CH695663A5 - Composizioni farmaceutiche a base di erbe per trattare disordini immunologici. - Google Patents

Description

  [0001] La presente invenzione si riferisce a composizioni farmaceutiche, al loro utilizzo per trattare pazienti con disordini immunologici, e ai procedimenti per produrre le composizioni farmaceutiche. In particolare, le composizioni farmaceutiche contengono erbe che sono (1) ophiopogon (Tuber Ophiopogonis), (2) pinellia (Tuber Pinelliae), (3) liquirizia grezza (Radix Glycyrrhizae), e (4) una delle seguenti erbe: tridax lanterna (Herba Tridacis procumbentis), adenostema di Taiwan (Herba Adenostemmatis) e houttuynia con foglia a cuore (Herba houttuyniae). Eventualmente si può aggiungere una quinta erba che è tangshen (Radix Codonopsitis) o ginseng americano (Radix Panacis Quinquefolii).

   Le composizioni farmaceutiche a base di erbe sono utilizzate per il trattamento efficace di malattie mediate da immunoglobulina E (IgE), che includono, ma non sono limitate a, rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica, eczema atopico, dermatite atopica, allergia alimentare, sindrome da iper IgE e artrite reumatoide.

Antecedenti dell'invenzione

[0002] Disordini immunologici indotti da antigeni, in particolare indotti da allergeni, interessano più del 20% della popolazione mondiale e causano seri problemi di salute. Un esempio di tali disordini immunologici è l'asma.

   In anni recenti, l'insorgenza di disordini immunologici correlati ad allergie si è spostato verso la popolazione più giovane e sempre più bambini ed adolescenti hanno sviluppato sintomi di disordini immunologici indotti da allergeni.

[0003] Ad esempio a Taiwan la diffusione dell'asma infantile si è accresciuta dall'1,3% nel 1974 al 5,07 nel 1985, al 5,8% nel 1991. Anche l'incidenza della rinite allergica si è accresciuta dal 7,84% nel 1985 al 20,67% nel 1991. Ulteriormente l'incidenza dell'eczema atopico era dell'1,34% nel 1974 che si è accresciuto all 1,23% nel 1985 e al 3,84 nel 1991. Il precoce insorgere di disordini immunologici correlati ad allergeni può essere attribuito all'inquinamento ambientale.

[0004] Le allergie respiratorie sono risposte immunitarie mediate da IgE. Brinker, J. Naturopathic Medicine, 4:64-68 (1993).

   Ci sono due reazioni allergiche respiratorie principali: rinite allergica e asma bronchiale allergica. La rinite allergica, nota anche come febbre da fieno, è portata dal legarsi di antigene/lgE a cellule basofile e cellule mastoidee sensibilizzate. Il legame causa un decremento in cAMP, che a sua volta porta al rilascio di fattore chemotattico eosinofilo ed istamina. L'istamina poi si lega ai recettori H1 e causa l'aumento della vasodilatazione, permeabilità capillare e contrazione della muscolatura liscia, come evidenziato da congestione nasale con scarica acquosa, starnuti ed occhi che prudono.

[0005] L'asma allergica è un'altra risposta immunitaria mediata da IgE in cui le cellule mastoidee rilasciano istamina, bradichinina e mataboliti dell'acido arachidonico includendo sostanze di anafilassi a lenta reazione con leucotriene e broncocostrittori tromboxano/prostaglandina.

   Il fattore di attivazione delle piastrine è un altro potente mediatore dell'asma rilasciato da una quantità di leucociti. In questa condizione, l'istamina che è rilasciata dopo un decremento in cAMP, agisce su recettori H1, cos Å da causare un broncospasmo; l'istamina è anche responsabile per la broncocostrizione dovuta all'azione di riflesso colinergico e di metà della generazione di prostaglandina nell'anafilassi.

[0006] Mentre la percentuale della popolazione interessata e la gravità delle malattie sono in crescita, le metodologie di trattamento della reazione allergica sono ancora dipendenti in primo luogo da ritrovati empirici e occasionali piuttosto che da un approccio scientifico. La maggior parte dei pazienti che soffrono di allergie sono trattati con farmaci che mirano a controllare sintomi che risultano dal rilascio di mediatori da parte di cellule effettrici.

   Sembra che alcuni farmaci siano efficaci nell'alleviare a breve termine i sintomi senza effetti sfavorevoli, tuttavia non sono stati trovati farmaci che abbiano effetti a lungo termine per prevenire il progresso della malattia e la distruzione permanente senza alcun effetto avverso. Ad esempio la terapia orale a lungo termine per il trattamento dell'asma, quale la terapia con steroidi, è ora nota per essere associata con effetti debilitanti multipli quali ritardo della crescita, osteoporosi e soppressione surrenale.

[0007] Le tradizionali combinazioni medicinali ed erbe cinesi forniscono un'alternativa per il trattamento di malattie immunologiche. Le tradizionali erbe e combinazioni a base di erbe cinesi sono state conosciute per migliorare la funzionalità del sistema immunitario e trattare vari disordini immunologici croniche. Ad esempio Hamasaki et al., J.

   Ethnopharmacology, (1997) 56:123-131, descrive una medicina cinese a base di un'erba, Shinpi-To, che inibisce la sintesi di leucotriene mediata da IgE in cellule di leucemia 2H3 basofile di topo. Lo Shinpi-To è una medicina cinese a base di erbe, granulare, liofilizzata, preparata da estratti di sette erbe medicinali che includono Ephedrae herba (Ephedra sinica Stapf), Armeniacae semen (Prunus armeniaca Linne), Magnoliae cortex (Magnolia obovata Thunber), Aurantii nobilis Pericarpium (Citrus unshiu Markovich), Glycyrrhizae radix (Glycyrrhiza uvalensis Fischer), Bupleuri radix (Bupleurum falcatum L.) e Perillae herba (Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo). Lo Shinphi-To è utile per trattare l'asma infantile.

[0008] Toda et al., J.

   Ethnopharmacology, (1988) 24:303-309, descrive una medicina cinese a base di erbe, Saiboku-To, che mostra effetti inibitori sul rilascio di istamina da cellule mastoidee peritoneali di topo. Il Saiboku-To è utile per trattare l'asma. Il Saiboku-To contiene dieci erbe medicinali che includono Bupleurum falcatum L., Pinelliae ternata Breitenbach, Porla cocos Wolf., Scutellaria baicalensis Georgi, Zizyphus vulgaris Lam., Panax ginseng C.A. Meyer, Magnolia oborata Thumberg, Glycyrrhiza glabra L., Perillae frutescens Britton var. Acuta Kudo, e Zingiber officinale Roscoe.

[0009] Li et al., Immunopharmacology, (1999), 43:11-21, descrive una medicina cinese a base di erbe, Hochu-Ekki-To, che mostra effetti per recuperare l'immunosoppressione indotta da stress.

   L'Hochu-Ekki-To consiste di dieci ingredienti che includono Ginseng Rx., Atractylodis alba Rz., Astragali Rx., Angelicae sinensis Rx., Jujubae Fr., Citri reticulatae Pc. Bupleuri Rx., Glycyrrhizae Rx. Preparata, Zingiberis recens Rz., e Cimicifugae Rz.

[0010] Zou at al., Chinese Traditional and Western Medical Magazine, 529-532 (1996) descrive una medicina cinese a base di erbe, la miscela Wenyang Tongluo, per trattare pazienti con asma del tipo raffreddore. Essa mostra gli effetti di migliorare le funzioni di ventilazione polmonare, regolare i recettori beta  adrenergici di linfociti di sangue periferico, e decrescere il livello nel siero di 5-idrossitriptamina.

   La miscela Wenyang Tongluo consiste di dodici erbe medicinali che includono Red Ginseng, Zhi Fu Pian, Yin Yang Huo, Dried Ginger (Zingiberis recens Rz.), Zhi Huang Zhi, Angelicae sinesis Rx., Ephedra, Polygalae Rx., Sang Baipi, Sheng Shi Gao, Schisandrae Fr., e Licorice (Glycyrrhizae Rx. Preparata).

[0011] È stato descritto su internet (www.herb.com.tw) un decotto per trattare la bronchite e l'asma bronchiale. Il decotto è fatto di una combinazione di sei erbe che includono Ophiopogonis Rx., Pinelliae Rz. Preparata, Oryzae Sm., Jujubae Fr., Ginseng Rx., e Clycyrrhizae Rx.

[0012] Il controllo di qualità della medicina cinese a base di erbe è critico nello sviluppare una composizione farmaceutica dalle erbe.

   I contenuti e gli ingredienti attivi delle erbe possono fluttuare con fattori quali la condizione di crescita e la località di crescita, la stagione e la tecnica di raccolta, e la produzione ed il trattamento delle erbe raccolte. Se uno qualsiasi dei fattori critici non è soddisfatto, l'efficacia della medicina a base di erbe può essere compromessa. Tuttavia non è stato riportato o adottato alcun procedimento scientifico per il monitoraggio affidabile della qualità di medicine cinesi a base di erbe.

[0013] La presente invenzione fornisce composizioni farmaceutiche nuove e non tossiche derivate da erbe che si trovano principalmente in Cina e a Taiwan. L'utilizzo combinato di queste erbe non è mai stato trovato in alcuna fonte di letteratura o rassegna.

   Queste composizioni farmaceutiche sono efficaci nel trattare pazienti con disordini immunologici, specialmente disordini mediati da IgE. Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione hanno mostrato particolari effetti nel regolare verso il basso la sintesi di interleuchina 4 (IL-4) e sopprimere IgE.

   Inoltre, per controllare efficacemente la qualità delle erbe, la presente invenzione individua ciascuna erba utilizzando cromatografia a strato sottile (TLC) e cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) cos Å da assicurare che ciascuna erba utilizzata nella composizione contenga ingredienti consistenti e riproducibili.

Compendio dell'invenzione

[0014] La presente invenzione fornisce composizioni farmaceutiche che contengono, quali erbe essenziali, ophiopogon (Tuber Ophiopogonis), pinellia (Tuber Pinelliae), liquirizia grezza (Radix Glycyrrhizae), ed un'erba scelta dal gruppo consistente di tridax Lanterna (Herba Tridacis procumbentis), adenostema di Taiwan (Herba Adenostemmatis), e houttuynia con foglia a cuore (Herba Houttuyniae).

   Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione contengono ulteriormente un'erba che è o tang-shen (Radix Codonopsitis) o ginseng americano (Radix Panacis Quinquefolii). Il rapporto in peso favorito fra le erbe ophiopogon: pinellia: liquirizia grezza: gingseng americano / tang-shen: tridax lanterna / adenostema di Taiwan / houttuynia con forma a cuore è 3:2:1:1:1.

[0015] La composizione farmaceutica più preferita contiene ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza, ginseng americano e tridax lanterna. Gli ingredienti efficaci di queste erbe possono essere o estratti da acqua o solvente organico, oppure in forma polverulenta che è ottenuta dalla macinazione diretta delle erbe.

[0016] In una forma di attuazione, la composizione farmaceutica contiene ophiopogon sotto forma di estratto acquoso ed il resto delle erbe in forma di polvere.

   L'estratto acquoso di ophiopogon è preferibilmente preparato mediante estrazione in acqua.

[0017] In un'altra forma di attuazione, la composizione farmaceutica contiene estratti acquosi di ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano preferibilmente mediante estrazione in acqua; ed un estratto acquoso di tridax lanterna, preferibilmente estratto in alcol (più preferibilmente in alcol al 50%).

[0018] La presente invenzione fornisce anche procedimenti per preparare le composizioni farmaceutiche in cui sono preparati estratto acquoso e/o polveri delle erbe. In una forma di attuazione, ad eccezione dell'ophiopogon, tutte le altre erbe sono tagliate a pezzi, disidratate, macinate, e passate attraverso un vaglio cos Å da produrre polvere di erbe. Gli ingredienti dell'ophiopogon sono estratti facendo bollire e condensando ophiopogon in acqua.

   L'estratto di ophiopogon (filtrato) è poi ottenuto facendo passare la miscela acqua-ophiopogon condensato attraverso un vaglio. Successivamente il filtrato di ophiopogon è miscelato con la polvere di erbe cos Å da formare una miscela di erbe. Questa miscela di erbe è poi collocata in una macchina di granulazione fluidizzata per la produzione di granuli. I granuli possono essere opzionalmente vagliati cos Å da produrre granuli con dimensioni uniformi. I granuli possono essere ulteriormente incapsulati.

[0019] In ancora un'altra forma di attuazione, la composizione farmaceutica è preparata come segue:
(a) ciascuno degli estratti acquosi di ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza, ginseng americano e tridax lanterna è preferibilmente separatamente filtrato e condensato.

   (b) Ad eccezione dell'ophiopogon che non è granulato, ciascuno dei condensati di pinellia, liquirizia grezza, ginseng americano e tridax lanterna è individualmente granulato dal condensato cos Å da formare granuli singoli. (c) Prima della granulazione, un eccipiente, preferibilmente amido di mais, è addizionato cos Å da conferire un'adatta forma ai granuli. (d) I singoli granuli e il condensato di ophiopogon sono poi miscelati insieme cos Å da formare granuli misti che sono poi incapsulati.

[0020] Preferibilmente il tenore di solidi del condensato di ophiopogon costituisce circa il 20-30% in peso, preferibilmente circa il 25% in peso, del materiale grezzo di ophiopogon. Il tenore di solidi del condensato è il condensato ad esclusione dell'acqua.

   Nel caso dell'ophiopogon, il condensato contiene un sostanziale quantitativo di acqua (vale a dire circa il 58% del condensato di ophipogon e acqua). Il tenore di solidi del resto delle erbe è circa lo stesso del condensato (cioè il tenore di acqua era insignificante). Il condensato di pinellia costituisce circa il 15-25% in peso, preferibilmente circa il 20% in peso, del materiale grezzo di pinellia. Il condensato di liquirizia grezza costituisce circa il 15-25% in peso, preferibilmente circa il 20% in peso, del materiale grezzo di liquirizia grezza. Il condensato di ginseng americano costituisce circa il 19-29% in peso, preferibilmente circa il 24,3% in peso, del materiale grezzo di ginseng americano.

   Il condensato di tridax lanterna costituisce circa il 5-10% in peso, preferibilmente circa il 7,8% in peso, del materiale grezzo di tridax lanterna.

