸的峰。丹参原药材在经过工艺中的聚酰胺处理后，其中的鞣质类物质已经被除去，得到的注射用丹参多酚酸中没有鞣质类物质存在。
丹参原药材在经过制剂工艺中的聚酰胺树脂柱处理后，得到的注射用丹参多酚酸中没有鞣质类物质存在，说明选用聚酰胺去除鞣质的方法可靠。
在流动相的选择过程中，试图采用合适的梯度条件同时测定没食子酸、儿茶素、鞣花酸的混合标准品以及水解前后的丹参多酚酸样品，但是由于丹参多酚酸样品中成分较为复杂，分离效果不好，所以改为用3个不同的色谱条件对没食子酸、儿茶素、鞣花酸标准品以及水解前后丹参多酚酸样品进行测定，以达到好的分离效果，便于鞣质类物质的排除性检测。
选用高效液相色谱法对注射用丹参多酚酸中的鞣质类物质进行排除性检测，操作简单，结果精确稳定，也为其他药材中鞣质的检测及含量测定起到一定借鉴作用。
参考文献
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附图说明
图1没食子酸对照品及样品水解前后色谱对照图(1.没食子酸标准品；2.水解前样品；3.水解后样品)
图2儿茶素对照品及样品水解前后色谱对照图(1.儿茶素标准品；2.水解前样品；3.水解后样品)
图3水解后样品及加不同量儿茶素标准品后色谱对照图(1.水解后样品图；2.水解后样品加儿茶素5滴；3.水解后样品加儿茶素15滴)
图4鞣花酸对照品及样品水解前后色谱对照图(1.鞣花酸标准品；2.水解前样品；3.水解后样品)
图5水解后样品及加不同量鞣花酸标准品后色谱对照图(1.水解后样品图；2.水解后样品加鞣花酸5滴；3.水解后样品加鞣花酸15滴)
具体实施方式
通过下面具体实施方式解释本发明的内容，并不是对本发明保护范围的进一步限定。
实施例1、
注射用丹参多酚酸的制备：取一定量丹参原药材，加水煎煮三次，合并煎液，冷却，静置，离心或过滤去除沉淀，过聚酰胺柱，洗脱液过AB-8型大孔吸附树脂，用水洗脱，弃去水液，用乙醇进行洗脱，减压回收乙醇至无醇味，调节pH近中性，最后加入甘露醇，包装，即得。
检测：未水解样品溶液的制备：精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
水解样品溶液的制备：精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h。后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
取以上两份样品用Waters2695型高效液相色谱单元，配Waters2489型紫外检测器(美国WATERS公司)进行检测，具体的液相条件如下：
没食子酸液相色谱条件
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：甲醇-0.05％磷酸水溶液(5∶95)等度洗脱；流速：0.8mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样体积：3uL。
儿茶素液相色谱条件
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速：0.8mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样体积：5uL。
表1梯度洗脱条件
鞣花酸液相色谱条件
色谱柱：VenusilXBPC18(250×4.6mm，5um)；流动相：乙腈-0.2％磷酸溶液(18∶82)；流速：1.0mL.min-1；柱温：40℃；检测波长：254nm；进样体积：10uL。
结果在没食子酸、儿茶素、鞣花酸位置均未出现相应色谱峰，但是在儿茶素、鞣花酸标准品位置附近有可疑峰出现，通过往相应的样品溶液中加入对照品再次测定的方法验证并非这两种物质后，最终确认在注射用丹参多酚酸中没有这三种物质。
实施例2、
步骤1对照品溶液的制备，方法如下：
分别精密称取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别加甲醇制成相应的对照品溶液，得没食子酸质量浓度为0.5451mg.mL-1、儿茶素质量浓度为0.5079mg.mL-1、鞣花酸质量浓度为0.5067mg.mL-1的对照品溶液。
步骤2未水解样品溶液的制备
精密称定注射用丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
步骤3水解样品溶液的制备
精密称定注射用丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h。后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
上述溶液配制后进样，以上经过处理的样品分别进样，进样体积：5uL。进样方法如下：
第一组：取没食子酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第二组：取儿茶素标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第三组：取水解后样品、水解后样品加儿茶素标准品5滴、水解后样品加儿茶素15滴分别进样检测；
第四组：取鞣花酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第五组：取水解后样品、水解后样品加鞣花酸标准品5滴、水解后样品加鞣花酸标准品15滴分别进样检测。
其中的色谱条件如下：
没食子酸液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为：2∶98的甲醇-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.01％，住温：25℃，检测波长为256nm。
儿茶素液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm。梯度洗脱条件如下：
鞣花酸液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为10∶90的乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.05％，柱温：25℃，检测波长为240nm。
结果在没食子酸、儿茶素、鞣花酸位置均未出现相应色谱峰，但是在儿茶素、鞣花酸标准品位置附近有可疑峰出现，通过往相应的样品溶液中加入对照品再次测定的方法验证并非这两种物质后，最终确认在注射用丹参多酚酸中没有这三种物质。
其中，注射用丹参多酚酸可以从市场上购买。
实施例3、
步骤1对照品溶液的制备，方法如下：
