CN104804007B - 一种南极真菌呈色化合物 - Google Patents

Abstract

一种南极真菌呈色化合物，属于微生物领域，所述化合物的分子式为C₂₃H₂₃NO₅，结构式如下：所述化合物在食品中的应用。上述化合物结构明确，色价高，着色能力好，安全性高，甚至具有抗氧化保健功能，可作为食品添加剂应用于食品行业。

Description

一种南极真菌呈色化合物

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地涉及一种南极真菌呈色化合物。

背景技术

“色、香、味”自古以来就是食物好坏的重要判定标准。人们在选择食品时，常常将色泽与食品的风味联系在一起，因此，食物的颜色逐渐成为推进食品工业化的重要因素之一。进而，食用色素作为一种重要的食品添加剂受到人们越来越多的关注。

食用色素分为化学合成色素和天然色素两大类。合成色素因为具有颜色鲜艳、着色力强、性质稳定、成本低廉、使用方便等优点，迅速得到了广泛的关注与应用。然而合成色素大多是煤焦油或苯胺色素，不仅没有任何营养价值，而且绝大部分对人体有危害(如致畸性、致癌性)。随着对合成色素负面报道的增多，人们对含有合成色素的产品产生了抵触心理。同时各国纷纷出台政策，禁止和限制了合成色素的使用。这种情况下，开发研制天然色素，利用天然色素代替人工合成色素己经成为食品行业的发展趋势。

天然食用色素是从天然原料中提取获得的，在食品行业可作为一种食品添加剂用于果汁、汽水、酒、糖果、糕点、冷饮等食品的着色，在医药行业用于药片糖外衣、胶囊等的着色，也可用于日用化工产品和化妆品的着色。

天然色素用于食品着色有以下优点：

1)天然色素来源于动植物、微生物等天然材料，安全性较高，且易于被消费者接受；

2)是自然界本身存在的的颜色，因此它们着色时色调比较自然，使食品具有更好的自然新鲜度。

3)有些天然色素本身就是人体需要的营养物质，还有些天然色素对人体有一定的保健作用。

目前大部分国内许可使用的天然色素是从植物中提取得到，然而，这些天然色素远远不能满足现实的需求，急待我们去开发新型色素资源。我国大型真菌资源丰富，尤其某些大型真菌中色素含量较高，再加上某些色素种类兼具有营养和药理活性，极具有开发潜力。

然而，天然色素也存在一些安全隐患:一是有些天然食用色素的成分、化学结构并不明晰，可能存在毒性；二是在天然色素的萃取、纯化过程中，使用了化学合成原料，这些化学原料也会对天然色素的结构和安全性产生一定的负面影响。

真菌发酵液中色素多为混合物成分复杂，结构不明。其中的微量成分的理化性质难以确定，如果直接应用于食品领域存在安全隐患。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种南极真菌色素呈色化合物，本发明利用自南极土壤分离的真菌Geomyces sp.wnf-15A(phy)生产色素，将大孔树脂层析技术加入色素生产过程中，获得了较好的分离纯化效果。另外，纯化精制后的色素色价提高、吸收峰长移，有效的提高了真菌色素产量和着色能力。本发明中所应用菌株Geomyces sp.wnf-15A(phy)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2012年6月28日，保藏号CCTCC NO:M2012255。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种南极真菌呈色化合物，所述化合物的分子式为C₂₃H₂₃NO₅，结构式如下：

进一步，所述化合物的制备方法，具体步骤如下：

①预处理大孔吸附树脂：95％(体积比)以上的乙醇浸渍4小时，然后用蒸馏水淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止，然后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味即可；

②制备马铃薯液体培养基：200g去皮马铃薯，切成块状，加入去离子水，煮沸30min，四层纱布过滤，滤液加入10g无水葡萄糖，补充去离子水至1000ml，将溶液转入发酵罐，115℃，30min灭菌获得马铃薯液体培养基；

制备真菌种子液：用无菌水洗刮真菌Geomyces sp.wnf-15A(phy)单菌落，含有菌落的洗刮水转入马铃薯液体培养基中，培养3-4d，作为真菌种子液；

④将真菌种子液接入发酵罐中，发酵条件：125r/min，10℃培养10d；

⑤发酵液离心后用大孔树脂吸附，将大孔吸附树脂装柱洗脱：用去离子水洗至洗脱液为无色，改用95％(体积比)乙醇水溶液洗脱至无色，再用去离子水洗至无乙醇味，收集洗脱液；