[0021] I granuli di pinellia costituiscono circa il 20-30% in peso, preferibilmente circa il 25% in peso, del materiale grezzo di pinellia. I granuli di liquirizia grezza costituiscono circa il 16-26% in peso, preferibilmente circa il 21% in peso, del materiale di liquirizia grezza. I granuli di ginseng americano costituiscono circa il 27-37% in peso, preferibilmente circa il 32% in peso, del materiale grezzo di ginseng americano. I granuli di tridax lanterna costituiscono circa il 37-47% in peso, preferibilmente il 42% in peso, del materiale grezzo di tridax lanterna.

[0022] Inoltre il procedimento richiede che l'estrazione di ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza, ginseng americano e tridax lanterna sia condotta singolarmente.

   Inoltre ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano sono estratti in acqua facendo un decotto. Il tridax lanterna è estratto in alcol, preferibilmente alcol al 50%, mediante riflusso. Dopo l'estrazione, ciascun singolo estratto è filtrato cos Å da rimuovere l'erba restante. Il filtrato è poi condensato mediante condensazione in decompressione ad una temperatura di circa 55 deg. C ed un vuoto di circa 30 torr (4000 Pa) da formare un condensato. Un adeguato quantitativo di un eccipiente, preferibilmente amido di mais, è addizionato a ciascuno dei condensati, eccetto ophiopogon, cos Å da formare una pasta di estrazione che è soggetta a granulazione mediante essiccamento a spruzzo ad una temperatura d'ingresso di circa 105 deg. C ed una temperatura d'uscita di circa 76-77 deg. C.

   I rispettivi granuli di pinellia, liquirizia grezza, ginseng americano e tridax lanterna sono miscelati con il condensato di ophiopogon cos Å da formare i granuli misti che possono poi essere incapsulati.

[0023] Inoltre il rapporto fra l'estraente acquoso in volume e l'erba in peso è circa 20:1. Per l'estrazione con acqua, il tempo preferito di decottura è di circa 30 minuti, il tempo preferito di estrazione con alcol è anche di circa 30 minuti.

[0024] Le due composizioni farmaceutiche della presente invenzione, l'una contenente un estratto acquoso di ophiopogon e polveri delle altre erbe e l'altra contenente estratti acquosi di tutte le erbe, sono entrambi efficaci nel trattare disordini immunologici.

   Tuttavia, la composizione farmaceutica contenente estratti acquosi di tutte le erbe è leggermente favorita poiché dimostra migliore efficienza ed efficacia farmaceutica di quella contenente estratto acquoso di ophiopogon e polveri delle altre erbe. La differenza negli effetti di trattamento di questi due procedimenti può essere dovuta all'efficacia di accrescimento nel rilascio di ingredienti attivi durante l'estrazione.

[0025] Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione sono efficaci nel trattare pazienti con disordini immunologici, in particolare malattie mediate da IgE, che includono, ma non sono limitati a, rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergico, dermatite atopica, allergia da cibo, sindrome da iper IgE, eczema atopico e artrite reumatodie.

Breve descrizione dei disegni

[0026] 
<tb>La fig. 1<sep>illustra un cromatogramma HPLC di ophiopogon.

   Il suo intero profilo cromatografico è stato rilevato ad una lunghezza d'onda di 214 nm utilizzando il procedimento 1 dell'analisi HPLC (vedi sotto). Vi erano due picchi discreti, 6115-1 e 6115-2, che avevano un tempo di ritenzione di rispettivamente 11,5 minuti e 13 minuti, illustrati nel cromatogramma. Questi due picchi potevano essere utilizzati per identificare l'ophiopogon.


  <tb>La fig. 2<sep>illustra un cromatogramma HPLC di pinellia. Sono stati rivelati due marcatori chimici, adenina e guanosina, ad una lunghezza d'onda di 260 nm utilizzando il procedimento 2 dell'analisi HPLC. L'adenina ha un tempo di ritenzione di 14,8 minuti, la guanosina ha un tempo di ritenzione di 17 minuti.


  <tb>La fig. 3<sep> illustra un cromatogramma HPLC di liquirizia grezza. È stato rivelato un marcatore chimico, glicirrizina (Gly), ad una lunghezza d'onda di 250 nm utilizzando il procedimento 1 dell'analisi HPLC. Gly ha un tempo di ritenzione di 46,4 minuti.


  <tb>La fig. 4<sep>illustra un cromatogramma HPLC di ginseng americano. È stato rivelato un marcatore chimico, ginsenoside Rb1 (Rb1), ad una lunghezza d'onda di 203 nm utilizzando il procedimento 3 dell'analisi HPLC. Rb1 ha un tempo di ritenzione di 45 minuti.


  <tb>La fig. 5<sep>illustra un cromatogramma HPLC di tridex lanterna. Sono stati rilevati quattro (4) picchi distintivi, da FY-1 a FY-4, ad una lunghezza d'onda di 250,0 nm utilizzando il procedimento 2 dell'analisi HPLC. FY-1 ha un tempo di ritenzione di 28 minuti. FY-2 ha un tempo di ritenzione di 31,6 minuti. FY-3 ha un tempo di ritenzione di 33,5 minuti. FY-4 ha un tempo di ritenzione di 18,3 minuti.


  <tb>La fig. 6<sep>illustra i livelli di anticorpi IgG e IgE specifici verso Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergene 5) dopo attacco di inalazione di Der p 5 seguito da trattamento dei gruppi di decotto 5(A-F). I livelli nel siero di IgG e IgE sono stati misurati mediante ELISA. I valori sono medie +- SEM con una barra che indica la SEM. A: gruppo polvere drenante bianca; B: gruppo decotto del drago verde-blu; C: gruppo decotto di ophiopogon; D: gruppo decotto per eliminare la secchezza e liberare i polmoni; E: gruppo decotto di frutto di perilla per abbassare il Qi; e F: gruppo placebo.


  <tb>La fig. 7<sep> illustra l'espressione del gene IL-4 in splenociti dopo attacco di inalazione di Der p 5 seguito da trattamento dei gruppi di decotto 5 (A-F). L'espressione del gene IL-4 è stata determinata mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi con transcrittasi inversa). I valori sono medie +- SEM con una barra che indica la SEM: A: gruppo polvere drenante bianca; B: gruppo decotto del drago verde-blu; C: gruppo decotto di ophiopogon; D: gruppo decotto per eliminare la secchezza e liberare i polmoni; E: gruppo decotto di frutto di perilla per abbassare il Qi; e F: gruppo placebo. * indica p<0,05.


  <tb>La fig. 8<sep>illustra i livelli di IgG nel siero di topo dopo attacco mediante allergene Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergene 5) e trattamento con singola erba. Il percorso 1 mostra l'effetto del trattamento con ophiopogon. Il percorso 2 mostra l'effetto del trattamento con tang-shen. Il percorso 3 mostra l'effetto del trattamento con pinellia. Il percorso 4 mostra l'effetto del trattamento con liquirizia grezza. Il percorso 5 è il trattamento con placebo. I livelli di IgG nel sangue sono stati misurati mediante ELISA. I valori sono medie +- SEM con una barra che indica la SEM.


  <tb>La fig. 9<sep>illustra i livelli di IgE nel siero di topo dopo attacco con Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergene 5) e trattamento con una singola erba o la composizione farmaceutica (cioè STA-36, vedi sotto). Il percorso 1 mostra l'effetto del trattamento con ophiopogon. Il percorso 2 mostra l'effetto del trattamento con tang-shen. Il percorso 3 mostra l'effetto del trattamento con pinellia. Il percorso 4 mostra l'effetto del trattamento con liquirizia grezza. Il percorso 5 mostra l'effetto del trattamento con STA-36. Il percorso 6 è il trattamento con placebo. I livelli di IgG nel siero sono stati misurati mediante ELISA. I valori sono medie +- SEM con una barra che indica la SEM.


  <tb>La fig. 10<sep>illustra l'espressione del gene IL-4 in splenociti di topo dopo attacco con Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergene 5) e trattamento con una singola erba o la composizione farmaceutica (cioè STA-36, vedi sotto). L'espressione del gene IL-4 è stata determinata mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi con transcrittasi inversa). Il percorso 1 mostra l'effetto del trattamento con ophiopogon. Il percorso 2 mostra l'effetto del trattamento con tangshen. Il percorso 3 mostra l'effetto del trattamento con pinellia. Il percorso 4 mostra l'effetto del trattamento con liquirizia grezza. Il percorso 5 mostra l'effetto del trattamento con STA-36. Il percorso 6 è il trattamento con placebo.


  <tb>La fig. 11<sep>confronta gli effetti del ginseng americano nella forma di (1) polvere, (2) estratto acquoso in alcol al 95%, (3) estratto acquoso in acqua e (4) estratto acquoso in alcol al 50%, sui livelli di IgG2a e IgE. I valori sono medie +- SEM. La figura indica che il ginseng americano estratto mediante alcol al 50% produceva effetti lievemente migliori in termini di decremento di IgE e accrescimento di IgG rispetto all'estratto acquoso.


  <tb>La fig. 12<sep>confronta gli effetti del tridax lanterna nella forma di (1) polvere, (2) estratto acquoso in alcol al 95%, (3) estratto acquoso in acqua e (4) estratto acquoso in alcol al 50%, sui livelli di IgE, IgG2a, IL-4 e IFN-gamma . I valori sono medie +- SEM. * indica una significativa differenza dal confronto. I risultati indicano che l'estratto in etanolo al 50% di tridax lanterna era più efficace per quanto concerne l'inibizione di IgE e l'accrescimento di IgG.


  <tb>La fig. 13<sep>è uno studio comparativo degli effetti di STA-36, STA-4 ed un confronto (il gruppo placebo) su IgG e IgE nel siero di topi femmina BALB/c. * indica una significativa differenza (p<0,05) fra STA-4 ed il confronto. I valori sono medie +- SEM. Il quantitativo di dosaggio di STA-36 (20 mg / 20 g di topo) era due volte il quantitativo di dosaggio (10 mg / 20 g di topo) di STA-4 (cioè STA-36:STA-4=2:1). I risultati mostrano che in termini di IgE, sebbene sia STA-36 sia STA-4 mostrano inibizione di IgE, solo STA-4 è di significato statistico rispetto al confronto. Per quanto concerne IgG, sia STA-36 sia STA-4 mostrano un incremento in IgG. Tuttavia, sebbene appaia che STA-36 mostri un maggiore incremento nel livello di IgG di STA-4, nessun incremento è significativamente differente dal confronto.


  <tb>La fig. 14<sep>è uno studio comparativo degli effetti di STA-36 e STA-4 sulle funzioni polmonari. I valori sono medie +- SEM. Sia STA-36 sia STA-4 mostrano un significativo miglioramento nelle funzioni polmonari (come determinate mediante misurazione di acetilcolina) in comparazione con il confronto (p<0,05). Fra i trattamenti con STA-36 e STA-4, sebbene appaia che STA-4 avesse un migliore effetto di STA-36, la differenza fra STA-36 e STA-4 era comunque non statisticamente significativa probabilmente a causa dell'insufficiente numero di animali utilizzati in ciascun gruppo. Il quantitativo di dosaggio di STA-36 (20 mg / 20 g di topo) era due volte il quantitativo di dosaggio (10 mg / 20 g di topo) di STA-4.


  <tb>La fig. 15<sep>confronta gli effetti dovuti a STA-4 su IgE, IgG, IL-4 e IFN-gamma  con quelli dei farmaci convenzionali (per il trattamento dell'asma) includendo chetotifen, prednisolone e aminofilina. I valori sono medie +- SEM. * indica una significativa differenza rispetto al confronto. I risultati di questo studio indicano che STA-4 abbassava significativamente il livello di IgE, ma accresceva significativamente il livello di IgG2a/ IL-4 e IFN-gamma .

Descrizione dettagliata dell'invenzione

[0027] L'asma mediata da allergeni o antigeni è una malattia respiratoria dovuta primariamente ad una reazione infiammatoria cronica. La reazione infiammatoria è mediata dal rilascio di fattori infiammatori dalle cellule quali fattore di attivazione delle piastrine, istamina, prostaglandina e leucotriene.

   La reazione infiammatoria stimola una risposta antigenica in linfociti T (cellule T), particolarmente cellule CD4+. Ci sono due tipi di cellule CD4+, cellule CD4+ Th1 e Th2. Il tipo Th1 delle cellule CD4 + secerne citochina (IFN-gamma ). Il tipo Th2 delle cellule CD4 + secerne interleuchina-4 (IL-4). La maggior parte dei pazienti con asma allergica sono del tipo Th2. L'allergene stimola la cellula Th2 a produrre IL-4 in eccesso, che a sua volta induce la produzione e la secrezione di IgE da linfociti B.

[0028] La presente invenzione fornisce sette composizioni farmaceutiche: STA-31, STA-32, STA-33, STA-34, STA-35, STA-36 e STA-4. Tutte le composizioni hanno effetti farmaceutici sui disordini immunologici, particolarmente sulla soppressione della produzione di IgE e la regolazione verso il basso della sintesi del gene dell'interleuchina 4 (IL-4).

   I contenuti di erbe delle composizioni farmaceutiche a base di erbe sono illustrati nella tabella 1.

[0029] 
<tb>Composizione a base di erbe<sep>Erba #1
(prep form)<sep>Erba #2
(prep form)<sep>Erba #3
(prep form)<sep>Erba #4
(prep form)<sep>Erba #5
(prep form)


  <tb>STA-31<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Tang-Shen
(polvere)<sep>Adenostema (polvere)


  <tb>STA-32<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Tang-Shen
(polvere)<sep>Houttuynia
(polvere)


  <tb>STA-33<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Tang-Shen
(polvere)<sep>Tridax
(polvere)


  <tb>STA-34<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Ginseng
(polvere)<sep>Adenostema (polvere)


  <tb>STA-35<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Ginseng
(polvere)<sep>Houttuynia
(polvere)


  <tb>STA-36<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia
(polvere)<sep>Liquirizia
grezza
(polvere)<sep>Ginseng
(polvere)<sep>Tridax
(polvere)


  <tb>STA-4<sep>Ophiopogon (estr.acq.)<sep>Pinellia (estr.acq.)<sep>Liquirizia
grezza
(estr.acq.)<sep>Ginseng (estr.acq.)<sep>Tridax
(estratto
alcolico 50%)estr. acq. = estratto acquoso mediante acqua; ophiopogon = Tuber ophiopogonis; Pinellia = Tuber Pinelliae; liquirizia grezza = Radix Glycyrrhizae, Tang-Shen = Radix Codonopsitis; Ginseng = Radix Panacis Quinquefolii; Adenostema = Herba Adenostemmatis; Houttuynia = Herba Houttuyniae; Tridax = Herba Tridacis procumbentis.

