CN110755476B - 一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法 - Google Patents

一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法，首先将新鲜紫苏叶经过常温阴干、粉碎过筛、溶剂浸泡、强化传质法进行提取，得到紫苏抗过敏粗成分，再运用薄层色谱法确定洗脱溶剂，硅胶柱层析法和葡聚糖凝胶柱层析法对紫苏抗过敏粗提物成分进行纯化，即可得到具有透明质酸酶抑制率高达89.76％的高抗过敏活性紫苏提取物。本发明提供的分离纯化方法，具有操作简单，用时少，得率高，活性显著，结果重现性好等优点，适合大多数植物活性物质的分离与纯化。

Description

一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及植物提取物生产技术领域，具体涉及一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法。
背景技术
过敏症属于多发性常见病。虽然过敏反应性疾病不像癌症和心血管疾病那样对人类健康造成最直接的威胁，但它会给人类带来长期的困扰，引起多种并发症，甚至可能危及生命。而化学合成的抗过敏药物多数存在潜在的毒性，有很大的安全隐患，因此寻求一种天然低毒抗过敏药物成为食品药品安全领域研究的研究热点。
紫苏提取物具有抗过敏、抗氧化、降血脂血压、保护肝脏、抑制血小板凝集、减少血栓形成、抗炎和保护视力等功效，具有很高的研究价值。透明质酸酶(HAase)是透明质酸(HA)的特异性裂解酶，HA在愈合创伤、细胞粘附、器官形成、肿瘤发生和血管形成等人体发育和调控过程中起到了主要的抑制作用，抑制HAase的活性可以使HA不被分解，维持正常的生理功能。
提取方法在植物有效成分提取中意义重大，好的提取方法，不仅能操作简单省时，而且对目的产物的富集也有很大的作用，强化传质法是一种新型提取方法，最大的特点是应用范围广、同时其提取时间短，提取温度低，特别对热敏性有效成分的影响较小，对大多数天然植物的提取均可适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法，操作简单，用时少，得率高，活性显著，结果重现性好，能得到具有高抗过敏活性物质，且此方法可适用于大部分天然植物组分的提取，为植物提取物的分离、纯化、富集等环节提供参考。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法，包括如下步骤：
S1、精选新鲜紫苏叶，洗净，常温阴干，粉碎过100目筛；
S2、以步骤S1得到的紫苏粉末为材料，按料液比为1kg：10-30L的比例添加适量70％的乙醇溶液，润料2h；
S3、将润料完成的原料置于高速分散器上，仪器条件设置为11000r/min，分散时间1min，分散处理3-7次，将上层溶液倒出，收集；
S4、将残渣按料液比为1kg∶10-30L的比例与适量70％乙醇溶液混合，进行高速分散操作，收集上层溶液；
S5、合并步骤S3和步骤S4所得的上层溶液并抽滤，将得到的澄清溶液50℃烘干，得到紫苏抗过敏成分粗提物；
S6、将所得的紫苏抗过敏成分粗提物利用薄层色谱进行点板，用不同梯度的石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇和纯乙醇进行展开，在显色剂中染色后根据斑点的高度确定洗脱溶剂梯度；
S7、将步骤S5得到的粗提物与硅胶按质量比1∶1的比例混合均匀，湿法装柱，将样品环绕倒入层析柱中，洗耳球敲匀柱面；
S8、依次用石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇和纯乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个洗脱梯度收集五个柱体积，利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，获得P1～P12共12个组分，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；
S9、取步骤S8所得浸膏，利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，筛选透明质酸酶抑制率最高的浸膏；
S10、取步骤S9筛选所得的浸膏，用少量乙醇溶解，将溶液全部转移到SephadexLH-20凝胶柱，用纯乙醇溶剂进行洗脱，收集洗脱液；
S11、将洗脱液利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，得到的6个组分K1～K6，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；
S12、取步骤S11所得浸膏，利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，得到透明质酸酶抑制率高达89.76％的K3组分，其抗过敏活性最强。
进一步地，步骤S3和步骤S4中，强化传质温度为25-45℃。
进一步地，步骤S3和步骤S4中，提取时间为3-7min。
