CN101410371A - 类胡萝卜素的制造方法 - Google Patents

Abstract

一种类胡萝卜素含量为80％以上的组合物的制造方法，以及含该含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品，所述方法是将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或它们的干燥物用选自低级醇类、含水低级醇类、低级二烷基酮类及醚类的至少1种提取后，将浓缩提取液所得沉淀物用选自低级醇类、含水低级醇类、烃类溶剂类以及低级二烷基酮的至少1种洗涤。

Description

类胡萝卜素的制造方法

技术领域

本发明涉及类胡萝卜素的制备方法，特别是适于工业生产的虾青素的制备方法，虾青素是用于食品、医药组合物或化妆品的成分。此外，本发明还涉及采用上述方法得到的含类胡萝卜素组合物，以及包含该含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。

背景技术

类胡萝卜素是自然界广泛存在的天然色素，是显现由黄色到红色或紫色的各种颜色的多烯色素。虾青素是发现的天然类胡萝卜素的1种，其除了以游离状态或酯的形式存在外，还与蛋白质结合以各种色素蛋白质的形式存在。

虾青素作为鱼类、鸡蛋的提色剂而广泛使用。此外，其还作为食品添加剂使用，广泛用于油脂加工食品、蛋白质性食品、水性液态食品等。而且，由于虾青素具有对抗自由基引发脂质过氧化的抗氧化活性，其单线态氧消除作用达α-生育酚的数百倍等，因此虾青素作为可产生强抗氧化活性的功能性食品、化妆品、或医药品的用途倍受期待。

虾青素不仅广泛分布于自然界，例如大马哈鱼、鳟鱼、加级鱼等鱼类，蟹、虾、磷虾等甲壳类等，而且也可由属于土壤杆菌属、短杆菌属、副球菌属的细菌类，红球藻属(Haematococcus)绿藻类、法夫(Phaffia)属酵母类等微生物产生。虾青素、玉米黄素等类胡萝卜素可通过化学合成法进行工业生产，但由于安全性差，需寻找天然来源的类胡萝卜素。

在该情况下，报道了很多关于适于大量生产含有藻类、微生物来源虾青素的类胡萝卜素类的制造方法。

例如，有报道：关于红球藻藻类，用热丙酮处理培养后的藻类胞囊细胞，使污染物叶绿素溶出后、将该胞囊细胞喷雾干燥，用乙醇从所得干燥细胞提取类胡萝卜素的方法(文献1)等。但是利用这些制造方法所得的组合物中仍含有大量生物来源的污染物，在1)类胡萝卜素的含量、2)虾青素的含量等方面不能达到要求。

为了得到虾青素含量高的组合物，报道了对于依上述方法将所得的粗品胡萝卜醇，在水存在下利用脂肪酶的作用分解污染物之一的中性脂质，对该脂肪酶酶处理液进行油水分离，然后从分离所得油层中蒸馏出游离脂肪酸，从而使其与虾青素分离，这样来进行浓缩纯化的方法(文献2)等。但是，即便经过如此复杂的处理步骤，所得制品的虾青素含量仍然不超过30％。

此外，还报道了用超临界流体提取法得到0.5～60％含量虾青素的方法(文献3)，但必须将同时作为副产物生成的、未达目的含量的虾青素级分丢弃或为了提高含量而再进行浓缩操作。因此，从简便性和经济性的角度考虑，本制造方法也不满足作为制造高含量含有生物来源污染物少的虾青素的高纯度类胡萝卜素的工业方法的要求。

此外，作为使用法夫属酵母的方法，还报道了下述方法：用有机溶剂提取该酵母的破碎菌体，将提取液浓缩得到的油状粗提取物用离子交换色谱、吸附色谱等进行纯化，从而得到虾青素(文献4)，是对低浓度的虾青素粗液多次进行柱色谱纯化，这并非工业方法。

此外，作为其它方法，还报道了下述制造方法：用丙酮提取法夫属酵母培养后的菌体，将所得提取液浓缩，向得到的粗油状物中加入烃类溶剂，使晶体析出(文献5)。该制造方法简便性好，但所得组合物类胡萝卜素含量只有70～73％左右(虾青素含量为36～42％)，不能满足作为生物来源污染物少的高纯度类胡萝卜素的制造方法的要求，而且类胡萝卜素中残留有丙酮及烃类溶剂，具有危险性，该方面也不满足要求。