[0030] Fa le sette composizioni STA-36 è una composizione preferita e STA-4 è la composizione più preferita. STA-36 e STA-4 sono particolarmente efficaci nel trattare disordini immunologici includendo la soppressione della produzione di IgE.

[0031] Ciascuna delle composizioni farmaceutiche contiene cinque erbe, tre delle quali sono erbe essenziali.

   Le erbe essenziali sono ophiopogon (noto anche come porro nero), pinellia e liquirizia grezza. La quinta erba può essere o tang-shen o ginseng americano. La quinta erba è scelta dal gruppo consistente di adenostema di Taiwan, tridax lanterna e houttuynia con foglia a cuore. L'adenostema di Taiwan e l'houttuynia con foglia a cuore possono essere trovate solo in Taiwan secondo la letteratura disponibile relativa alle erbe. Il tridax lanterna può essere trovato in Taiwan ed in Sud America. I nomi farmaceutici, i nomi botanici, di famiglia e gli ingredienti più rilevanti delle composizioni sono riportati nella tabella 2.

[0032] Tabella 2 - Nomi farmaceutici / botanici e ingredienti principali delle erbe nella composizione farmaceutica STA
<tb>Erba<sep>Nome
Farmaceutico<sep>Nome
botanico/zoologico<sep>Famiglia<sep>Ingredienti principali


  <tb>Ophiopogon (porro nero)<sep>Tuber Ophiopogonis Japonici<sep>Ophiopogon Japonicus Ker-Gawl.<sep>Liliaceae<sep>Ophiopogonina, ruscogenina, (beta -sitosterolo, stigmasterolo


  <tb>Tang-Shen<sep>Radix Codonopsitis Pilosulae<sep>Codonopsis Pilosula (Franch. ) Nannf.<sep>Canpanulaceae<sep>saponine, alcaloidi, teraxerilacetato, fridelina, saccarosio, glucosio, inulina


  <tb>Ginseng
Americano<sep>Radix Panacis Quinquefolii<sep>Panax
Quinquefolium L.<sep>Araliaceae<sep>Saponine, panaquilone


  <tb>Pinellia<sep>Tuber Pinelliae, Rhizoma Pinellia Ternatae<sep>Pinellia Ternata (Thunb.)
Breitenbach<sep>Araceae<sep>Coniina, protoanemonia, acido amogentisico, nicotina, acido aspartico, acido glutammico,
arginina, beta -sitosterolo, colesterolo


  <tb>Liquirizia
Grezza<sep>Radix
Glycyrrhizae
Uralensis<sep>Glycyrrhizae
Uralensis
Fisher o Glycyrrhiza glabra Linné<sep>Leguminosae<sep>Acido carbossilico azetidina-2, aspartato, omoserina, acido diamminobutirrico, glucoside digital


  <tb>Tridax Lanterna<sep>Herba
Tridacis
procumbentis<sep>Tridax
Procumbens Linn.<sep>Compositae<sep>Polisaccaride


  <tb>Adenostema
di Taiwan<sep>Herba
Adenostammatis<sep>Adenostema
lavenia (L.) Ktze.<sep>Compositae<sep>


  <tb>Houttuynia con foglia a cuore<sep>Herba
Houttuyniae<sep>Houttuynia
Cordata Thunberg<sep>Saururaceae<sep>Decanoil acetaldeide, aldeide laurica, metil-n-nonilchetone, mircene, aldeide caprica, acido caprico, cordarina, calcio solfato, calcio cloruro, isoquercitrina, reinutrina, iperina

[0033] L'ophiopogon (Radix Ophiopogonis) appartiene alla famiglia delle liliacee. Il tubero (radice) di ophiopogon ha effetti medicinali. La migliore stagione di raccolta per l'ophiopogon è l'estate. Dopo la raccolta, il tubero dell'ophiopogon dovrebbe essere ripulito mediante lavaggio cos Å da essere liberato da radichette o sporcizia indesiderate, il che è seguito da essiccamento sotto il sole cos Å da preservarlo per l'uso successivo. Il tubero dell'ophiopogon è la parte ingrandita della radice. Si potrebbe trovare l'ophiopogon in province della Cina quali Zhejiang, Sichuan e Jiangsu.

   Da Yu et al. (1991), China Journal of Chinese Materia Medica, 16:584-585 è stato riportato che l'estratto acquoso di ophiopogon accresce la liberazione di particelle di carbone di legna intravenose in topi e funge da antagonista della leucopenia causata da clofosfammide. Per essere efficacemente utilizzato nella composizione a base di erbe, il tubero di ophiopogon può essere preparato mediante estratto acquoso con acqua o altri solventi organici. È preferito che la forma di preparazione del dosaggio per l'erba sia l'estrazione con acqua.

[0034] Il tang-shen (Radix Codonopsitis Pilosulae) appartiene alla famiglia delle Campanulaceae. Gli effetti medicinali del Tang-shen sono nella radice. Il tang-shen può essere o raccolto allo stato selvatico o coltivato. La stagione tipica di raccolto per il tang-shen è l'autunno.

   Dopo il raccolto, la radice del tang-shen è essiccata sotto il sole e tagliata in segmenti per l'uso successivo. Si può trovare il tang-shen nel Nantou Shien e Taichung Shien di Taiwan. Per essere efficacemente utilizzato nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata mediante estratto acquoso con acqua od altri solventi organici o in polvere derivata dalla macinazione dell'erba grezza. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è o l'estratto acquoso mediante estrazione con acqua o polvere macinata.

[0035] Il ginseng americano (Radix Panacis Quinquefolii) appartiene alla famiglia delle Araliaceae. Gli effetti medicinali del ginseng americano sono nella radice. Si può trovare il ginseng americano negli Stati Uniti settentrionali ed in Canada. Esso è stato anche ampiamente coltivato in Francia e nella Cina settentrionale.

   La migliore stagione di raccolta per il ginseng americano è l'autunno. Per essere efficacemente utilizzata nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata mediante estratto acquoso con acqua od altri solventi organici o sotto forma di polvere macinata. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è o l'estratto acquoso mediante estrazione con acqua o polvere macinata.

[0036] La Pinellia (Tuber Pinelliae, Rhizoma Pinellia Ternatae) appartiene alla famiglia delle Araceae. Il tubero (dopo che lo strato di sughero è stato rimosso) della pinellia ha effetti medicinali. La pianta cresce nelle province Sichuan, Hubei, Henan, Guizhou e Annui della Cina. La normale stagione di raccolta della pinellia è fra luglio e settembre. Si può trovare la pinellia in Taichung Shien a Taiwan.

   Per essere efficacemente utilizzata nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata mediante estrazione acquosa con acqua od altri solventi organici o sotto forma di polvere macinata. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è estratto acquoso mediante acqua o polvere macinata.

[0037] La liquirizia grezza (Radix Glycyrrhizae Uralensis) appartiene alla famiglia delle Leguminosae. La radice e lo stolone della liquirizia grezza, con il periderma (non pelata) o senza (pelata), hanno effetti medicinali. La liquirizia grezza contiene non meno del 2,5% dell'acido glicirrizico (C42H62O16) /, calcolato sulla base del materiale essiccato, che può essere utilizzato come marcatore chimico per la liquirizia grezza. Si può trovare liquirizia grezza nella Mongolia interna, nel Gansu, nel Xinjiang e nella Cina nord orientale.

   Le stagioni migliori di raccolta per la liquirizia grezza sono sia la primavera sia l'autunno. Si può trovare la liquirizia grezza a Taiwan nel Taichung Shien. La radice della liquirizia ha proprietà antinfiammatorie e può essere utilizzata da sola per alleviare sintomi di asma. Si veda H. W. Morningstar, Sentient Times: Alternative for Personal and Community Transformation (1998), 6:16-17. Le radici di liquirizia sono anche utili per trattare la bronchite. Si veda T. David, Miracle Medicine of the Rainforest: A Doctor's Revolutionary Work With Cancer and AIDS Patients (1997), pagine 66-79. Per essere efficacemente utilizzata nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata mediante estratto acquoso con acqua od altri solventi organici o in forma di polvere macinata.

   La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è o estratto acquoso con acqua o polvere macinata.

[0038] Il tridax lanterna (Erba Tridacis procumbentis) appartiene alla famiglia delle Compositae. Gli effetti medicinali del tridax lanterna derivano dalla pianta intera essiccata. Si può trovare il tridax lanterna nel Nantou Shien, Taichung Shien e Yunlin Shien e nella città di Taichung di Taiwan. È stato trovato tridax lanterna anche in Sud America. Diwan et al., Indian Journal of Physiology & Pharmacology (1983), 27:32-36 rivelano che il succo estratto dalle foglie di tridax lanterna ha effetti che assomigliano a quelli del dexametasone sul rimarginamento di ferite e granulazione, ma contrastano significativamente gli effetti del dexametasone sulla resistenza alla trazione e l'epitelializzazione.

   Gan et al., China Medical College Annual Bulletin (1977), 8:526, indicano che le foglie del tridax lanterna sono utili per diminuire l'infiammazione, alleviare i sintomi della febbre, e curare polmonite e tosse.

[0039] Per poter essere efficacemente utilizzata nella composizione a base di erbe, la tridax lanterna può essere preparata mediante estrazione acquosa mediante acqua o altri solventi organici o in una forma di polvere macinata. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è sia quella di polvere macinata, sia quella di estratto acquoso mediante alcol, e preferibilmente alcol al 50% per estrazione.

[0040] L'adenostema di Taiwan (Herba Adenostemmatis) appartiene alla famiglia delle Composite. L'adenostema di Taiwan usualmente cresce in prossimità di acqua o in terreni paludosi.

   Gli effetti medicinali dell'adenostema di Taiwan derivano dall'intera pianta, sia utilizzata fresca sia in forma essiccata. Le migliori stagioni di raccolto sono l'estate o l'inizio dell'autunno. L'adenostema di Taiwan può essere trovata non solo in Taiwan, ma anche nelle province cinesi di Yunnan, Guangxi, Guizhou, Jiangxi e Chekiang. L'adenostema di Taiwan contiene l'acido 11-idrossilato kauranico. Per essere efficacemente utilizzata nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata in forma di polvere macinata. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è quella di polvere macinata.

[0041] La houttuynia con foglia a cuore o erba Houttuynia (Houttuyniae cum Radice Houttuyniae Cordatae) è la parte terrestre di Houttuynia cordata di Thunberg. Essa appartiene alla famiglia delle Saururaceae.

   La houttuynia con foglia a cuore cresce in tutta la valle del fiume Yangtze ed a sud in Cina. La migliore stagione di raccolto è durante la stagione della fioritura in estate avanzata, fino all'inizio dell'autunno. La houttuynia con foglia a cuore di Hanhong può essere trovata nel Taichung Shien di Taiwan. Per essere efficacemente usata nella composizione a base di erbe, l'erba può essere preparata in forma di polvere macinata. La preparazione di dosaggio preferita per l'erba è quella di polvere macinata.

[0042] In generale, le composizioni sono preparate come segue:

A.

   Preparazione di STA-31, STA-32, STA-33, STA-34, STA-35 e STA-36:

[0043] (1) Le radici di pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano e l'intera pianta di tridax lanterna sono state tagliate, disidratate, macinate e passate attraverso un setaccio (preferibilmente 40-120 mesh (ASTM 0,420-0,125 mm) per produrre le polveri di erbe.

[0044] (2) La radice di ophiopogon è stata tagliata in piccoli pezzi ed immersa in acqua in un contenitore per decotti, in cui il volume d'acqua si trovava almeno 10 cm al disopra della sommità di ophiopogon. L'ophiopogon sommerso è stato riscaldato a temperatura da 97 a 103 deg. C per circa sessanta (60) minuti due volte per produrre una soluzione di estratto di ophiopogon. Quindi, la soluzione di estratto di ophiopogon e stata fatta passare attraverso un setaccio (approssimativamente 100 mesh (ASTM 0,150 mm). Il filtrato è stato raccolto.

   II filtrato di ophiopogon è stato poi condensato a temperatura da 50 a 60 deg. C sotto conidzioni di vuoto con una pressione tra 400 e 650 mm-HG (53 330-86 660) per ottenere un condensato liquido con una concentrazione desiderabile. Si è preferito che il condensato liquido fosse circa 1/14 del filtrato di ophiopogon.

[0045] (3) Il condensato liquido di ophiopogon è stato miscelato con le polveri di erbe delle erbe restanti. La miscela è stata poi trasferita al granulatore fluidizzato e disposta in un tubo di spruzzatura formato da tessuto per filtro. Il granulatore è stato regolato da 90 a 110 deg. C. Dopo preriscaldamento per circa cinque (5) minuti, la miscela è stata spruzzata per circa da 40 a 55 secondi per volta per un numero appropriato di volte ed il tubo di spruzzatura è stato battuto ad una frequenza di una volta ogni 10 secondi.

   Dopo granulazione, i granuli sono stati essiccati e poi raffreddati. I granuli sono stati fatti passare attraverso setacci e confezionati in sacchi di PE. Il contenuto di acqua preferito dei granuli era inferiore al 6%. I granuli possono essere ulteriore incapsulati in qualsivoglia delle capsule convenzionali, incluse, ma non limitate a, gelatina naturale, pectina, caseina, collagene, proteina, amido modificato e polivinilpirrolidone.

B. Preparazione della composizione di erbe STA-4:

[0046] La composizione di erbe STA-4 è stata preparata mediante il metodo seguente:

[0047] I.

   Per tridax lanterna: (1) La pianta intera di tridax lanterna è stata tagliata in piccoli pezzi.