⑥洗脱液浓缩，冻干，得色素粗粉，色素粗粉溶解后上HPD-600大孔树脂层析柱，对洗脱液冻干，得到呈色化合物。

本发明还提供一种上述化合物在食品中的应用。上述化合物结构明确，色价高，着色能力好，安全性高，甚至具有抗氧化保健功能，可作为食品添加剂应用于食品行业。

本发明还提供一种利用上述呈色化合物制备的食品添加剂。

本发明还提供一种利用上述呈色化合物制备的食品。

上述化合物在化妆品中的应用。实验证明上述化合物具有清除氧自由基功能。研究发现，氧自由基与衰老、肿瘤、炎症、动脉硬化等发生密切相关。上述化合物由于能清除人体的这些自由基而具有预防疾病和抗衰老的作用，因此可做为着色剂，应用于化妆品行业。

因此，本发明还提供一种应用上述色素制备的化妆品。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明实现了真菌色素呈色成分的分离纯化和结构鉴定，解决了真菌色素成分复杂，结构不明的难题。且纯化后的呈色化合物色价可以达到200，与色素粗粉色价140相比提高43％；最大吸收波长550nm,与色素粗粉最大吸收波长533相比波长红移，即着色能力增强，提高了真菌色素的质量，具有工艺简单，分离效果好的特点。通过毒理学研究发现，其安全无毒。另外其不具有抗菌活性，说明其进入人体后不会破坏消化系统原始菌落，进一步说明其安全性高。同时通过研究发现其具有一定抗氧化活性，并且与色素混合物相比，抗氧化活性明显提高，证明具有预防疾病和抗衰老功能。综上所述，南极真菌呈色化合物作为一种新的产品应用于食药及化妆品行业具有很大的优势。

附图说明

图1为利用大孔吸附树脂纯化制备南极真菌呈色化合物的工艺流程图；

图2为大孔吸附树脂纯化制备所得呈色化合物QDSS-P1的HPLC图谱。

图3为呈色化合物清除超氧阴离子自由基能力测定结果；

图4为呈色化合物清除羟基自由基能力测定结果。

菌株Geomyces sp.wnf-15A(phy)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2012年6月28日，保藏号CCTCC NO:M2012255。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步的解释，但本发明的保护范围不受实例任何形式上的限制。

实施例1南极真菌呈色化合物的制备

一种南极真菌呈色化合物的制备方法，如图1所示，具体步骤如下：

(1)色素粗粉的制备

①预处理大孔吸附树脂：95％以上的乙醇浸渍4小时，然后用蒸馏水淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止，然后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味即可；

②制备马铃薯液体培养基：200g去皮马铃薯，切成块状，加入去离子水，煮沸30min，四层纱布过滤，滤液加入10g无水葡萄糖，补充去离子水至1000ml，将溶液转入发酵罐，115℃，30min灭菌获得马铃薯液体培养基；

③制备真菌种子液：用无菌水洗刮真菌WNF-15A Geomyce单菌落，含有菌落的洗刮水转入马铃薯液体培养基中，培养3-4d，作为真菌种子液；

④将真菌种子液接入发酵罐中，发酵：125r/min，10℃培养10d；

⑤发酵液离心后用大孔树脂吸附，将大孔吸附树脂装柱洗脱：用去离子水洗至洗脱液为无色，改用95％乙醇水溶液洗脱至无色，再用去离子水洗至无乙醇味，收集洗脱液；

⑥洗脱液浓缩，冻干，得色素粗粉。

(2)预处理HPD-600型及HP-20大孔吸附树脂，装柱备用；

①HPD-600型大孔树脂的预处理：树脂经2％NaOH浸泡、洗脱后，再用95％乙醇水溶液浸泡、洗脱，然后用蒸馏水淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止，然后用水反复洗涤至洗脱液乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味即可；

②HP-20型大孔树脂的预处理：通过95％乙醇水溶液与水交替反复洗脱，洗脱溶剂用量为树脂体积的2—3倍，交替洗脱2—3次，最终以水洗脱后，保持分离使用前的状态。

(3)色素粗粉用水充分溶解后，备用；

(4)色素水溶液上HPD-600大孔树脂层析柱，65％乙醇水溶液-水洗脱；洗脱液上HP-20大孔树脂层析柱，70％乙醇水溶液水洗脱，得到洗脱液QDSS-DK1-8；

(5)洗脱液冻干、60％甲醇-水溶液溶解，60％乙腈水溶液-水恒梯度洗脱进行HPLC色谱分析检测，如图2所示，色谱峰为单峰，峰型较好，则进行下一步骤，否则再过HP-20大孔树脂，直到其达到制备要求。

(6)达到制备要求的冻干洗脱液，用50％甲醇-水溶液溶解，上制备色谱，纯化精制得到天然色素呈色化合物QDSS-P1。

(7)通过UV、ESI-MS、HRESI-MS、¹HNMR、¹³CNMR等技术对QDSS-P1进行结构鉴定，根据在scifinder里查询结果，发现其为一种新化合物，分子式为C₂₃H₂₃NO₅，结构式如下所示。