另一方面，还报道了如下方法：对于虾青素、金盏花黄质等的生产菌株E-396株(FERM BP-4283：1993年4月27日保藏(原生物保藏日)，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6))，用从安全性角度考虑用于食品制造具有一定危险性的环状亲水性有机化合物与菌体接触而进行提取(文献6)，或与文献3相同用超临界流体提取(文献7)。进而还报道了下述方法：使E-396株与水溶性有机溶剂、非极性溶剂以及水接触，进行液液提取(文献8)。

基于上述情况，迫切需要寻找一种工业制造以高含量含有虾青素的高纯度类胡萝卜素的方法，所述方法利用食品制造上安全的溶剂，且是无需特殊设备或复杂操作等的简便方法。

参考文献

文献1：特开平11-56346号公报

文献2：特开2002-218994号公报

文献3：特开2004-41147号公报

文献4：特开平10-276721号公报

文献5：特开2004-208504号公报

文献6：特开平7-242621号公报

文献7：特开平8-89280号公报

文献8：特开平8-253695号公报

发明内容

本发明的目的在于提供以高含量含有高纯度类胡萝卜素的、并且使用了廉价且安全的溶剂的组合物及其工业制造方法，进一步提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

为了解决上述问题，本发明者对微生物培养物进行研究，结果发现，试图采用现有技术的液液提取法得到高纯度类胡萝卜素，存在如下问题：1)操作步骤中使用的溶液很多，因此在工业上是没有效率的，这与以往的在低浓度溶液状态下进行高纯度化精制的技术相同；2)必须进行包括对混合有机溶剂进行分级操作的溶剂回收，致使简便性低；3)使用的溶剂残留于制品中，安全性差。为解决这些问题，本发明者进行了潜心研究，结果发现：将含有类胡萝卜素的微生物培养物、其浓缩物或它们的干燥物用低级醇类提取后，通过用含水低级醇类与烃类溶剂类的组合溶剂或含水低级醇类洗涤浓缩提取液所得沉淀物，可得到高纯度类胡萝卜素组合物，从而完成了本发明。

此外，还发现将微生物培养物用低级二烷基酮类及醚类中的至少一种提取后，通过将浓缩提取液所得沉淀物用低级醇类以及低级二烷基酮类中的至少1种或它们的混合液洗涤，可得到高纯度类胡萝卜素组合物，从而完成本发明。

即，本发明包括以下方案。

(1)包括以下1)～3)步骤的含类胡萝卜素组合物的制造方法：

1)将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物用选自低级醇类、含水低级醇类、低级二烷基酮类及醚类中的至少1种进行提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)将沉淀物用选自低级醇类、含水低级醇类、烃类溶剂类以及低级二烷基酮类中的至少1种洗涤的步骤。

(2)包括以下1)～3)步骤的含类胡萝卜素组合物的制造方法：

1)将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物用乙醇或丙酮提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇、含水乙醇或丙酮洗涤沉淀物的步骤。

(3)包括以下1)～3)步骤的含类胡萝卜素组合物的制造方法：

1)将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物用乙醇提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用含水乙醇洗涤沉淀物的步骤。

(4)包括以下1)～3)步骤的含类胡萝卜素组合物的制造方法。

1)将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或其干燥物用丙酮提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇洗涤沉淀物的步骤。

(5)包括以下1)～3)步骤的含类胡萝卜素组合物的制造方法：

1)将微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物用丙酮提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇洗涤沉淀物的步骤。

(6)上述(1)～(5)中任1项的含类胡萝卜素组合物的制造方法，其还包括下述的一个步骤：

4)将步骤3)所得沉淀物用己烷进一步洗涤的步骤。

(7)(1)～(6)中任1项的制造方法，其中，含类胡萝卜素组合物为含有80％以上的类胡萝卜素的组合物。

(8)(1)～(7)中任1项的制造方法，其中，类胡萝卜素为含有40％以上的虾青素的类胡萝卜素。

(9)(1)～(8)中任1项的制造方法，其中，与微生物的16S核糖体RNA对应的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源。

(10)(1)～(9)中任1项的类胡萝卜素制造方法，其中，微生物为E-396株(FERM BP-4283)或其变异株。

(11)含有采用上述(1)～(10)中任1项的制造方法所得的类胡萝卜素的组合物。

(12)含有上述(11)的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。

通过本发明，能够提供高含量地含有天然物来源的、高纯度的、廉价且安全的类胡萝卜素的组合物及其工业制造方法，进一步能够提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