[0048] (2) Circa 20 volte (in volume) di alcol al 50% (v/v) (cioè estraente) sono stati aggiunti e miscelati a circa 1 volta (in peso) dei piccoli pezzi di tridax lanterna.

[0049] (3) L'erba, insieme al suo estraente, è stata riscaldata mediante calore a riflusso per circa 30 minuti. Questo procedimento ha prodotto un estratto di alcol di tridax lanterna.

[0050] (4) Dopo raffreddamento dell'estratto, l'estratto alcolico di tridax lanterna è stato filtrato attraverso un setaccio (approssimativamente 100 mesh (ASTM 0,15C)). Il filtrato è stato raccolto. Il filtrato è stato poi condensato mediante un metodo di condensazione decompressa ad una temperatura da 50 a 60 deg. C (preferibilmente 55  c) sotto condizioni di vuoto (a 30 torr) (4000 Pa) per ottenere un condensato.

   Preferibilmente, il contenuto di solido del condensato è circa 7,8% del materiale grezzo. Il contenuto di solido del condensato è il condensato escludendo l'alcol al 50%. Nel caso di tridax lanterna, il contenuto di solido del condensato è circa lo stesso del condensato (poiché nel condensato vi è una quantità d'acqua molto piccola).

[0051] (5) Una quantità adeguata di amido di mais (come eccipiente) è stata aggiunta al condensato per produrre una pasta a base di erbe.

[0052] (6) La pasta a base di erbe è stata essiccata mediante metodo di essiccatura a spruzzo per formare granuli di tridax lanterna (preferibilmente circa 42% in peso del materiale grezzo).

II.

   Per pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano:

[0053] (1) Il tubero di pinellia e le radici di liquirizia e di ginseng americano sono stati separatamente tagliati in piccoli pezzi.

[0054] (2) Per ciascuna erba, circa 20 volte (in volume) di acqua sono state aggiunte e miscelate con circa 1 volta (in peso) dei piccoli pezzi delle erbe individuali, rispettivamente.

[0055] (3) Ciascuna erba, che era sommersa in acqua, è stata riscaldata per decotto per circa 30 minuti, risultando nella produzione di estratti acquosi di ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano, rispettivamente.

[0056] (4) Dopo raffreddamento del rispettivo estratto, ciascun estratto è stato separatamente filtrato attraverso un setaccio (approssimativamente 100 mesh (ASTM 0,150)).

   Ciascuno dei filtrati è stato raccolto e poi condensato mediante procedimento di condensazione decompressa ad una temperatura da 50 a 60 deg. C (preferibilmente a 55 deg. C) sotto condizione di vuoto a 30 torr (4000 Pa) per ottenere un condensato liquido per ciascuna delle erbe. È preferibile che il contenuto di solido del condensato di pinellia sia circa 20% del materiale grezzo di pinellia; il contenuto di solido del condensato di liquirizia grezza è circa 20% del materiale grezzo di liquirizia grezza; ed il contenuto di solido del condensato di ginseng americano è circa 24,3% del materiale grezzo di ginseng americano.

   Il contenuto di solido del condensato di pinellia, liquirizia grezza o ginseng americano è il condensato esclusa l'acqua.

[0057] (5) Una quantità adeguata di amido di mais (come eccipiente) è stata aggiunta a ciascun condensato e poi si è effettuata la granulazione mediante procedimento di essiccazione a spruzzo per produrre granuli individuali.

[0058] (6) I granuli individuali, assieme ai granuli da tridax lanterna sono stati miscelati per formare granuli misti.

III. Per ophiopogon:

[0059] Il tubero di ophiopogon è stato condensato in accordo con le procedure di II(1)-(4). La sola differenza tra il condensato di ophiopogon e quelli di pinellia, liquirizia grezza e ginseng americano consisteva nel fatto che il condensato di ophiopogon conteneva una quantità significativa di acqua, mentre il resto dei condensati era quasi privo di acqua.

   Per 9 g di materiale grezzo di ophiopogon, il condensato era circa 5,4 g in cui circa 2,25 g era contenuto di solido e 2,15 g era acqua.

[0060] Il condensato liquido di ophiopogon è stato miscelato con il resto dei granuli di erbe.

[0061] I pesi in grammi delle erbe nei materiali grezzi STA-36 e STA-4 sono illustrati nella tabella 3a seguente a titolo di confronto:

[0062] Tabellea 3a. Contenuto e peso die STA-36 e STA-4
<tb><sep>Ophiopogon<sep>Pinellia<sep>Liquirizia grezza<sep>Ginseng americano<sep>Tridax
lanterna<sep>Peso totale (forma di
dosaggio orale)<sep>Rapporto
(dosaggio)
di STA-36/ STA-4


  <tb>Materiale grezzo<sep>9 g<sep>6 g<sep>3 g<sep>3 g<sep>3 g<sep>24 g<sep>


  <tb>STA-36<sep>5,4 g
(2,25 SC*
+ 3,15 g
acqua<sep>6 g
(polveri di
erbe)<sep>3 g
(polveri di
erbe)<sep>3 g
(polveri di erbe)<sep>3 g
(polveri di erbe)<sep>20,4
(polveri di
erbe)<sep>2


  <tb>STA-4<sep>5,40 g
condensato (2,25 g SC* + 3,15 g
acqua)<sep>1,50 g granuli (1,20 g SC* + 0,30 g amido di mais)<sep>0,60 g
granuli
(0,60 g SC* + 0,03 g
amido di mais)<sep>0,96 g
granuli (0,73 g SC* +
0,23 g amido di mais)<sep>1,25 g granuli (0,23 g SC* +
1,02 g amido di mais)<sep>10,20 g
(9,74 g di
granuli e condensato di ophiopogon + 0,46 g
di amido
di mais<sep>*SC = contenuto di solido (che è il condensato essiccato (condensato esclusa l'acqua o il solvente)).

[0063] Nella tabella 3a, la riga "materiale grezzo" illustra il peso di ciascuna erba prima del processo di trattamento. Le righe "STA-36" e "STA-4" illustrano (1) quale era la forma finale di ciascuna delle erbe; e (2) quello che era il peso finale di ciascuna delle erbe.

   Ad esempio, in STA-36, eccetto il caso di ophiopogon che era in forma di condensato, la pinellia, la liquirizia grezza, il ginseng americano e la tridax lanterna erano tutti in forma di polveri di erbe. Inoltre, con l'eccezione di ophiopogon che conteneva un peso inferiore rispetto al suo materiale grezzo, le polveri di erbe del resto delle erbe in STA-36 mantenevano lo stesso peso dei rispettivi materiali grezzi.

[0064] In STA-4, soltanto l'ophiopogon manteneva la stessa forma finale di quella in STA-36, cioè come condensato. Il peso in grammi del resto delle erbe, dopo essere state sottoposte ad estrazione, condensazione e granulazione, è stato sostanzialmente ridotto, come indicato nella tabella 3a. Inoltre, per favorire la stabilizzazione del condensato durante la granulazione, è stato aggiunto un eccipiente (ad esempio amido di mais) a ciascuno dei condensati di erbe.

   La quantità di amido di mais che era addizionata a ciascuno dei condensati variava in funzione della stabilità dei condensati. Il prodotto finale di STA-4, che era in forma di granuli, era circa la metà del peso del prodotto finale di STA-36, quantunque entrambi fossero derivati dalla stessa quantità di materiali grezzi. La riduzione nel peso totale in grammi in STA-4, mantenendo gli stessi o con migliori effetti terapeutici su affezioni immunologiche di STA-36, costituiva un altro miglioramento rispetto a STA-36, in quanto significava che i pazienti avrebbero dovuto assumere una quantità doppia delle erbe per ottenere gli stessi o migliori effetti terapeutici.

[0065] Gli esempi che seguono sono illustrativi e non dovrebbero essere considerati come limitativi dell'ambito dell'invenzione.

   Possono essere effettuate variazioni ragionevoli, quali quelle che risultano al tecnico ragionevole, senza uscire dall'ambito della presente invenzione.

Esempio 1

Preparazione di STA-31, STA-32, STA-33, STA-34, STA-35 e STA-36

[0066] I contenuti delle composizioni farmaceutiche sono illustrati nella tabella 1 e le quantità in peso delle erbe nelle combinazioni sono illustrate nella tabella 3.

[0067] Tabella 3. Quantità (in peso) di ciascuna erba utilizzata in STA-3
<tb>Es. n.<sep>Nome<sep>Ophiopogon (kg)<sep>Tang-shen,
o notoginseng,
o ginseng americano (kg)<sep>Pinellia (kg)<sep>Liquirizia (kg)<sep>Tridax lanterna,
o adenostema di
Taiwan, o houttuynia
a foglia di cuore (kg)


  <tb>1<sep>STA-31<sep>3,00<sep>1,00
(Tang-shen)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00
(Adenostema di Taiwan)


  <tb>2<sep>STA-32<sep>3,00<sep>1,00
(Tang-shen)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00
(Houttuynia a foglia
di cuore)


  <tb>3<sep>STA-33<sep>3,00<sep>1,00
(Tang-shen)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00 (Tridax lanterna)


  <tb>4<sep>STA-34<sep>3,00<sep>1,00
(Ginseng amer.)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00
(Adenostema di Taiwan)


  <tb>5<sep>STA-35<sep>3,00<sep>1,00
(Ginseng amer.)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00
(Houttuynia a foglia di
cuore)


  <tb>6<sep>STA-36<sep>3,00<sep>1,00
(Ginseng amer.)<sep>2,00<sep>1,00<sep>1,00
(Tridax lanterna)

[0068] Il procedimento per la preparazione delle composizioni farmaceutiche era primariamente lo stesso, quale il metodo generale di preparazione delle composizioni (vedi supra).

[0069] (1) Tutte le erbe applicabili, con eccezione di ophiopogon, nelle quantità indicate nella tabella 3, sono state tagliate, disidratate, macinate e fatte passare attraverso un setaccio (preferibilmente 40-120 mesh (ASTM 0,420-0,125 mm)) per produrre una polvere di erbe.

[0070] (2) L'ophiopogon nella quantità indicata nella tabella 3 è stata immersa in acqua in un contenitore per friggitura-bollitura, ove il volume di acqua era almeno 10 cm al disopra della sommità di ophiopogon. L'ophiopogon sommerso è stato riscaldato da 97 a 103 deg.

   C per circa sessanta (60) minuti due volte per produrre una soluzione di estratto di ophiopogon. Quindi, la soluzione di estratto di ophiopogon è stata fatta passare attraverso un setaccio (approssimativamente 100 mesh (ASTM 0,150 mm)). Il filtrato è stato raccolto. Il filtrato di ophiopogon è stato quindi condensato a temperatura da 50 a 60 deg. C sotto condizioni di vuoto con pressione tra 400 e 650 mm-Hg (53 300-86 600 Pa) per ottenere un condensato liquido con una concentrazione desiderabile. Si è preferito che il condensato liquido fosse circa 1/14 del filtrato di ophiopogon.

[0071] (3) Il condensato liquido di ophiopogon è stato miscelato con le polveri di erbe del resto delle erbe. La miscela è stata quindi trasferita ad un granulatore fluidizzato e disposto in un tubo di spruzzatura formato da tessuto per filtro. Il granulatore è stato regolato da 90 a 110 deg. C.

   Dopo preriscaldamento per circa cinque (5) minuti, la miscela è stata spruzzata da circa 40 a 55 secondi per volta per un numero appropriato di volte ed il tubo di spruzzatura è stato battuto ad una frequenza di una volta ogni 10 secondi. Dopo granulazione, i granuli sono stati essiccati e poi raffreddati. I granuli sono stati fatti passare attraverso setacci e confezionati in sacchetti di PE. Il contenuto preferito di acqua dei granuli era inferiore al 6%.

   I granuli possono essere ulteriormente incapsulati in qualsivoglia delle capsule convenzionali, incluse, ma non limitate a, gelatina naturale, pectina, caseina, collagene, proteina, amido modificato e polivinilpirrolidone.

Esempio 2

Controlli di qualità delle composizioni farmaceutiche utilizzando cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)

[0072] La presente invenzione ha utilizzato tecniche HPLC per assicurare che la qualità delle erbe fosse ben sotto controllo. Tre metodi HPLC sono stati sviluppati per venire incontro alle caratteristiche chimiche e fisiologiche di ciascuna erba. I tre metodi HPLC sono descritti come segue:

(A) Metodo 1 di analisi HPLC

[0073] Il metodo 1 ha utilizzato una precolonna Lichrospher RP-18 endcapped (5 Microm, 4,0 ID X 10 mm, Merck) ed una colonna Cosmosil 5C18-MS (5 Microm, Nacalai tesque 5C18-MS, 4,6 ID X 250 mm) a temperatura ambiente.

   La fase mobile della colonna era un gradiente contenente (A) H2O: KH2PO4: 10% H3PO4 (1000 ml: 2,72 g: 1 ml, v/p/v), (B) CH3CH, (C) H2O e (D) CH3OH. Il gradiente di eluizione è descritto nella tabella 4. La portata era di 1,0 ml/min. La lunghezza d'onda di rivelazione era 250 nm. Il tempo totale di ritenzione dell'analisi era 60 minuti.

[0074] Tabella 4. Gradiente di fase mobile del metodo 1
<tb>Tempo<sep>(A)<sep>(B)<sep>(C)<sep>(D)


  <tb>Iniziale<sep>90<sep>10<sep>0<sep>0


  <tb>30<sep>75<sep>25<sep>0<sep>0


  <tb>40<sep>65<sep>35<sep>0<sep>0


  <tb>55<sep>0<sep>75<sep>25<sep>0


  <tb>60<sep>0<sep>10<sep>90<sep>0Post run: 15 minuti

[0075] (B) Metodo 2 di analisi HPLC

[0076] Il metodo 2 di analisi HPLC ha utilizzato una precolonna Lichrospher RP-18 endcapped (5 Microm, 4,0 ID X 10 mm, Merck) ed una colonna Cosmosil 5C18-MS (5 Microm, Nacalai tesque 5C18-MS, 4,6 ID X 250 mm) a 35 deg. C. La fase mobile della colonna era un gradiente contenente (A) 10 mM KH2P04 + 10 mM K2HPO4 + 0,01% H3PO4 (KH2PO4: K2HPO4: 10% H3PO4: H2O = 1,36 g: 1,74 g: 1 ml: 1000 ml), (B) CH3CN, (C) H2O e (D) CH3OH. Il gradiente di eluizione è descritto nella tabella 5. La portata era di 1,0 ml/min. La lunghezza d'onda di rivelazione era 260 nm. Il tempo totale di ritenzione dell'analisi era 60 minuti

[0077] 
<tb>Tempo (mm)<sep>(A)<sep>(B)<sep>(C)<sep>(D)


  <tb>Iniziale<sep>100<sep>0<sep>0<sep>0


  <tb>25<sep>60<sep>0<sep>20<sep>20


  <tb>30<sep>20<sep>0<sep>20<sep>60


  <tb>35<sep>100<sep>0<sep>0<sep>0Post run: 15 minuti.