进一步地，步骤S6中确定的梯度设置为：石油醚-乙酸乙酯，5∶1、2∶1、1∶1，乙酸乙酯-乙醇，100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1和纯乙醇。
进一步地，步骤S7中的硅胶粒径为200-300目。
本发明具有以下有益效果：
采用了强化传质法作为提取方法，应用范围广、同时其提取时间短，提取温度低，对热敏性有效成分的影响较小。
采用硅胶柱初步纯化，葡聚糖凝胶进一步纯化的方式，能使有效成分的富集更加充分，提高得率。
利用透明质酸酶体外抑制实验检测抗过敏活性，在抗过敏活性物质高富集的情况下，操作简单，结果重现性好。
本方法简单可行，适合大部分植物提取的分离与纯化。
附图说明
图1为强化传质温度对紫苏粗提物透明质酸酶抑制率的影响；
图2为强化传质时间对紫苏粗提物透明质酸酶抑制率的影响；
图3为葡聚糖凝胶纯化后提取物对透明质酸酶抑制率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
称取10.0g紫苏叶粉末于塑料烧杯中，根据1∶15(kg/L)的料液比，向其中加入150mL的体积浓度为70％的乙醇，搅拌均匀后，将烧杯置于高速分散器上，仪器转速设置为11000r/min，温度为30℃，分散1min，分散5次，将上层溶液倒出，收集，再在烧杯中加入150mL70％的乙醇，重复上述分散过程，合并所得的上层溶液并进行抽滤，将得到的澄清溶液50℃烘干，得粗提物；
将粗提物与硅胶(200～300目)按质量比为1∶1的比例混合，置于研钵中，研磨均匀，得样品，备用；称适量硅胶加入石油醚拌匀，备用；取一根层析柱底部塞少量棉花，将混有石油醚的硅胶慢慢装入层析柱中，同时用洗耳球轻轻敲打柱壁使硅胶填装平整、均匀，打开活塞流出多余的石油醚，将样品沿着层析柱环绕倒入，用洗耳球敲匀柱面，依次用石油醚-乙酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶1)，乙酸乙酯-乙醇(100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)和纯乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个洗脱梯度收集五个柱体积，利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，获得P1～P12共12个组分，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，筛选透明质酸酶抑制率最高的浸膏；取筛选所得的浸膏，用少量乙醇溶解，将溶液全部转移到Sephadex LH-20凝胶柱，用纯乙醇溶剂进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，得到的6个组分K1～K6，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏，分别测试透明质酸酶抑制率，得到最高抑制率为84.26％的组分，浸膏得率为15.23％。
实施例2
称取10.0g紫苏叶粉末于塑料烧杯中，根据1∶20(kg/L)的料液比，向其中加入150mL的体积浓度为70％的乙醇，搅拌均匀，将烧杯放到高速分散器上，仪器转速设置为11000r/min，温度为35℃，分散处理1min，分散6次，将上层溶液倒出，收集，再在烧杯中加入150mL70％的乙醇，重复上述分散过程，合并上层溶液并进行抽滤，将得到的澄清溶液50℃烘干，得粗提物；
将粗提物与硅胶(200～300目)按质量比为1∶1的比例混合，置于研钵中，研磨均匀，得样品，备用；称适量硅胶加入石油醚拌匀，备用；取一根层析柱底部塞少量棉花，将混有石油醚的硅胶慢慢装入层析柱中，同时用洗耳球轻轻敲打柱壁使硅胶填装平整、均匀，打开活塞流出多余的石油醚，将样品沿着层析柱环绕倒入，用洗耳球敲匀柱面。依次用石油醚-乙酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶1)，乙酸乙酯-乙醇(100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)和纯乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个洗脱梯度收集五个柱体积，利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，获得P1～P12共12个组分，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，筛选透明质酸酶抑制率最高的浸膏；取筛选所得的浸膏，用少量乙醇溶解，将溶液全部转移到Sephadex LH-20凝胶柱，用纯乙醇溶剂进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，得到的6个组分K1～K6，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏，分别测试透明质酸酶抑制率，得到最高抑制率为89.76％的组分，浸膏得率为17.23％。
实施例3