发明的具体实施方式

以下，对本申请发明进行具体说明。但本发明的范围并不限于该说明，在不影响本发明主旨的范围内，除下述示例外，还可进行适当变化实施。

此外，本说明书包含作为本申请优先权基础的特愿2006-87223号以及特愿2006-149794号说明书的全部。此外，本说明书以引用的全部出版物，例如现有技术文献、公开公报、专利公报以及其它专利文献作为参考并入本说明书中。

本发明涉及类胡萝卜素的制造方法，该方法的特征是：将微生物培养物等(例如含有类胡萝卜素的微生物培养物等)，用选自低级醇类、含水低级醇类、低级二烷基酮类及低级二烷基醚类中的至少1种提取后，将浓缩提取液所得的沉淀物用选自低级醇类、含水低级醇类、烃类溶剂类以及低级二烷基酮类中的至少1种洗涤。本发明的方法可以得到类胡萝卜素含量为80％以上、优选类胡萝卜素含量为90％以上的组合物，所述类胡萝卜素的生物来源污染物少，而且除低级醇类外的有机溶剂含量极少，而且含有虾青素。

作为可用于本发明的微生物，只要是生产类胡萝卜素类的微生物即可，没有特别限定，可以使用副球菌属细菌、红球藻属藻类、法夫属酵母等。从增殖速度、类胡萝卜素类的生产性考虑，特别优选与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列与序列表中SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源的细菌。

考虑到DNA碱基序列测定的错误频率、微生物中的自然变异等，所述基本上同源是指序列具有94％以上、优选96％以上、更优选98％以上的相源性。这样的细菌中特别优选E-396菌株(FERM BP-4283)。此外，作为特别合适的例子，可以列举出使用下述菌株：所述菌株为对这些微生物进行变异处理并以类胡萝卜素生产性提高为目标进行选择而得到的类胡萝卜素高生产株(高生産株)。

此外，E-396菌株如下述国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

国际生物保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心

(旧名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)

305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6

识别标识：E-396

生物保藏号：FERM BP-4283

原保藏日：平成5年(1993年)4月27日

此处的变异处理方法只要是诱发突变的方法即可没有特别的限制。例如，可以采用：利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、乙基甲烷磺酸盐(EMS)等变异剂的化学方法，紫外线照射、X线照射等物理方法，利用基因重组、转座子等的生物学方法等。可以只进行一次这样的变异处理，此外，也可以进行2次以上的变异处理，例如，经该突变处理得到虾青素生产微生物的变异体，然后对其再进行突变处理。

本发明使用的微生物培养物等，只要是采用能够高效率培养上述微生物的方法得到的培养物即可，没有特别的限制，所述能够高效率培养上述微生物的方法例如：使用下述培养基，利用液体培养、固体培养或它们的组合进行培养的方法。

作为本发明使用的用于微生物培养的营养培养基，只要是含有生产菌生长繁殖所必需的碳源、氮源以及无机盐的营养培养基即可，有时更优选添加维生素类。此外，有时更优选添加氨基酸、核酸碱基等。另外，也可以适当添加酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液、干燥酵母、大豆饼等。

作为碳源，可以举例出：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖等糖类，醋酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸、丙酮酸等有机酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇、甘油等醇类，大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油、亚麻仁油等油脂类等，可以使用1种或2种以上碳源。添加比例因碳源种类而不同，可以进行适当调整，通常为每1L培养基添加1～100g，优选2～50g。

氮源可以使用例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、氨气、尿素等中的1种或2种以上。添加比例因氮源种类而不同，可以进行适当调整，通常为每1L培养基添加0.1g～30g，优选1～10g。

无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠等中的1种或2种以上。添加比例因无机盐的种类而不同，可以进行适当调整，通常为每1L培养基添加0.001～10g。

关于添加维生素类时的添加量，添加比例因维生素类的种类而不同，可以进行适当调整，通常为每1L培养基添加0.1～1000mg，优选1～100mg。

氨基酸、核酸碱基、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液、干燥酵母、大豆饼等的添加比例因物质的种类而不同，可以进行适当调整，通常为每1L培养基添加0.2g～200g，优选3～100g。

培养基的pH调整为2～12，优选6～9。培养条件为15～80℃，优选20～35℃的温度，通常培养1日～20日，优选2～8日，在需氧条件下进行培养。需氧条件例如振荡培养或通气搅拌培养等。