(C) Metodo 3 dell'analisi HPLC

[0078] Il metodo 3 di analisi HPLC ha utilizzato una precolonna Lichrospher RP-18 endcapped (5 Microm, 4,0 ID X 10 mm, Merck) ed una colonna Cosmosil 5C18-MS (5 Microm, Nacalai tesque 5C18-MS, 4,6 ID X 250 mm) a 35 deg. C. La fase mobile della colonna era un gradiente contenente (A) H2O: KH2PO4 (1000 ml: 2,72 g, v/p), (B) CH3CH, (C) H2O e (D) CH3OH. Il gradiente di eluizione è descritto nella tabella 6. La portata era di 1,0 ml/min. La lunghezza d'onda di rivelazione era 203 nm. Il tempo totale di ritenzione dell'analisi era 60 minuti.

[0079] Tabella 6. Gradiente di fase mobile del metodo 3
<tb>Tempo (min)<sep>(A)<sep>(B)<sep>(C)<sep>(D)


  <tb>Iniziale<sep>80<sep>20<sep>0<sep>0


  <tb>40<sep>65<sep>35<sep>0<sep>0


  <tb>55<sep>0<sep>80<sep>20<sep>0


  <tb>60<sep>0<sep>20<sep>80<sep>0Post run: 15 minuti.

[0080] L'analisi HPLC delle erbe utilizzate nelle composizioni, che include il metodo, il(i) marcante(i) principale(i) e la lunghezza d'onda di rivelazione di ciascuna erba sono riassunti nella tabella 7. I cromatogrammi HPLC delle erbe di STA-36 sono illustrati nelle fig. 1-5.

[0081] Tabella 7. Analisi HPLC delle erbe utilizzate in STA-36
<tb>Nome erba<sep>HPLC metodo
analitico<sep>Marcante (i)<sep>Tempo di ritenzione (min)<sep>Lunghezza d'onda (nm)


  <tb>Ophiopogon<sep>Metodo 1<sep>6115-1
6115-2<sep>11,5
13,0<sep>214
214


  <tb>Pinellia<sep>Metodo 2<sep>Adenina
Guanosina<sep>14,8
17,0<sep>250
250


  <tb>Radice di
Glycyrrhizae<sep>Metodo 1<sep>Glicirrizina<sep>46,4<sep>250


  <tb>Ginseng americano<sep>Metodo 3<sep>Ginsenoside Rb1<sep>45,00<sep>203


  <tb>Tridax lanterna<sep>Metodo 1<sep>FY-1
FY-2
FY-3
FY-4<sep>28,00
31,6
33,5
18,3<sep>250
250
250
250

[0082] Prima dell'analisi HPLC, 0,5 g del campione di erbe sono stati miscelati con 20 ml di soluzione contenente 70% di metanolo. La soluzione campione è stata sonicata 15 minuti a temperatura ambiente e disposta in un bagno d'acqua rotante a 40 deg. C per 20 minuti con una velocità di rotazione regolata a 160 rpm. La soluzione di campione è stata poi lasciata a riposo per circa 30 minuti per permettere la precipitazione delle fecce. Dieci (10) ml del surnatante sono stati poi pipettati e fatti passare attraverso un filtro da 0,45 Microm. Il filtrato era pronto per l'analisi HPLC. Venti (20) Microl del filtrato sono stati presi per l'analisi HPLC.

Risultati:

[0083] Il cromatogramma HPLC di ophiopogon è illustrato nella fig. 1.

   Come illustrato nella tabella 7, il metodo 1 di analisi HPLC è stato utilizzato per rivelare l'ophiopogon a 214 nm di lunghezza d'onda. Due picchi distintivi, 6115-1 e 6115-2 sono stati identificati sul cromatogramma di ophiopogon. 6115-1 aveva un tempo di ritenzione di 11,5 minuti. 6115-2 aveva un tempo ritenzione di 13 minuti. Quantunque i componenti chimici in questi due picchi non siano stati ancora identificati, essi potrebbero essere utilizzati per lo scopo di assicurare la qualità di ophiopogon.

[0084] Il cromatogramma HPLC di pinellia è illustrato nella fig. 2. Come illustrato nella tabella 7, utilizzante il metodo 2 di analisi HPLC per rivelare pinellia a 250 nm di lunghezza d'onda, la pinellia ha mostrato due marcanti chimici distintivi, cioè adenina e guanosina, entrambi costituenti di acidi nucleici.

   L'adenina aveva anche l'effetto di innalzare l'aldolasi di siero. L'adenina ha un tempo di ritenzione di 14,8 minuti. La guanosina aveva un tempo di ritenzione di 17 minuti.

[0085] Il cromatogramma HPLC di Radix Glycyrrhizae è illustrato nella fig. 3. Come illustrato nella tabella 7, utilizzando il metodo 1 di analisi HPLC per rivelare Radix Glycyrrhizae a 250 nm di lunghezza d'onda, un marcante chimico "glicirrizina" è stato ritrovato nel cromatogramma HPLC di Radix Glycyrrhizae. La glicirrizina (C42H62O16) è una sostanza molto dolce. È nota per avere effetti di detossificazione, antinfiammazione ed emolitici ed è stata utilizzata per trattare la malattia di Addison. Il tempo di ritenzione per la glicirrizina è 46,4 minuti.

[0086] Il cromatogramma HPLC di ginseng americano è illustrato nella fig. 4.

   Come mostrato nella tabella 7, utilizzando il metodo 3 per rivelare il ginseng americano a 203 nm di lunghezza d'onda si è trovato un marcante chimico "ginsenoside Rb1" nel cromatogramma HPLC di ginseng americano. Ginsenoside Rb1 ha effetti medicinali sulla dilatazione dei vasi sanguigni, nel sollievo da fatica e nell'evitare l'emolisi.

[0087] Il cromatogramma HPLC di tridax lanterna è illustrato nella fig. 5. Come indicato nella tabella 7, utilizzando il metodo 1 di analisi HPLC per rivelare tridax lanterna a 250 nm di lunghezza d'onda sono stati identificati quattro (4) picchi distintivi, FY-1 a FY-4. FY-1 ha un tempo di ritenzione di 28,0 minuti. FY-2 ha un tempo di ritenzione di 31,6 minuti. FY-3 ha un tempo di ritenzione di 33,5. FY-4 ha un tempo di ritenzione di 18,3 minuti.

   A seguito della consistente apparizione di questi quattro picchi, anche se non sono stati ancora identificati i contenuti chimici associati con questi quattro picchi, essi potrebbero essere utilizzati al fine di identificare ed assicurare la qualità di tridax lanterna.

Esempio 3

Caratterizzazione per cromatografia a strato sottile (TLC) di liquirizia grezza, ophiopogon, pinellia e tridax lanterna

[0088] In aggiunta al metodo HPLC, alcune delle erbe utilizzate nelle composizioni STA-36, includenti liquirizia grezza, ophiopogon, pinellia e tridax lanterna, possono essere caratterizzate mediante metodi di cromatografia a strato sottile (TLC).

[0089] Il metodo TLC ha utilizzato una fase stazionaria di gel di silice 60 F254 (che era legata alla piastra TLC) e tre solventi di fase mobile (o di dissociazione) in funzione delle caratteristiche delle erbe.

   Il primo solvente conteneva acetato di etile, acqua ammoniacale 4 N ed etanolo in rapporto in volume di 1:1:2 (v/v/v). Questo primo solvente era particolarmente utile per la caratterizzazione di liquirizia grezza. Il secondo solvente conteneva butanolo, acqua ammoniacale 4 N ed etanolo in rapporto in volume di 5:2:1 (v/v/v). Questo secondo solvente era particolarmente utile per la caratterizzazione di ophiopogon e ginseng americano. Il terzo solvente conteneva cloroformio (CHCl3) e metanolo in un rapporto in volume di 5:2 (v/v). Questo terzo solvente era particolarmente utile per la caratterizzazione di tridax lanterna. Per ciascuna determinazione TLC, 5 Microl del campione sono stati aggiunti al punto iniziale della piastra TLC. La piastra è stata disposta in una camera per TLC, nella quale si è applicato il solvente di fase mobile.

   Il solvente è stato lasciato migrare fino a 9 cm. I risultati della determinazione TLC sono descritti come segue:

(A) Liquirizia grezza

[0090] La liquirizia grezza è stata analizzata mediante TLC utilizzando una fase stazionaria di gel di silice 60 F254 legata ad una piastra di TLC ed un solvente di fase mobile contenente etilacetato: acqua ammoniacale 4 N: etanolo = 4:1:2 (v/v/v). Dopo l'applicazione del campione la piastra TLC è stata disposta nella camera di TLC che conteneva il solvente di fase mobile con la marcatura di liquido superiore che non superava il punto di applicazione del campione. Il solvente è stato lasciato migrare fino a 9 cm dal punto di applicazione del campione. Quindi, la piastra TLC è stata estratta dalla camera di TLC ed essiccata in aria. La piastra TLC essiccata è stata spruzzata con un reagente di spruzzatura contenente vanillina/H2SO4.

   La piastra è stata quindi attivata con calore a 105 deg. C per due (2) minuti. Sulla piastra è apparsa una macchia gialla che rappresentava la liquirizia grezza ad approssimativamente Rf = 0,5 (Rf = distanza [cm] / distanza totale di migrazione [cioè 9 cm]).

(B) Ophiopogon

[0091] L'ophiopogon è stato analizzato mediante TLC utilizzando una fase stazionaria di gel di silice 60 F254 legata ad una piastra TLC con un solvente di fase mobile contenente butanolo: acqua ammoniacale 4 N: etanolo = 5:2:1 (v/v/v). Dopo l'applicazione del campione, la piastra TLC è stata disposta nella camera di TLC che conteneva il solvente di fase mobile con la marcatura di liquido superiore che non superava il punto di applicazione del campione. Il solvente è stato lasciato migrare fino a 9 cm dal punto di applicazione del campione.

   Quindi la piastra TLC è stata estratta dalla camera TLC ed essiccata in aria. La piastra TLC essiccata è stata spruzzata con un reagente di spruzzatura contenente vanillina/H2SO4. La piastra è stata quindi attivata con calore a 105 deg. C per due (2) minuti. Sulla piastra è apparsa una macchia marrone che rappresentava l'ophiopogon ad approssimativamente Rf = 0,4.

(C) Ginseng americano

[0092] Il ginseng americano è stato analizzato mediante TLC utilizzando una fase stazionaria di gel di silice 60 F254 legata ad una piastra TLC con un solvente di fase mobile contenente butanolo: acqua ammoniacale 4 N: etanolo = 5:2:1 (v/v/v). Dopo l'applicazione del campione, la piastra TLC è stata disposta nella camera di TLC che conteneva il solvente di fase mobile con la marcatura di liquido superiore che non superava il punto di applicazione del campione.

   Il solvente è stato lasciato migrare fino a 9 cm dal punto di applicazione del campione. Quindi la piastra TLC è stata estratta dalla camera di TLC ed essiccata in aria. La piastra TLC essiccata è stata spruzzata con un reagente di spruzzatura contenente vanillina/H2SO4. La piastra è stata poi attivata con calore a 105 deg. C per due (2) minuti. Sulla piastra è apparsa una macchina tendente al violetto, che rappresentava il ginseng americano ad approssimativamente Rf = 0,3.

(D) Tridax lanterna

[0093] Tridax lanterna è stata analizzata mediante TLC utilizzando una fase stazionaria di gel di silice 60 F254 legata ad una piastra TLC con un solvente di fase mobile contenente cloroformio: metanolo = 5:1 (v/v).

   Dopo l'applicazione del campione, la piastra TLC è stata disposta nella camera di TLC che conteneva il solvente di fase mobile con la marcatura di liquido superiore che non superava il punto di applicazione del campione. Il solvente è stato lasciato migrare fino a 9 cm dal punto di applicazione del campione. Quindi, la piastra TLC è stata estratta dalla camera di TLC ed essiccata in aria. La piastra TLC essiccata è stata disposta al disotto di un rivelatore UV e rivelata a lunghezza d'onda di 366 nm.

   Sulla piastra è apparsa una macchina giallo pallido fluorescente che rappresentava tridax lanterna ad approssimativamente Rf = 0,3.

Esempio 4

Effetti di cinque formulazioni di decotto di erbe cinesi tradizionali su IgG, IgE indotte da allergene e su IL-4 nei topi

[0094] Gli effetti di cinque formulazioni di decotto a base di erbe cinesi tradizionali sulla soppressione della sintesi di immunoglobulina G (IG), immunoglobulina E (IgE) indotta da allergene, e l'espressione del gene dell'interleuchina-4 (IL-4) sono stati investigati utilizzando topi BALB/c sensibilizzati con D.P. (Dermatophagoides pteronyssimus) allergene "Der p 5".

   Dermatophagoides pteronyssiumus è l'acaro della polvere di casa che agisce come un antigene e produce una reazione asmatica allergica in persona atopica.

[0095] Le formulazioni di questi decotti cinesi tradizionali sono mostrate in tabella 8.

[0096] È noto che questi gruppi di decotti cinesi tradizionali hanno particolari effetti sul trattamento di pazienti con disturbi correlati con i polmoni, quali l'asma.

[0097] Tabella 8. Formulazioni di cinque decotti a base die erbe chinesi tradizionali
<tb>Nome dei decotti a base di erbe cinesi
tradizionali<sep>Ingredienti erbacei (con rapporto in peso)


  <tb>Polvere drenante bianca<sep>Liquirizia (2,25), scorza di radice di gelso (4,5), corteccia di dulcamara (4,5), riso non glutinoso a chicchi tondi brillato/riso japonica (6).