称取10.0g紫苏叶粉末于塑料烧杯中，根据1∶25(kg/L)的料液比，向其中加入150mL的体积浓度为70％的乙醇，搅拌均匀，将烧杯放到高速分散器上，仪器转速设置为11000r/min，温度为40℃，分散1min，分散7次，将上层溶液倒出，收集，再在烧杯中加入150mL70％的乙醇，重复上述分散过程，合并上层溶液并进行抽滤，将得到的澄清溶液50℃烘干，得粗提物；
将粗提物与硅胶(200～300目)按质量比为1∶1的比例混合，置于研钵中，研磨均匀，备用；称适量硅胶加入石油醚拌匀，备用；取一根层析柱底部塞少量棉花，将混有石油醚的硅胶慢慢装入层析柱中，同时用洗耳球轻轻敲打柱壁使硅胶填装平整、均匀，打开活塞流出多余的石油醚，将样品沿着层析柱环绕倒入，用洗耳球敲匀柱面；依次用石油醚-乙酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶1)，乙酸乙酯-乙醇(100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)和纯乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个洗脱梯度收集五个柱体积，利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，获得P1～P12共12个组分，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，筛选透明质酸酶抑制率最高的浸膏；取筛选所得的浸膏，用少量乙醇溶解，将溶液全部转移到Sephadex LH-20凝胶柱，用纯乙醇溶剂进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，得到的6个组分K1～K6，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏，分别测试透明质酸酶抑制率，得到最高抑制率为86.25％的组分，浸膏得率为15.67％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (4)

1.一种紫苏叶提取物在制备抗过敏药物中的应用，其特征在于，所述紫苏叶提取物是通过如下分离纯化方法制备得到的K3组分：
S1、精选新鲜紫苏叶，洗净，常温阴干，粉碎过100目筛；
S2、以步骤S1得到的紫苏粉末为材料，按料液比为1kg∶10-30L的比例添加70％的乙醇溶液，润料2h；
S3、将润料完成的原料置于高速分散器上，仪器转速设置为11000r/min，分散温度为25-45℃，分散时间1min，分散处理3-7次，将上层溶液倒出，收集；
S4、将残渣按料液比为1kg∶10-30L的比例与70％乙醇溶液混合，进行高速分散操作，收集上层溶液；
S5、合并步骤S3和步骤S4所得的上层溶液并抽滤，将得到的澄清溶液50℃烘干，得到紫苏抗过敏成分粗提物；
S6、将所得的紫苏抗过敏成分粗提物利用薄层色谱进行点板，用不同梯度的石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇和纯乙醇进行展开，在显色剂中染色后根据斑点的高度确定洗脱溶剂梯度，确定的洗脱溶剂梯度为：石油醚-乙酸乙酯，5∶1、2∶1、1∶1，乙酸乙酯-乙醇，100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1和纯乙醇；
S7、将步骤S5得到的粗提物与硅胶按质量比1∶1的比例混合均匀，湿法装柱，将样品环绕倒入层析柱中，洗耳球敲匀柱面；
S8、依次用石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇和纯乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个洗脱梯度收集五个柱体积，利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，获得P1～P12共12个组分，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；
S9、取步骤S8所得浸膏，利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，筛选透明质酸酶抑制率最高的浸膏；
S10、取步骤S9筛选所得的浸膏，用少量乙醇溶解，将溶液全部转移到Sephadex LH-20凝胶柱，用纯乙醇溶剂进行洗脱，每10mL一管收集洗脱液；
S11、将洗脱液利用薄层色谱技术进行检测，合并相似组分，得到的6个组分K1～K6，分别用旋转蒸发仪浓缩至浸膏；
S12、取步骤S11所得浸膏，利用透明质酸酶体外抑制实验进行活性检测，计算抗过敏能力，得到透明质酸酶抑制率高达89.76％的K3组分。
2.根据权利要求1所述的一种紫苏叶提取物在制备抗过敏药物中的应用，其特征在于：步骤S4中，分散温度为25-45℃。
3.根据权利要求1所述的一种紫苏叶提取物在制备抗过敏药物中的应用，其特征在于：步骤S4中，分散时间1min，分散处理3-7次。
4.根据权利要求1所述的一种紫苏叶提取物在制备抗过敏药物中的应用，其特征在于：步骤S7中的硅胶粒径为200-300目。
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