提取本发明所用培养微生物产生的虾青素时，作为更合适的例子，可以列举出下述方法：培养后，采用膜过滤浓缩的方法处理培养液从而得到菌体浓缩液，或者采用离心分离、加压或减压过滤等通常已知的过滤方法处理培养液从而得到湿菌体，利用喷雾干燥、流动干燥、旋转鼓干燥或冷冻干燥等通常已知的干燥方法处理所得的菌体浓缩液或湿菌体，再将所得的干燥菌体用于以下的提取。此外，进行以下提取前，在培养液、菌体浓缩液、湿菌体或干燥菌体阶段，也可进行下述处理中的1种或2种以上处理，所述处理包括：使用碱性试剂、表面活性剂等的化学处理，使用溶菌酶、脂质分解酶以及蛋白质分解酶等的生物化学处理，或者超音波、粉碎等物理处理。此外，当为干燥菌体时，1g该干燥菌体中，通常含有约20mg左右虾青素。

作为从本发明使用的培养微生物(微生物的培养物)、培养物的浓缩物、或它们的干燥物(本说明书中称为“培养微生物等”或“微生物培养物等”)中进行提取时使用的溶剂(以下称为提取溶剂)，可以举例出：选自低级醇类、低级二烷基酮类及醚类中的任意1种或它们的组合。

低级醇类优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，更优选乙醇、异丙醇，特别优选乙醇。

提取时溶剂的温度优选0℃～所用溶剂的沸点，更优选比所用溶剂的沸点低20℃左右的温度附近。当为乙醇时，优选25℃～60℃，更优选40℃～55℃，特别优选45℃～52℃。关于提取溶剂的量，只要是能够溶解菌体中含有的虾青素量的量即可，例如，用乙醇从干燥菌体中提取时，对于菌体中含有的1g虾青素，使用乙醇1～90kg，优选6～20kg。

例如，当使用50℃的乙醇从由上述本发明所用培养微生物等得到的含有约20mg虾青素的1g干燥菌体中进行提取时，可使用70g～1800g左右、优选150g～700g左右、更优选250g～500g左右量的乙醇。

此外，使用低级二烷基酮类或醚类作为提取溶剂时，优选例如丙酮、甲基乙基酮或四氢呋喃，更优选丙酮或四氢呋喃，特别优选丙酮。

与上述相同，提取时溶剂的温度优选0℃～所用溶剂的沸点，更优选比所用溶剂的沸点低5℃左右的温度附近。使用丙酮时，优选25℃～55℃，更优选40℃～55℃，进一步优选45℃～52℃。提取溶剂的量只要为能够溶解菌体中含有的虾青素量的量即可，例如，用丙酮从干燥菌体中提取时，相对于菌体中含有的1g虾青素，使用丙酮0.2～18kg，优选0.9～3kg。

例如，当使用50℃的丙酮从由上述本发明使用的培养微生物等得到的含有约20mg虾青素的1g干燥菌体中进行提取时，可以使用7g～180g左右、优选15g～70g左右、更优选25g～50g左右量的丙酮。

需要在提取操作中尽量防止类胡萝卜素氧化时，可以在氮气等非活性气氛下处理，此外，也可以选择医药品、食品用抗氧化剂加入提取溶剂中进行处理，或组合使用这些处理。

优选最终将上述抗氧化剂从类胡萝卜素组合物中除去，但根据使用的抗氧化剂种类的不同，有些不需除去。

此外，关于提取时间，无需特别限制，但在室温以上提取时，为了减少因热分解引起的产额降低的问题，优选短时间处理。例如，用50℃的乙醇提取时，优选12小时以内，更优选8小时以内，进一步优选6小时以内，特别优选4小时以内，最优选3小时以内。此外，用50℃的丙酮提取时，优选12小时以内，更优选6小时以内，进一步优选3小时以内，特别优选2小时以内，最优选1小时以内。

作为对使用低级醇类提取微生物培养物等得到的提取液进行浓缩的方法，可以举例出：加热和/或减压浓缩。此外，为了尽量防止浓缩时类胡萝卜素的氧化，可以在氮气等非活性气氛下进行。作为浓缩程度，可以根据所得沉淀物的量和纯度而适当确定，例如，提取液在其重量方面可以浓缩10倍～1000倍，优选30倍～500倍，进一步优选50倍～400倍，特别优选100倍～200倍。

作为对使用低级二烷基酮类及醚类中的至少一种提取培养微生物等得到的提取液进行浓缩的方法，与上述相同，可以举例出：加热和/或减压浓缩。此外，为了尽量防止浓缩时类胡萝卜素的氧化，可以在氮气等非活性气氛下进行。浓缩程度可以根据所得沉淀物的量和纯度而适当确定，例如，提取液在其重量方面可以浓缩3倍～100倍，优选7倍～50倍，更优选15倍～40倍，特别优选20倍～30倍。