  <tb>Decotto del piccolo drago verde-blu<sep>Pinellia (4), efedra (4), peonia erbacea cinese (4), zenzero selvatico cinese (1,5), liquirizia (4), zenzero essiccato (4), rametto di cinnamomo (4), frutto di schisandra (1,5).


  <tb>Decotto di ophiopogon<sep>Ginseng (2), riso non glutinoso a chicchi tondi brillato/riso japonica (4), pinellia (2), dattero cinese/giuggiola (2), liquirizia (2), ophiopogon (8).


  <tb>Decotto per eliminare la secchezza e liberare i polmoni<sep>Foglia di gelso bianco (7,5), colla di pelle d'asino/gelatina (2), ginseng (2), gesso (6,5), liquirizia (2,5), ophiopogon (3), seme/nocciolo di albicocca (2), semi di sesamo nero (2,5), foglia di nespolo del Giappone (2).


  <tb>Decotto di frutto di perilla per abbassare il Qi<sep>Frutto di perilla porpora (5), buccia di mandarino (3), pinellia (5), radice di angelica cinese (2), radice di pencedano (2), liquirizia (2), scorza di cinnamomo (3), scorza di magnolia (2), rizoma fresco di zenzero (2), dattero cinese/giuggiola (1).

Programma, sperimentale:

(A) Preparazione di materiali a base di erbe:

[0098] Cinquanta (50) mg di ciascuna delle formulazioni a base di erbe sopra indicate (tutte da Sun Ten Sci. Pharm. Corp. Taipei, Taiwan) sono stati mescolati con 180 Microl di Tween 80, rispettivamente, ed omogeneizzati (omogeneizzatore DC-3S, Xinguang Precision Instrument Industrial Limited, Inc., Taiwan). All'omogenato è stata aggiunta acqua per portare il volume finale a 2 ml, e la concentrazione finale 25 mg/ml.

   Ciascun topo ha ricevuto 0,4 ml/per 20 g di peso corporeo di una delle soluzioni di composizione a base di erbe o placebo un giorno s Å e uno no per quattordici (14) giorni.

(B) Animali

[0099] Topi femmine BALB/c tra 4 e 6 settimane di età sono stati ottenuti dal Centro di Riproduzione Animale Nazionale, Repubblica Cinese, ed utilizzati in questi studi. I topi avevano uguale età e sesso in ciascun esperimento.

(C) Purificazione dell'allergene Per p 5 (allergene del gruppo 5 di Dermatophagoidespteronyssinus)

[0100] È stato utilizzato il plasmide pGEX-2T per esprimere Der p 5-glutatione S-transferasi (GST) in E.coli. Il peso molecolare della proteina di fusione era circa 42 kD.

   La proteina è stata purificata mediante cromatografia su colonna di gel di agarosio coniugato con glutatione. È stata selezionata una singola colonia del ceppo batterico positivo per Der p 5-GST facendo crescere E.coli transfettato su brodo LB contenente ampicillina (100 Microg/ml). La colonia di E.coli positiva per Der p 5-GST è stata ulteriormente coltivata per produrre una quantità sostanziale di Der p 5-GST. Poi la colonia batterica è stata raccolta e centrifugata. Il surnatante è stato scartato, ed il pellet è stato lavato con TBS (pH 7,5) e raccolto in una provetta per centrifuga. Immediatamente dopo il lavaggio con TBS, al pellet è stato aggiunto fenilmetilsofonil fluoruro 0,1 M, seguito dall'aggiunta di DNasi I, Tween 20, e lisozima. Il pellet è stato lisato con il processo di congelamento e scongelamento per rilasciare la proteina Der p 5 + GST.

   Successivamente, EDTA è stato aggiunto al lisato cellulare che è stato poi centrifugato. Il pellet è stato scartato, e il surnatante è stato versato su una colonna di adsorbimento di gel di agarosio coniugato con glutatione dove la proteina Der p 5-GST è stata adsorbita sulla colonna. La colonna è stata lavata prima con soluzione tampone TBS a 4 deg. C, e poi con glutatione ridotto in tris-base (pH 8,0) per separare la Der p 5-GST dalla colonna di gel di agarosio. La purezza della proteina Der p 5-GST è stata confermata mediante SDS-PAGE.

   La quantità di proteina è stata misurata con metodi analitici convenzionali per le proteine.

(D) Sensibilizzazione degli animali

[0101] I topi BALB/c sono stati inizialmente sensibilizzati intraperitonealmente con 10 Microg di allergene del gruppo 5 di Dermatophagoides pteronyssimus ("Der p 5") e 4 mg di idrossido di alluminio (Wyeth Pharmaceuticals, Punchbowl, Australia). Sette (7) giorni dopo la prima sensibilizzazione, i topi, ad eccezione del gruppo di controllo placebo, sono stati alimentati con decotti a base di erbe cinesi.

[0102] Tre (3) settimane dopo la prima sensibilizzazione, i topi sono stati sottoposti a richiamo di nuovo con Der p 5.

   Tre (3) giorni dopo la seconda iniezione di richiamo, i topi sono stati posti in un contenitore di plastica rotondo dove i topi sono stati ulteriormente stimolati con 0,1% Der p 5 in spray.

[0103] Ogni volta dopo l'iniezione di richiamo, 50 Microl di sangue sono stati raccolti dalla vena della coda di ciascun topo il giorno successivo. Il sangue è stato lasciato sedimentare a temperatura ambiente per 1 ora e poi centrifugato. Il siero è stato raccolto e conservato a -80 deg. C per l'analisi ELISA (vedere sotto).

(E) Determinazione di IgE e IgG specifiche per Der p 5

[0104] La quantità di IgG ed IgE specifiche per Der p 5 è stata determinata mediante saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA).

   Piastre ad elevato legame di proteine sono state rivestite con 100 Microl di Der p 5 purificato diluito in tampone di rivestimento (NaHCO3 0,1 M, pH 8,2) a una concentrazione di 5 Microg/ml. Dopo incubazione per tutta la notte a 4 deg. C, le piastre sono state lavate tre volte e bloccate con tampone BSA/PBS 3% (p/v) per 2 ore a 25 deg. C. I sieri sono stati utilizzati alla diluizione di 1:100 per la misurazione di IgG e alla diluizione di 1:10 per la misurazione di IgE in duplicato. Dopo incubazione per tutta la notte a 4 deg. C, è stato aggiunto per un'altra ora o un mAb monoclonale di ratto anti-IgE di topo coniugato con biotina o un anticorpo monoclonale di ratto anti-IgG di topo diluiti in tampone con gelatina allo 0,05%. Avidin-fosfatasi alcalina (1:1000) è stata poi aggiunta ed incubata per 1 ora a 25 deg. C, seguita da sei (6) lavaggi.

   La reazione colorata è stata sviluppata con l'aggiunta di substrato della fosfatasi p-nitrofenilfosfato, disodico. Le piastre sono state lette in un lettore automatico di micropiastre (Metertech, Taiwan) a 405 nm. Le letture sono state riferite a standard isotipici commerciali che erano mAb anti-TNP di topo, IgGl (107,3) IgG2a (G155-178), e IgE (IgE-3).

(F) Espressione del gene di IL-4 in splenociti mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi-transcrittasi inversa)

[0105] Gli splenociti sono stati isolati da topi BALB/c dopo che gli animali erano stati sensibilizzati e stimolati con l'allergene Der p 5 seguito da trattamento, rispettivamente, con 5 decotti a base di erbe come elencati nella tabella 8 o placebo. Gli splenociti sono stati incubati con Der p 5 (15 Microg/ml) per 4 ore.

   L'RNA è stato estratto utilizzando il reagente tridzol (Gibco BRL, Life Technologies, U.S.A.). L'RNA estratto è stato utilizzato per la produzione di cDNA utilizzando il corredo Ready to go T-Primed First-Strand (Pharmacia Biotech, U.S.A.). Il cDNA è stato utilizzato come stampo per la reazione a catena della polimerasi (PCR). Una coppia di primer specifici per IL-4 aventi le sequenze di: 5 ¾-GAATGTACCAGCCATATC-3 ¾ (SEQ ID NO:l), e 5 ¾-CTCAGTACTACGAGTAATCCA-3 ¾ (SEQ ID NO:2);
è stata utilizzata per l'amplificazione PCR e la rivelazione del gene di IL-4. Una coppia di primer specifici per HPRT (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi) aventi le sequenze di:
5 ¾GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3 ¾ (SEQ ID NO:3); e
5 ¾-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3 ¾ (SEQ ID NO:4);
è stata utilizzata per l'amplificazione PCR e la rivelazione di HPRT.

   La PCR è stata eseguita nelle seguenti condizioni: denaturazione a 95 deg. C per 5 minuti, seguita da 35 cicli di 95 deg. C per 1 minuto, 72 deg. C per 1 minuto e 55 deg. C per 3 minuti in un termo-cycler. I prodotti della PCR sono stati poi sottoposti ad elettroforesi su un gel di agarosio al 2%.

(G) Analisi statistica

[0106] Per valutare variazioni di IgG, IgE specifiche per Der p 5, e del rapporto IL-4/HPRT dopo stimolazione con Der p 5, sono state effettuate misure ripetute di ANOVA per confrontare le differenze tra i gruppi. Dopo l'analisi della varianza, è stato utilizzato il test di rango multiplo di Duncan per distinguere le differenze tra i gruppi sperimentali e di controllo.

   Un p<0,05 è stato utilizzato per indicare una differenza statisticamente significativa.

Risultati:

[0107] Come è mostrato in fig. 6, i livelli di IgG e IgE in topi dopo stimolazione con Der p 5 seguita da trattamento con i 5 decotti a base di erbe cinesi tradizionali non differivano significativamente dal gruppo di controllo (placebo). Le unità ELISA per le IgG nel gruppo polvere drenante bianca (A), gruppo decotto del drago verde blu (B), gruppo decotto di ophiopogon (C), gruppo decotto per eliminare la secchezza e per liberare i polmoni (D), gruppo decotto di frutto di perilla per abbassare il Qi (E), e gruppo placebo (F) erano 70,9+-42, 62,5+-44, 63,3+-44, 63,3+-43, 59,7+-38 e 67,4+-42, rispettivamente.

   Le unità ELISA per le IgG nel gruppo polvere drenante bianca (A), gruppo decotto drago verde-blu (B), gruppo decotto di ophiopogon (C), gruppo decotto per eliminare la secchezza e liberare i polmoni (D), gruppo decotto di frutto di perilla per abbassare il Qi (E), e gruppo placebo (F) erano 99,3+-23, 106,3+-34, 104,9+-23, 105,7+-23, 93,9+-21 e 97,8+19, rispettivamente.

[0108] I risultati della fig. 6 dimostrano che i 5 decotti a base di erbe cinesi tradizionali non sopprimono la produzione di IgE.

[0109] Come mostrato in fig.

   7, ad eccezione del decotto di ophiopogon che presenta una diminuzione significativa in IL-4/HPRT il resto dei decotti a base di erbe cinesi tradizionali non hanno effetto per quanto riguarda la soppressione della produzione genica di IL-4.

Esempio 5

Effetti di erbe singole nelle STA-31, STA-32, STA-33, STA-34, STA-35, ed STA-36 su IgG, IgE indotte da allergene e IL-4 in topi

[0110] Gli effetti di erbe singole, inclusi ophiopogon, pinellia, liquirizia grezza e tang-shen, e della STA-36 su IgG, IgE, indotte da allergene e IL-4 sono stati indagati utilizzando topi BALN/c sensibilizzati con D.P. allergene "Der p 5".

   I programmi sperimentali di questo esempio erano gli stessi descritti nell'esempio 5 (sopra).

[0111] Risultati: i livelli di IgG nel siero dei topi dopo che erano stati stimolati con l'allergene Der p 5 e poi trattati con ophiopogon, tang-shen, pinellia, e liquirizia grezza sono presentati in fig. 8. I risultati indicavano che i livelli di IgG non erano significativamente differenti tra trattamento con ophiopogon, tang-shen e pinellia e con placebo. Il livello di IgG dopo trattamento con liquirizia grezza era significativamente minore di quello del trattamento con placebo.

[0112] Tuttavia, come è mostrato in fig. 9, i livelli di IgE nel siero dei topi dopo che erano stati stimolati con Der p 5 e poi trattati con ophiopogon, tang-shen e la composizione STA-36 erano significativamente minori di quelli del placebo.

   Infatti, dopo trattamento con la composizione STA-36, il livello di IgE era ridotto di più di 2,5 volte. I livelli di IgE dopo trattamento con pinellia e liquirizia grezza differivano non significativamente da quelli del trattamento placebo.

[0113] Come mostrato in fig. 10, l'espressione del gene di IL-4 (misurata mediante RT-PCR ed espressa come rapporto IL-4/HPRT) in splenociti di topo dopo che erano stati stimolati con Der p 5 e poi trattati con ophiopogon, tang-shen, pinellia e liquirizia grezza, rispettivamente, non erano significativamente differenti da quelli del placebo.

   Tuttavia, l'espressione del gene di IL-4 dopo trattamento con STA-36 era significativamente minore di quella del placebo, indicando che la STA-36 può regolare verso il basso l'espressione del gene di IL-4.

Esempio 6

Procedimenti per determinare IgG, IgE, IL-4 e IFN-y in animali

[0114] Gli effetti delle composizioni a base di erbe STA-36 ed STA-4 come pure di erbe singole sulla soppressione di immunoglobulina G (IgG), immunoglobulina E (IgE), indotte da allergene, interleuchina-4 (IL-4), e interferone gamma  (IFN-gamma ) sono stati indagati utilizzando topi BALB/c sensibilizzati con D.P.

   (Dermatophagoides pteronyssimus) allergene "Der p 5".

[0115] Dermatophagoides pteronyssimus è l'acaro della polvere di casa che agisce come un antigene e produce una reazione asmatica allergica in persona atopica.

Programma sperimentale

(A) Animali

[0116] Topi femmine BALB/c tra 4 e 6 settimane di età e che pesavano circa 20 g sono stati ottenuti dal Centro di Riproduzione Animale Nazionale, Repubblica Cinese, ed utilizzati negli studi. I topi avevano uguale età e uguale sesso in ciascun esperimento.