分别精密称取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别加甲醇制成相应的对照品溶液，得没食子酸质量浓度为0.5451mg.mL-1、儿茶素质量浓度为0.5079mg.mL-1、鞣花酸质量浓度为0.5067mg.mL-1的对照品溶液。
步骤2未水解样品溶液的制备
精密称定注射用丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
步骤3水解样品溶液的制备
精密称定注射用丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h。后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22um微孔滤膜过滤，即得。
上述溶液配制后进样，以上经过处理的样品分别进样，进样体积：5uL。进样方法如下：
第一组：取没食子酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第二组：取儿茶素标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第三组：取水解后样品、水解后样品加儿茶素标准品5滴、水解后样品加儿茶素15滴分别进样检测；
第四组：取鞣花酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第五组：取水解后样品、水解后样品加鞣花酸标准品5滴、水解后样品加鞣花酸标准品15滴分别进样检测。
其中的色谱条件如下：
没食子酸液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为：40∶60的甲醇-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.1％，住温：35℃，检测波长为280nm。
儿茶素液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm。梯度洗脱条件如下：
鞣花酸液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为40∶60的乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸水溶液中磷酸含量为1.5％，柱温：50℃，检测波长为270nm。
其中，注射用丹参多酚酸可以从市场上购买。
Claims (6)
1.一种丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别制成相应的对照品溶液；步骤2，取丹参多酚酸溶于丙酮，得水解前未水解样品溶液；
步骤3，精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于5ml60％的丙酮中，再加入5ml2mol/L的盐酸溶液，于100℃水解4h，后用60％丙酮补加溶剂到10ml，0.22μm微孔滤膜过滤，得水解样品溶液；
步骤4，采用C18色谱柱，流动相为：2：98-40:60的甲醇-磷酸水溶液进行等度洗脱，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.01-0.1％，柱温：25-35℃，检测波长为256-280nm，检测器为紫外检测器，测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的没食子酸；
步骤5，采用C18色谱柱，流动相甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，检测器为紫外检测器，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm，测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的儿茶素，梯度洗脱条件如下；
步骤6，采用C18色谱柱，流动相为10：90-40:60的乙腈-磷酸水溶液进行等度洗脱，其中磷酸水溶液中磷酸含量为0.05-1.5％，柱温：25-50℃，检测波长为240-270nm检测器为紫外检测器测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的鞣花酸；
步骤7，比较未水解样品溶液和水解样品溶液与对照品溶液的色谱图判断丹参多酚酸溶液中是否存在鞣质类成分。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中
步骤1对照品溶液的制备，方法如下：
分别精密称取没食子酸、儿茶素、鞣花酸对照品适量，分别加甲醇制成相应的对照品溶液，得没食子酸质量浓度为0.5451mg.mL-1、儿茶素质量浓度为0.5079mg.mL-1、鞣花酸质量浓度为0.5067mg.mL-1的对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中
步骤2未水解样品溶液的制备：
精密称定丹参多酚酸0.1g，溶于10ml60％的丙酮中，超声30min，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中
没食子酸液相色谱条件：色谱柱为C18；流动相为5：95的甲醇-0.05％磷酸水溶液等度洗脱，流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长271nm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中
鞣花酸液相色谱条件：谱柱为C18；流动相为18：82的乙腈-0.2％磷酸溶液，流速为1.0mL.min-1；柱温40℃；检测波长254nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中
步骤1,2,3得到的溶液分别进样，进样方法如下：
第一组：取没食子酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第二组：取儿茶素标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第三组：取水解后样品、水解后样品加儿茶素标准品5滴、水解后样品加儿茶素15滴分别进样检测；
第四组：取鞣花酸标准品、水解前样品、水解后样品分别进样检测；
第五组：取水解后样品、水解后样品加鞣花酸标准品5滴、水解后样品加鞣花酸标准品15滴分别进样检测。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103376300A (zh) | 2013-10-30 |
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