此外，浓缩提取液所得的馏出液可以直接再次用于从培养微生物等中进行提取的步骤。

可以根据得到的沉淀物的量和纯度对浓缩后所得浓缩液进行适当冷却，进一步促进沉淀。此时的冷却温度例如为较提取时温度低20℃以上的温度，或者5℃、0℃、-5℃、-10℃等。或者，优选实施方式为：在沉淀物即将生成时停止浓缩，然后根据所得沉淀物的量和纯度对该浓缩液进行适当冷却，得到沉淀物的方法。冷却温度与上述相同。此时，为了使沉淀物的生成流畅地进行，可以添加种子沉淀(作为引起沉淀的种子的物质，例如类胡萝卜素结晶等类胡萝卜素固体)。

用减压式或加压式过滤器或者离心机等收集沉淀物。此时，视需要可以使用少量与提取溶剂相同的溶剂，来洗涤收集的沉淀物。此外，需要尽量防止类胡萝卜素的氧化时，可在氮气等非活性气氛下进行。而且，对于为了此后实施的高纯度化而进行沉淀物洗涤中使用的溶剂，考虑到多次回收再利用该洗涤溶剂，优选在尽量不残留提取中使用的溶剂的条件下收集沉淀物。

此外，可以从收集沉淀物时产生的含有生物来源污染物的滤液中，采用蒸馏、减压蒸馏等方法回收溶剂，并再次将其用于从培养微生物等中进行提取以及沉淀物的洗涤。

在为了从所得沉淀物得到高纯度类胡萝卜素而进行以下的洗涤时，可以直接将未干燥物用于洗涤，也可以将经干燥后的干燥物用于洗涤。此外，不是必须进行沉淀物的粉碎，但为了提高洗涤效率可以将粉碎物用于洗涤，也可以在洗涤中进行粉碎。对于洗涤，重要的是使用以下记载的溶剂，可以根据所得沉淀物的纯度来适当确定具体的洗涤条件。

作为洗涤用溶剂，可以举例出：低级醇类、含水低级醇类、烃类溶剂类、低级二烷基酮类中的任意1种，或者它们的组合。

在本发明的方法中，当从微生物培养物等中用低级醇进行提取时，优选洗涤步骤使用含水低级醇类或含水低级醇类与烃类溶剂类的组合。此外，当从微生物培养物等中用低级二烷基酮类及醚类中的至少一种进行提取时，优选将浓缩该提取液所得的沉淀物用低级醇类(例如含有碳原子数1～3的醇的溶剂)或低级二烷基酮类(例如含有碳原子数3～6的酮的溶剂)洗涤。

作为低级醇类，可以举例出：甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇等碳原子数1～3的醇，优选乙醇或异丙醇，特别优选乙醇。此外，使用含水低级醇类时，低级醇中含有的水优选为5-95％，更优选为10-50％，特别优选为20-40％。

作为低级二烷基酮类，可以举例出：丙酮、甲基乙基酮、二乙基酮或甲基异丁基酮等碳原子数3～6的酮，优选丙酮或甲基乙基酮，特别优选丙酮。

此外，一个优选实施方式为：在不降低洗涤力的条件下，用含有水或其它有机溶剂的混合溶剂来洗涤。

而且，本发明可以还包括将洗涤步骤中所得的沉淀物进一步用烃类溶剂洗涤的步骤。

作为烃类，可以举例出：戊烷、己烷、环己烷或庚烷等碳原子数5-7的烷烃，优选己烷或庚烷，特别优选己烷。

在本发明中，含水低级醇类与烃类溶剂类的组合是指：混合使用含水低级醇类(例如含水乙醇)与烃类溶剂类(例如己烷)；或者用含水低级醇类(例如含水乙醇)洗涤后，再用烃类溶剂类(例如己烷)洗涤。从洗涤效率的角度考虑，优选后者。

此外，一个优选实施方式为在不降低洗涤力的条件下，用含有其它有机溶剂的混合溶剂洗涤，但必须考虑在所得含类胡萝卜素组合物中的残留量。

作为用于洗涤的溶剂的下限量，优选在考虑沉淀物纯度的同时选择工业可接受的少量的量。例如，在使用含水25％的乙醇的情况下，当对干燥过的沉淀物进行洗涤时，相对于其重量，可以使用2倍量以上、优选4倍量以上、更优选6倍量以上、进一步优选10倍量以上、必要时为20倍量以上；此外，当对未干燥的沉淀物进行洗涤时，可以预先研究未干燥物容量或重量与干燥后沉淀物之间的相关关系，并设定换算系数，使用该换算系数计算出干燥物重量，相对于该干燥物重量可以使用2倍量以上、优选4倍量以上、更优选6倍量以上、进一步优选10倍量以上、必要时为20倍量以上。