(B) Purificazione dell'allergene Der p 5 (allergene del gruppo 5 di Dermatophagoidespteronyssinus)

[0117] È stato utilizzato il plasmide pGEX-2T per esprimere Der p 5-glutatione S-transferasi (GST) in E.coli. Il peso molecolare della proteina di fusione era circa 42 kD.

   La proteina è stata purificata mediante cromatografia su colonna con gel di agarosio coniugato con glutatione. Una singola colonia del ceppo batterico positivo per Der p 5-GST è stata selezionata facendo crescere gli E.coli transfettati su brodo LB contenente ampicillina (100 Microg/ml). La colonia di E.coli positiva per Der p 5-GST è stata ulteriormente coltivata per produrre una quantità sostanziale di Der p 5-GST. Poi la coltura batterica è stata raccolta e centrifugata. Il surnatante è stato scartato ed il pellet è stato lavato con TBS (pH 7,5) e raccolto in una provetta per centrifugazione. Immediatamente dopo il lavaggio con TBS, è stato aggiunto fenilmetilsolfonil fluoruro 0,1 M al pellet, seguito dall'aggiunta di DNasi I, Tween 20, e lisozima. I pellet è stato lisato con il processo di congelamento e scongelamento per rilasciare la proteina Der p 5 + GST.

   Successivamente, al lisato cellulare è stata aggiunta EDTA ed esso è stato poi centrifugato. Il pellet è stato scartato, ed il surnatante è stato versato in una colonna di adsorbimento su gel di agarosio coniugato con glutatione in cui la proteina Der p 5-GST era adsorbita sulla colonna. La colonna è stata lavata prima con soluzione tampone TBS a 4 deg. C, e poi con glutatione ridotto in Tris-base (pH 8,0) per separare la Der p 5-GST dalla colonna di gel di agarosio. La purezza della proteina Der p 5-GST è stata confermata mediante SDS-PAGE.

   La quantità di proteina è stata misurata con metodi analitici tradizionali per le proteine.

(C) Sensibilizzazione degli animali

[0118] I topi BALB/c sono stati inizialmente sensibilizzati intraperitonealmente con 10 Microg di allergene del gruppo 5 di Dermatophagoides pteronyssimus ("Der p 5") e 4 mg di idrossido di alluminio (Wyeth Pharmaceuticals, Punchbowl, Australia). Sette (7) giorni dopo la prima sensibilizzazione, i topi, ad eccezione del gruppo di controllo placebo, sono stati alimentati con le composizioni a base di erbe STA-36 ed STA-4 fino alla fine del ventunesimo giorno.

[0119] Alla fine del ventunesimo giorno, ai topi è stata data una seconda iniezione di richiamo di Der p 5.

   Quarantotto (48) ore dopo la seconda iniezione di richiamo, i topi sono stati posti in un contenitore di plastica rotondo in cui i topi sono stati ulteriormente sensibilizzati con Der p 5 allo 0,1% in spray.

[0120] Diverse ore dopo la sensibilizzazione, il topo è stato anestetizzato utilizzando 100 mg/mi di fenobarbital. Il sangue è stato raccolto dalla vena della coda o dal cuore. Il sangue è stato lasciato sedimentare a temperatura ambiente per 1 ora e poi centrifugato a 1000 rpm per circa 10 minuti per raccogliere il siero, che è stato conservato a -80 deg. C per l'ELISA (vedere sotto) di IgE ed IgG2a. Il fluido raccolto dal lavaggio degli alveoli polmonari è stato centrifugato a 1000 rpm per 10 minuti. Il surnatante del fluido è stato utilizzato per l'analisi di citochine, interleuchina-4 (IL-4) e interferone-gamma  (IFN-gamma ).

   Il pellet del fluido (contenente le cellule) è stato ri-dissociato utilizzando PBS e passato a conta citospin per cellule infiammatorie.

(D) Determinazione ELISA di IgG ed IgE specifiche per Der p 5

[0121] La quantità di IgG ed IgE specifiche per Der p 5 è stata determinata mediante saggio immunoassorbente legato all'enzima ELISA. Piastre con micropozzetti ad elevato legame di proteine (Costar, n. 3590) sono state rivestite con 100 Microl (10 mg /ml) di Der p 5 purificato diluito in tampone di rivestimento (soluzione PBS contenente 3% di BSA, pH 7,4) ad una concentrazione di 5 Microg/ml. Dopo incubazione per tutta la notte a 4 deg. C, le piastre sono state lavate 3 volte in soluzione PBS, (pH 7,4) contenente Tween 20 allo 0,05% e bloccate con tampone BSA-PBS al 3% (p/v) per 2 ore a 25 deg.

   C.

[0122] I sieri sono stati utilizzati a una diluizione di 1:100 per la misurazione delle IgG ed a una diluizione di 1:10 per la misurazione delle IgE in duplicato. Dopo incubazione per tutta la notte a 4 deg. C, sono stati aggiunti per altre 2 ore o mAb monoclonale di ratto anti-IgE di topo coniugato con biotina (PharMinge, 02122D), o mAb di ratto anti-IgG di topo (PharMinge, 02022D) diluiti in tampone con gelatina allo 0,05%. Avidin-fosfatasi alcalina (1:1000) (Streptavidin-AP, PharMinge 13043E) è stata poi aggiunta ed incubata per 1 ora a 25 deg. C, seguita da sei (6) lavaggi. La reazione colorata è stata sviluppata con l'aggiunta di substrato della fosfatasi p-nitrofenil fosfato disodico (substrato di fosfatasi alcalina pNPP, Sigma N-2770). Le piastre sono state lette in un lettore automatico di micropiastre (lettore ELISA, Dynex MRX) a 405 nm.

   Le letture sono state riferite a standard isotipici commerciali che erano mAb di topo anti-TNP, IgG1 (107,3), IgG2a (G155-178), ed IgE (IgE-3).

(E) Determinazione ELISA di citochine (IL-4 e IFN-gamma )

[0123] Piastre con micropozzetti ad elevato legame di proteine (Costar, n. 3590) sono state rivestite con anticorpo purificato anti-citochina (per IL-4 sono stati utilizzati 2 Microg/ml di anticorpo IL-4 di PharMinge 18191D; per IFN-gamma / sono stati usati 3 Microg/ml di anticorpo IFN-gamma / PharMinge 18181D). Le piastre sono state rivestite con soluzione PBS contenente 3% BSA, pH 7,4 e poi lavate con soluzione PBS contenente Tween-20 0,05%, pH 7,4.

[0124] Cento (100) Microl di surnatante del fluido degli alveoli polmonari sono stati poi aggiunti ai micropozzetti, assieme a soluzione standard per citochina, per reazione per tutta la notte a 4 deg. C.

   Poi, ai micropozzetti sono stati aggiunti 100 Microl di biotina-anti-IL-4 di topo (PharMinge 18042D, 1 Microg/ml) oppure biotina-anti-IFN-gamma  di topo (PharMinge 18112D, 1 Microg/ml). Dopo due (2) ore di reazione, 100 Microl di avidina-fosfatasi alcalina (1:1000) (streptavidina-AP, PharMinge 13 043E) sono stati aggiunti ai pozzetti con vibrazione per 1 ora. Duecento (200) Microl di substrato di fosfatasi p-nitrofenilfosfato, disodico (substrato di fosfatasi alcalina pNPP, Sigma N-2770) sono stati aggiunti ai pozzetti per lo sviluppo del colore. Le piastre sono state lette in un lettore automatico di micropiastre (lettore ELISA, Dynex MRX) a 405 nm.

(F) Misurazione della funzione polmonare

[0125] Dopo iniezione e.v. di 100 mg/ml di fenobarbital al topo, un tubo PE 50 è stato inserito nella trachea.

   Il tubo è stato collegato ad un dispositivo per la rivelazione della pressione per misurare la variazione della pressione respiratoria durante l'inalazione e l'esalazione. Un altro tubo PE 50 è stato inserito nell'esofago per misurare la pressione esofagea come sostituto della pressione transpolmonare (TPP). Quando il segnale della pressione era trasmesso al Bio-recorder BR8000, il segnale era amplificato e convertito in volume respiratorio e pressione transpolmonare per calcolare la pressione nella trachea. Durante l'esperimento, un ago è stato mantenuto nella vena della coda per provvedere a un'iniezione di acetilcolina (Ach) in modo da indurre una variazione della pressione nella trachea.

4. Statistiche

[0126] Tutti i dati contenuti nell'esperimento sono stati calcolati come "media+-SEM".

   La variazione della resistenza Nella trachea indotta da acetilcolina dopo conversione in PC 100 è stata misurata come Microg/kg. La misurazione di IgE e IgG2a sono state presentate in base al valore di assorbimento ottico. Per determinare la significatività delle differenze tra i gruppi è stato utilizzato il test di student indipendente.

   Un p<0,05 era utilizzato per indicare una differenza statisticamente significativa.

Esempio 7

Effetti della estrazione acquosa delle erbe su IgG e IgE

[0127] Vari procedimenti di estrazione acquosa sono stati provati su ginseng americano e tridax lanterna per determinare la forma ottimale di estratto acquoso da utilizzare nella composizione a base di erbe.

[0128] Il ginseng americano in (1) polvere, (2) estratto in alcool al 95%, (3) estratto in acqua, e (4) estratto in alcool al 50% è stato analizzato per i suoi effetti medicinali sulla soppressione di IgE e IgG2a. Come mostrato in fig. 11, il ginseng americano estratto con alcool al 50% produceva il miglior effetto di soppressione di IgE, anche se il suo effetto sulla riduzione di IgG2a non era altrettanto buono di quello estratto in alcool al 95%.

   Poiché i disordini immunologici indotti da antigene erano principalmente malattie mediate da IgE, sembra che l'utilizzo di estrazione in alcool al 50% per il ginseng americano nella composizione a base di erbe fornisca il miglior risultato di riduzione di IgE per la composizione.

[0129] Tuttavia, quando i granuli prodotti dall'estratto in alcool di ginseng americano erano aggiunti al resto dei granuli, i granuli prodotti dall'estratto in acqua di ginseng americano fornivano effetti migliori sia sull'inibizione di IgE che sull'aumento di IgG. Quindi, nella composizione STA-4, il ginseng americano era estratto da acqua.

[0130] Tridax lanterna in (1) polvere, (2) estratto in alcool al 95%, (3) estratto in acqua, e (4) estratto in alcool al 50% è stato anche esso testato per i suoi effetti medicinali sulla soppressione di IgE, IgG2a, IL-4 e IFN-gamma .

   Come mostrato in fig. 12, tridax lanterna estratto con alcool al 50% produceva il miglior effetto di soppressione di IgE e di IgG2a, anche se l'estratto in acqua di tridax lanterna aveva dimostrato il miglior effetto soppressivo su IL-4 e IFN-gamma . Tuttavia, poiché l'estratto in acqua di tridax lanterna aveva indotto coagulazione del sangue in animali durante gli studi, esso non è stato considerato per l'uso in esseri umani.

Esempio 8

Confronto degli effetti di STA-36 ed STA-4 su IgE, IgG, IL-4, IFN-gamma  e funzioni polmonari

[0131] Uno studio comparativo tra gli effetti medicinali di composizioni a base di erbe di STA-36 ed STA-4 su IgG, IgE, IL-4 e IFN-gamma , ed anche sulle funzioni polmonari è stato condotto in animali sperimentali come descritto nell'esempio 3 (sopra).

   I risultati di questo studio erano mostrati nelle fig. 13-15.

[0132] La fig. 13 presentava uno studio comparativo degli effetti delle composizioni a base di erbe di STA-36 ed STA-4 su IgG e IgE in topi. Come mostrato nella fig. 13, entrambe le composizioni a base di erbe di STA-36 ed STA-4 hanno dimostrato la soppressione di IgE, confrontate con il controllo, con l'effetto di STA-4 molto maggiore di quello di STA-36. L'effetto inibitorio su IgE da parte di STA-4 era statisticamente significativo rispetto al controllo. Tuttavia, né STA-36 né STA-4 hanno dimostrato un effetto inibitorio su IgG. Infatti, al contrario, il livello di IgG aumentava in entrambi i gruppi di trattamento STA-36 ed STA-4, rispetto al controllo.

[0133] La fig. 14 mostrava gli effetti di STA-36 ed STA-4 sulle funzioni polmonari dei topi.

   Sia STA-36 sia STA-4 hanno mostrato un miglioramento significativo delle funzioni polmonari rispetto al controllo (p<0,05). Tra i due, STA-4 ha mostrato un miglioramento migliore delle funzioni polmonari rispetto a STA-36, anche se i valori di STA-4 ed STA-36 non erano significativamente differenti probabilmente a causa di un numero (n) insufficiente di animali in ciascun gruppo sperimentale.

[0134] La fig. 15 confrontava gli effetti di STA-4 con farmaci convenzionali per l'asma, cioè, chetotifen, prednisolone, e aminofilina, su IgE, IgG, IL-4 e IFN-gamma .

   I risultati hanno mostrato che solo STA-4 dimostrava una diminuzione significativa nelle IgE e un aumento significativo nelle IgG, IL-4 e IFN-gamma , suggerendo quindi che STA-4 possieda migliori effetti terapeutici nel trattamento dell'asma rispetto al chetotifen, prednisolone e aminofilina.

[0135] Anche i risultati nella fig. 15 suggeriscono che gli effetti terapeutici di STA-4 potrebbero essere differenti dal meccanismo convenzionale in cui il farmaco sopprimeva la sintesi di IL-4 che poi diminuiva indirettamente il livello di IgE. Nel caso presente, sia IL-4 sia IFN-gamma  sono aumentate dopo l'assorbimento di STA-4 cosicché la riduzione nelle IgE non era dovuta alla diminuzione di IL-4. Al contrario, la quantità di IFN-gamma , (prodotto e secreto da cellule TH1) è aumentata significativamente dopo il trattamento di STA-4.

   IFN-gamma  stimola le cellule B a sintetizzare e secernere IgG2a, il che spiegava come mai la quantità di IgG2a aumentasse durante il trattamento con STA-4. Pertanto, si presume che gli effetti di STA-4 derivino almeno parzialmente dalle IgG2a, che, in seguito al secondo contatto con gli allergeni interagivano con gli allergeni in modo da ridurre la reazione allergica.