实施例2呈色化合物C₂₃H₂₃NO₅极性毒性研究

(1)预实验

选用KM小鼠20只，禁食、不禁水12小时。把C₂₃H₂₃NO₅制成最大浓度的混悬液，160mg/ml配置。每只小鼠每次灌胃约为0.4ml/10g(体重)，每隔6小时连续灌胃3次。然后按常规饲养，并观察小鼠的毒性反应情况(外观、行为活动、呼吸、分泌物、排便、死亡等)，且连续称重7d。结果以最大给药浓度，最大给药容量灌胃，均未出现毒性反应。根究《GB15193-2003急性毒性试验》中的有关规定，选用“最大耐受剂量法”进行急毒实验。

(2)最大耐受剂量实验

试验组：健康KM小鼠30只，雌雄各半，禁食12h，不限饮水。称重(体重18-22g左右),随机分成两组，每组15只，以小鼠经口最大给药浓度160mg/ml，最大给药容积0.4ml/10g(体重)药量灌胃，连续给药3次(每次间隔6h)。

对照组：健康小鼠15只，雌雄各半，以等量给水灌胃对照。

灌胃后，按常规喂养，观察14d内小鼠的外观、饮食、活动、排泄、死亡及出现的症状等情况。实验结束后以颈椎脱臼法处死小鼠，解剖后观察其重要脏器心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等的变化。

(3)统计学方法

所获得的各组数据采用SPSS软件进行统计处理，各组数据均用表示。

(4)试验结果

结果显示，呈色化合物C₂₃H₂₃NO₅最大耐受剂量可达到128mg/20g(体重)，说明其安全无毒。

实施例3呈色化合物C₂₃H₂₃NO₅抗氧化性能力测定

(1)清除超氧阴离子自由基能力的测定：分别取浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL的C₂₃H₂₃NO₅水溶液0.1mL。加入pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液3mL，25℃条件下保温20min，加入7mmol/L的邻苯三酚0.3mL，反应4min后加入10mol/LHCl溶液1mL终止反应。最后用蒸馏水调零，测定吸光值A₄₂₀，按下式计算清除率。

式中：A₀为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液；A₁为样品组吸光度；A₂色素溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂。

将C₂₃H₂₃NO₅水溶液，换成南极红色素粗粉、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC按上述方法做清除超氧阴离子自由基能力对比试验。

(2)清除羟基自由基能力的测定

分别取浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL的C₂₃H₂₃NO₅水溶液2mL，加入9mmol/L FeSO₄1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，混匀后，加入8.8mmol/L H₂O₂启动反应，室温下反应1h。蒸馏水调零，测定吸光值A₅₁₀，按下式计算清除率。

式中：A₀为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液；A₁为样品组吸光度；A₂色素溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂。

将C₂₃H₂₃NO₅水溶液，换成南极红色素粗粉、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC按上述方法做清除超氧阴离子自由基能力对比试验(结果如图3和图4所示)。

试验结果显示，呈色化合物C₂₃H₂₃NO₅色价高，着色能力强，安全无毒并具有清除氧自由基(包括超氧阴离子自由基、羟基自由基)活性，尤其与其他色素混合物相比，其活性明显提高。说明其作为添加剂用作食药及化妆品行业，安全有效且具有一定的抗氧化保健功能。

Claims (4)

1.一种南极真菌呈色化合物，其特征在于所述化合物的分子式为C₂₃H₂₃NO₅，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于步骤如下：

①预处理大孔吸附树脂：体积比95％以上的乙醇浸渍4小时，然后用蒸馏水淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止，然后用水反复洗涤至乙醇含量小于体积比1％或无明显乙醇气味；

②制备马铃薯液体培养基：200g去皮马铃薯，切成块状，加入去离子水，煮沸30min，四层纱布过滤，滤液加入10g无水葡萄糖，补充去离子水至1000ml，将溶液转入发酵罐，115℃，30min灭菌获得马铃薯液体培养基；

③制备真菌种子液：用无菌水洗刮真菌Geomyces sp.wnf-15A(phy)单菌落，含有菌落的洗刮水转入马铃薯液体培养基中，培养3-4d，作为真菌种子液，所述真菌Geomycessp.wnf-15A(phy)的保藏号CCTCC NO:M2012255；

④将真菌种子液接入发酵罐中，发酵条件：125r/min，10℃培养10d；

⑤发酵液离心后用大孔树脂吸附，将大孔吸附树脂装柱洗脱：用去离子水洗至洗脱液为无色，改用体积比95％乙醇水溶液洗脱至无色，再用去离子水洗至无乙醇味，收集洗脱液；

⑥洗脱液浓缩，冻干，得色素粗粉，色素粗粉溶解后上HPD-600大孔树脂层析柱进行洗脱，冻干洗脱液，得到呈色化合物。

3.一种利用权利要求1所述呈色化合物制备的食品添加剂。

4.一种权利要求1所述呈色化合物在化妆品中的应用。