此外，上限量最大为200倍量即可，尤其从工业效率性的观点考虑优选100倍量以下，更优选80倍量以下，进一步优选40倍量以下，若对条件进行具体设定则为20倍量以下，而有些情况下为10倍量左右即可。

此外，例如在使用己烷或丙酮进行洗涤的情况下，洗涤干燥后的沉淀物时，相对于其重量，可以使用其重量的30倍量以上、优选35倍量以上、更优选40倍量以上、必要时为40倍量以上；此外，当洗涤未干燥的沉淀物时，可以预先研究未干燥物容量或重量与干燥后沉淀物之间的相关关系，并设定换算系数，使用该换算系数计算出干燥物重量，相对于该干燥物重量，可以使用30倍量以上、优选35倍量以上、更优选40倍量以上、必要时为40倍量以上。此外，上限量最大为200倍量即可，尤其从工业效率性的观点考虑优选100倍量以下，更优选80倍量以下，进一步优选60倍量以下，若对条件进行具体设定则为50倍量以下左右即可。

对于洗涤方法无任何限定，作为实用的优选方法，可以举例出：在混悬搅拌后进行滤取的方法、或者从沉淀物上方通过液体的方法等。洗涤时的温度通常优选1℃～30℃，根据情况也可以为1℃以下或30℃以上的温度。但作为上限温度，可以举例：用于洗涤的溶剂的沸点(例如，乙醇78℃、丙酮56℃)左右。此外，需要尽量防止类胡萝卜素氧化时，可以在氮气等非活性气氛下进行。

为了由沉淀物获得高纯度类胡萝卜素而进行洗涤时，可以采用蒸馏、减压蒸馏等方法从洗涤产生的废液中回收使用过的溶剂，并将所得溶剂再次用于洗涤步骤。

而且，为了降低洗涤、干燥后的本发明含类胡萝卜素组合物中的残存溶剂量，优选方法为：视需要，在洗涤的最后增加用水进行洗涤来替换溶剂的步骤等。作为一个优选例，可以列举：最后增加用少量低温的水或乙醇洗涤的步骤的方法等。

可以对上述纯化步骤的条件(例如提取溶剂以及洗涤液的种类)进行适当调整，使得在采用上述制造方法所得的含类胡萝卜素组合物中类胡萝卜素含量、以及虾青素等主成分的含量达到产额最大化。

作为本发明的含类胡萝卜素组合物中的类胡萝卜素的含量，优选80％以上，更优选85％以上，进一步优选90％以上，进一步优选91％以上，再进一步优选95％以上，特别优选97％以上，最优选98％以上。此外，该类胡萝卜素中的虾青素含量优选40％以上，更优选45％以上，进一步优选46％以上，特别优选47％以上，更进一步优选50％以上，特别优选55％以上，最优选60％以上。

具体说，例如，在使用丙酮提取微生物培养物等后，通过将浓缩提取液所得的沉淀物用乙醇洗涤，可以得到类胡萝卜素含量95％以上的组合物，此外，在使用丙酮提取微生物培养物等后，通过将浓缩提取液所得的沉淀物用丙酮洗涤，可以得到类胡萝卜素含量90％以上的组合物。

如上所述，本发明的制造方法是这样的：使用选自低级醇类、低级二烷基酮类及醚类中的至少1种从微生物培养物等中进行提取，然后将浓缩该提取液所得的沉淀物用低级醇类、烃类溶剂类或它们的组合洗涤。

仅通过这些极为简便的操作，就可以得到高纯度的类胡萝卜素。

与现有技术相比，本发明的方法1)无需复杂操作、2)不必须进行色谱柱纯化、液液提取之类的以1％以下低浓度溶液状态进行的效率低的高纯度化纯化操作，这从工业角度考虑是十分有利的。而且，作为本发明的效果，提供了在下述方面表现良好的工业制造方法：3)可以廉价地提供含有高含量虾青素的高纯度类胡萝卜素组合物，而且采用本发明的方法所得的含类胡萝卜素组合物不含有卤素类有机溶剂；4)各步骤中使用过的溶剂易于回收。