Esempio 9

Test di tossicità delle composizioni a base di erbe di STA-36 e STA-4

[0136] Le composizioni a base di erbe sono state testate per la tossicità in base a uno studio di tossicità subacuta orale di 28 giorni in cui sono state determinate la mortalità, l'esame oftalmologico, i segni clinici e la necroscopia grossolana. I risultati erano presentati nelle tabelle 9-11:

[0137] Tabella 9.

   Mortaità di topi dopo asorbimento di STA-36 e STA-4
<tb><sep>Soluzione acquosa di
Tween-80 al 2%<sep>STA-36<sep>STA-4


  <tb>Dose (mg/kg/giorno<sep><sep>5000<sep>5000


  <tb>Sesso<sep>Maschio<sep>Maschio<sep>Maschio


  <tb>Numero di topi<sep>10<sep>10<sep>10


  <tb>Mortalità<sep>0/10<sep>0/10<sep>0/10

[0138] Tabella 10. Esame oftalmologico e segni clinici di topi dopo assorbimento di STA-36 e STA-4
<tb><sep>Soluzione acquosa di
Tween-80 al 2%<sep>STA-36<sep>STA-4


  <tb>Dose (mg/kg/giorno)<sep><sep>5000<sep>5000


  <tb>Sesso<sep>Maschio<sep>Maschio<sep>Maschio


  <tb>Numero di topi<sep>10<sep>10<sep>10


  <tb>Prima dell'inizio (giorno 0)<sep>0/10<sep>0/10<sep>0/10


  <tb>Prima della necroscopia (giorno 28)<sep>0/10<sep>0/10<sep>0/10


  <tb>Segni clinici<sep>0/10<sep>0/10<sep>0/10

[0139] Tabella 11. Necroscopia grossolana dopo assorbimento di STA-36 e STA-4
<tb><sep>Soluzione acquosa di
Tween-80 al 2%<sep>STA-36<sep>STA-4


  <tb>Dose (mg/kg/giorno)<sep><sep>5000<sep>5000


  <tb>Sesso<sep>Maschio<sep>Maschio<sep>Maschio


  <tb>Numero di topi<sep>10<sep>10<sep>10


  <tb>Organi anormali<sep>0/10<sep>0/10<sep>0/10

[0140] I risultati delle tabelle 9-11 dimostravano che sia STA-36 sia STA-4 non presentavano segni di tossicità subacuta nello studio.

[0141] Avendo descritto l'invenzione in dettaglio facendo riferimento alle forme di attuazione preferite, l'esperto del settore apprezzerà che sono possibili modificazioni e variazioni senza discostarsi dalla portata dell'invenzione come definita nelle rivendicazioni annesse che seguono.

Elenco delle sequenze

[0142] 
<110> : HSU, CHING-HSIANG SHEU, SHUENN-JYI
<120> : COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE A BASE DI ERBE PER IL TRATTAMENTO DI DISTURBI IMMUNOLOGICI
<130> : 33211-176057
<140> : NO
<141> :  NO
<160> : 4
<170> : MICROSOFT WORD
<210> :  1 
<211> :  21 
<212> : DNA
<213> : Sequenza Artificiale
<220> : 
<223> : Descrizione della Sequenza Artificiale; Primer
<400> :

    1
gaatgtacca ggagccatat o : 21
<210> : 2
<211> : 21 
<212> : DNA
<213> : Sequenza Artificiale
<220> : 
<223> : Descrizione della Sequenza Artificiale; Primer
<400> : 21
ctcagtacta cgagtaatcc a : 21
<210> : 3
<211> :  25 
<212> : DNA.
<213> : Sequenza Artificiale
<220> : 
<223> : Descrizione della Sequenza Artificiale: Primer
<400> : 3
gttggataca ggccagactt tgttg : 25
<210> : 4
<211> : 25
<212> : DNA
<213> : Sequenza artificiale
<220> : 
<223> : Descrizione della Sequenza Artificiale: Primer
<400> : 4
gattcaactt gcgctcatct taggc : 25

Claims (45)

1. Composizione farmaceutica per il trattamento di disordini immunologici comprendente una quantità efficace di: Tuber Ophiopogonis; Tuber Pinelliae; Radix Glycyrrhizae; e un'erba che è un'erba scelta dal gruppo che consiste di Herba Tridacis procumbentis, Herba Adenostemmatis, e Herba Houttuyniae.

2. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1, in cui detta erba è Herba Tridacis procumbentis.

3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, in cui Tuber Ophiopogonis è in un estratto acquoso, detto Tuber Pinelliae, detta Radix Glycyrrhizae e detta Herba Tridacis procumbentis sono in forma di polvere.

4. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, in cui Tuber Ophiopogonis, Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae e HerJba Tridacis procumbentis sono ad un rapporto in peso di 3:2:1:1.

5. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, comprendente ulteriormente una quantità efficace di Radix Codonopsitis.

6. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5, in cui detta Radix Codonopsitis è in forma di polvere.

7. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5, in cui detto Tuber Ophiopogonis, detto Tuber Pinelliae, detta Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis, e detta Radix Codonopsitis sono a un rapporto in peso di circa 3:2:1:1:1.

8. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, comprendente ulteriormente una quantità efficace di Radix Panacis Quinquefolii.

9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, in cui detta erba è detta Radix Panacis Quinquefolii in forma di polvere.

10. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, in cui detto Tuber Ophiopogonis, detto Tuber Pinelliae, detta Radix Glycyrrhizae, detta Herba Tridacis procumbentis e detta Radix Panacis Quinquefolii sono ad un rapporto in peso di 3:2:1:1:1.

11. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, in cui detto Tuber Ophiopogonis, detto Tuber Pinelliae, detta Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e detta Radix Panacis Quinquefolii sono in forma di estratto acquoso.

12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui ciascuno di detti estratti acquosi di Tuber Ophiopogonis, Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e Radix Panacis Quinquefolii è separatamente filtrato e condensato a formare ciascuno dei condensati di Tuber Ophiopogonis, Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e Radix Panacis Quinquefolii.

13. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, in cui ciascuno di detti condensati di Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e Radix Panacis Quinquefolii è separatamente granulato a formare granuli singoli; in cui detti granuli da Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e Radix Panacis Quinquefolii sono mescolati con detto condensato di Tuber Ophiopogonis a formare granuli misti.

14. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, in cui un eccipiente è aggiunto a ciascuno di detti condensati di Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Herba Tridacis procumbentis e Radix Panacis Quinquefolii prima della granulazione.

15. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 14, in cui detto eccipiente è amido di mais.

16. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui detto estratto acquoso di Tuber Ophiopogonis è un estratto in acqua di Tuber Ophiopogonis.

17. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui detto estratto acquoso di Tuber Pinelliae è un estratto in acqua di Tuber Pinelliae.

18. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui detto estratto acquoso di Radix Glycyrrhizae è un estratto in acqua di Radix Glycyrrhizae.

19. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui detto estratto acquoso di Herba Tridacis procumbentis è un estratto in alcool di Herba Tridacis procumbentis.

20. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, in cui detto estratto in alcool di Herba Tridacis procumbentis è un estratto in alcool al 50%.

21. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in cui detto estratto acquoso di Radix Panacis Quinquefolii è un estratto in acqua di Radix Panacis Quinquefolii.

22. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, in cui un tenore di solidi di detto condensato di Tuber Ophiopogonis è il 20-30% in peso di Tuber Ophiopogonis; un tenore di solidi di detto condensato di Tuber Pinelliae è il 15-20% in peso di Tuber Pinelliae; un tenore di solidi di detto condensato di Radix Glycyrrhizae è il 15-20% in peso di Radix Glycyrrhizae; un tenore di solidi di detto condensato di Radix Panacis Quinquefolii è il 19-29% in peso di Radix Panacis Quinquefolii, e un tenore di solidi di detto condensato di detta Herba Tridacis procumbentis è il 5-10% di Herba Tridacis procumbentis.

23. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, in cui detti granuli di Tuber Pinelliae è il 10-20% in peso di Tuber Pinelliae, detti granuli di Radix Glycyrrhizae il 2-10% di Radix Glycyrrhizae, detti granuli di Radix Panacis Quinquefolii è il 5-15% in peso di Radix Panacis Quinquefolii, e detti granuli di Herba Tridacis procumbentis è il 9-15% in peso di Herba Tridacis procumbentis.

24. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione farmaceutica è atta a trattare pazienti con disordini immunologici.

25. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 24, in cui detti disordini immunologici comprendono almeno un disordine scelto dal gruppo che consiste di rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica, eczema atopico, dermatite atopica, allergia alimentare, sindrome da iper IgE e artrite reumatoide.

26. Procedimento per preparare la composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 3, comprendente: macinare Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, e Herba Tridacis procumbentis per formare polveri di erbe; bollire Tuber Ophiopogonis in acqua per formare l'estratto acquoso di Tuber Ophiopogonis; mescolare dette polveri di erbe con detto estratto acquoso di Tuber Ophiopogonis per formare una miscela di erbe.

27. Procedimento secondo la rivendicazione 26, comprendente ulteriormente macinare Radix Codonopsitis per formare polvere di Radix Codonopsitis, e mescolare dette polveri di Radix Codonopsitis con detta miscela di erbe.

28. Procedimento secondo la rivendicazione 26, comprendente ulteriormente macinare Radix Panacis Quinquefolii per formare polveri di Radix Panacis Quinquefolii; e mescolare dette polveri di Radix Panacis Quinquefolii con detta miscela di erbe.

29. Procedimento secondo la rivendicazione 26, in cui detta miscela di erbe è granulata.

30. Procedimento secondo la rivendicazione 29, in cui detta miscela di erbe granulata è incapsulata.

31. Utilizzazione della composizione secondo la rivendicazione 2 per la preparazione di un medicamento atto a trattare pazienti con disordine immunologico.

32. Utilizzazione secondo la rivendicazione 31, in cui detto disordine immunologico è un disordine scelto dal gruppo che consiste di rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica, dermatite atopica, allergia alimentare, sindrome da iper IgE, eczema atopico e artrite reumatoide.

33. Farmaco per disordine immunologico comprendente una quantità efficace della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2.

34. Procedimento per la preparazione di una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 comprendente: estrarre Tuber Ophiopogonis in acqua mediante decottura; detto estratto in acqua di Tuber Ophiopogonis essendo filtrato e concentrato per formare un condensato di Tuber Ophiopogonis; estrarre Tuber Pinelliae in acqua mediante decottura; detto estratto in acqua di Tuber Pinelliae essendo filtrato e concentrato per formare un condensato di Tuber Pinelliae, detto condensato di Tuber Pinelliae essendo granulato mediante essiccazione a spruzzo; estrarre Radix Glycyrrhizae in acqua mediante decottura; detto estratto in acqua di Radix Glycyrrhizae essendo filtrato e concentrato per formare un condensato di Radix Glycyrrhizae; detto condensato di Radix Glycyrrhizae essendo granulato mediante essiccazione a spruzzo; estrarre Herba Tridacis procumbentis in alcool sotto riflusso;

detta Herba Tridacis procumbentis essendo filtrata e concentrata per formare un condensato di Herba Tridacis procumbentis; detto condensato di Herba Tridacis procumbentis essendo granulato mediante essiccazione a spruzzo; mescolare i granuli di Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae, Radix Panacis Quinquefolii e Herba Tridacis procumbentis ed il condensato di Tuber Ophiopogonis per formare granuli misti.

35. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui detto estratto in alcool di Herba Tridacis procumbentis è un estratto in alcool al 50%.

36. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui un eccipiente è aggiunto a ciascuno di detti condensati di Tuber Pinelliae, Radix Glycyrrhizae e Herba Tridacis procumbentis prima della granulazione.

37. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui detto eccipiente è amido di mais.

38. Procedimento secondo la rivendicazione 34, comprendente ulteriormente: estrarre Radix Panacis Quinquefolii in acqua mediante decottura; detto estratto in acqua di Radix Panacis Quinquefolii essendo filtrato e concentrato a formare un condensato di Radix Panacis Quinquefolii; detto condensato di Radix Panacis Quinquefolii essendo granulato mediante essiccazione a spruzzo; e mescolare detti granuli di detta Radix Panacis Quinquefolii con i granuli misti.

39. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui un tenore di solidi di detto condensato di detto Tuber Ophiopogonis è il 20-30% in peso di detto Tuber Ophiopogonis; un tenore di solidi di detto condensato di detto Tuber Pinelliae è il 15-25% in peso di detto Tuber Pinelliae; un tenore di solidi di detto condensato di detta Radix Glycyrrhizae è il 15-25% in peso di detta Radix Glycyrrhizae; un tenore di solidi di detto condensato di detta Radix Panacis Quinquefolii è il 20-30% in peso di detta Radix Panacis Quinquefolii; e un tenore di solidi di detto condensato di detta Herba Tridacis procumbentis è il 5-10% in peso di detta Herba Tridacis procumbentis.

40. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui detti granuli di Tuber Pinelliae è il 10-20% in peso di detto Tuber Pinelliae, detti granuli di detta Radix Glycyrrhizae il 2-10% di detta Radix Glycyrrhizae, detti granuli di detta Radix Panacis Quinquefolii è il 5-15% in peso di detta Radix Panacis Quinquefolii, e detti granuli di detta Herba Tridacis procumbentis è il 9-15% in peso di detta Herba Tridacis procumbentis.

41. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui ciascuno di detti condensati è condensato mediante condensazione in decompressione a una temperatura di circa 55 deg. C e un vuoto di circa 30 torr, ovvero 4000 Pa.

42. Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui ciascuno di detti condensati è essiccato a spruzzo ad una temperatura di ingresso di circa 105 deg. C e una temperatura di uscita di 76-77 deg. C.

43. Utilizzazione della composizione secondo la rivendicazione 11, per la preparazione di un medicamento atto a trattare i pazienti con disordine immunologico.

44. Utilizzazione secondo la rivendicazione 43, in cui detto disordine immunologico è un disordine scelto dal gruppo che consiste di rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica, dermatite atopica, allergia alimentare, sindrome da iper IgE, eczema atopico, e artrite reumatoide.

45. Farmaco per disordine immunologico comprendente una quantità efficace della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11.