含有本发明的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品也在本发明的范围内。

对于含有通过本发明的制造方法制造的含有高含量虾青素的高纯度类胡萝卜素的医药品，其剂型的例子可以是散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、液剂、混悬剂、栓剂、软膏、乳剂、凝胶剂、粘付剂、吸入剂、注射剂等。这些制剂是用常规方法制备的，但由于类胡萝卜素具有水难溶性，可以将其溶解于植物油、动物油等疏水性有机溶剂中，或者将其与乳化剂、分散剂或表面活性剂等一起用匀浆机(高压匀浆机)分散于水溶液中，乳化使用。为了进一步提高类胡萝卜素的吸收性，可以微粉碎至平均粒子径1微米左右使用。

作为可以用于制剂化的添加剂，可以举例出：大豆油、藏红花油、橄榄油、胚芽油、葵花籽油、牛脂、沙丁鱼油等动植物油，聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇等多元醇，山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等表面活性剂，注射用水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、阿拉伯胶、山梨醇液、糖液等赋形剂，此外还有甜味料、色素、pH调节剂、香料等。此外，液体制剂可以为服用时溶解或混悬于水或其它适当溶剂中的形式。此外，片剂、颗粒剂可以用公知的方法包衣。

以注射剂给药时，优选静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、经皮、关节内、滑液囊内、泡内(in bullla)、骨膜内、舌下、口腔内等给药，特别优选静脉内给药或腹腔内给药。静脉内给药可以是滴注给药、推注给药的任意一种。

类胡萝卜素作为医药品使用时，用法及用量为成人1日1mg～3g，优选3mg～1g，更优选10mg～670mg。按体重1kg换算，则分别为17μg～50mg、54μg～17mg、160μg～12mg。上述用量可以1次或分多次给药。但对于药学有效量、给药方法或给药手段以及给药间隔，技术人员可以根据给药对象的临床状态、性别、年龄、体重而进行适当设定。

作为含有本发明的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的食品的形式，可以举例出：滋补品(散剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、溶液剂等)、饮料(茶、碳酸饮料、乳酸饮料、运动饮料等)、点心(树胶(グミ)、果冻、口香糖、巧克力、蛋糕、糖果等)、油、油脂食品(蛋黄酱、调味汁、黄油、乳脂、人造黄油等)、调味品(蕃茄酱、沙司等)、流食、乳制品(牛奶、酸乳酪、奶酪等)、面包类、面类(乌冬面、荞麦面、拉面、糊(パスタ)、炒面、扁面条、挂面、凉面、米粉等)，等等。

作为含有本发明的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的功能性食品，必要时可以配合各种营养素，各种维生素类(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素E等)，各种矿物质类，食物纤维，多元不饱和脂肪酸，其它营养素(辅酶Q10、卡尼丁、芝麻素、α-硫辛酸、肌醇、D构型肌醇、松醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰DHA、磷脂酰肌醇、牛黄酸、葡糖胺、硫酸软骨素、S-腺苷甲硫氨酸(S一アドノシルメチオニン)等)，分散剂、乳化剂等稳定剂，甜味料，呈味成分(柠檬酸、苹果酸等)，香味调料，蜂王浆、蜂巢腊胶、蘑菇(アガリクス)等。此外，也可以配合薄荷、香柠檬素、甘菊、熏衣草等香草类。此外，还可以配合茶氨酸、脱氢表雄酮(デヒドロエピアンドステロン)、褪黑激素等材料。

作为含有本发明的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的化妆品，可以举例出：膏(クリ一ム)、乳液、化妆水、微乳精华、沐浴剂等，也可以混合有香料等。

类胡萝卜素作为食品或滋补品使用时，用法以及用量没有特别的限定，以1kg体重换算为17μg～50mg，优选54μg～17mg，更优选160μg～12mg。

此外，类胡萝卜素作为化妆品使用时可以以每100g化妆品10μg～5g、优选10μg～2g、更优选10μg～1g的量配合。

实施例

基于实施例、参考例、制剂例以及测试例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限于下述例子。

此外，实施例以及比较例中虾青素以及类胡萝卜素的定量是用高效液相色谱(HPLC)进行的。色谱柱为将2根Wakosil-II SIL-100(

4.6×250mm)(和光纯药公司制)串联使用。洗脱的流动相为正己烷-四氢呋喃-甲醇混合液(40∶20∶1)，在室温左右的一定温度以每分钟1.0mL的流速进行。在测定中，将样品用四氢呋喃溶解后，用流动相稀释100倍，然后将该稀释后的溶液以进样量20μL进样，色谱柱洗脱液的检测在波长470nm进行。此外，定量用标准品使用Sigma公司制虾青素(Cat.No.A9335)。标准液虾青素浓度的设定是在测定标准液在477nm的吸光度(A)、以及上述条件下进行HPLC分析时虾青素峰面积百分率％(B)后，用下式进行的。

虾青素浓度(mg/L)＝A÷2150×B×100

[实施例1]高虾青素含量的高纯度类胡萝卜素的制造1

步骤1：E-396菌株的培养步骤

将包含葡萄糖2g/L、肉提取物3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L的培养基10ml加入直径18mm的试管中，于121℃，蒸汽灭菌15分。向其中接种1个白金接种环量的E-396菌株(FERM BP-4283)，于30℃，300rpm反复振荡培养6日。将200管(2L)该培养液离心分离后冷冻干燥，得到了1g中含有16mg虾青素的干燥菌体。

步骤2：乙醇提取步骤

向62g本实施例步骤1所得干燥菌体中加入18kg乙醇，于50℃，搅拌3小时，提取了含有虾青素的类胡萝卜素。然后，过滤除去菌体，进一步将菌体滤饼(ケ一ク)用乙醇洗涤，得到了含虾青素0.0028％(wt/wt)、类胡萝卜素重量浓度0.0050％(wt/wt)的提取液18kg。

步骤3：浓缩提取液、以及析出步骤

用蒸发器减压浓缩本实施例步骤2所得的18kg提取液，得到了含有沉淀物的浓缩液(约80g)和馏出液(约17kg乙醇)。将该浓缩液在环境温度5℃下边冷却边搅拌1小时。

步骤4：沉淀物滤取、以及干燥步骤

将本实施例步骤3所得的约80g冷却浓缩液减压过滤，得到了含有类胡萝卜素的沉淀物的滤饼。进一步从滤饼的上方加入20g乙醇进行过滤洗涤，然后于35℃减压干燥过夜，得到了1.5g沉淀物的干燥物。该干燥物中虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为38％和64％。

步骤5：用含水25％的乙醇、己烷洗涤的步骤，以及干燥步骤

向本实施例步骤4所得的1.5g沉淀物的干燥物中加入100g含水25％的乙醇，在混悬有相当于0.96％类胡萝卜素的状态下，于室温下搅拌洗涤1小时。减压过滤收集所得洗涤物，在35℃减压干燥过夜，得到了含水25％乙醇洗涤干燥物1.02g。该含水25％乙醇洗涤干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为52％和88％。

然后向所得的1.02g含水25％乙醇洗涤干燥物中加入80g己烷，在混悬有相当于1.1％类胡萝卜素的状态下，在室温下搅拌洗涤1小时。减压过滤收集所得洗涤物，在35℃减压干燥过夜，得到了己烷洗涤干燥物0.88g。该己烷洗涤干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为56％和94％。

步骤6：通过减压蒸馏回收溶剂

通过减压蒸馏，从约100g(约120mL)步骤4产生的滤液中以馏出液的形式回收了80g乙醇。此外，通过减压蒸馏，从约80g(约118mL)步骤5产生的己烷滤液中以馏出液的形式回收了74g己烷。

[实施例2]使用了回收溶剂的虾青素高含量高纯度类胡萝卜素的制造1

向31g实施例1步骤1所得干燥菌体中，加入实施例1步骤3所得馏出液(乙醇)9kg，按照实施例1步骤2的方法进行类胡萝卜素的提取和菌体过滤，得到提取液9kg。按照实施例1步骤3减压浓缩该提取液后，得到冷却的浓缩液约40g。按照实施例1步骤4从该冷却的浓缩液滤取沉淀物。然后，将10g实施例1步骤6回收的乙醇从沉淀物滤饼的上方加入进行过滤洗涤，再进行干燥，得到0.75g干燥物。向该干燥物中加入含水25％的乙醇(由实施例1步骤6回收的乙醇37.5g和水12.5g混合制成)，按照实施例1步骤5的操作得到含水25％乙醇洗涤干燥物0.51g。向所得含水25％乙醇洗涤干燥物中，加入实施例1步骤6回收的己烷40g，按照实施例1步骤5进行洗涤以及干燥，得到了己烷洗涤干燥物0.44g。用含水25％的乙醇和己烷洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为38％和64％；相比之下，用含水25％乙醇和己烷洗涤后的干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为56％和94％。

通过以上操作，可以确定回收溶剂的再利用没有任何问题。

[实施例3]高虾青素含量的高纯度类胡萝卜素的制造2

菌体培养、提取、浓缩以及析出步骤按照与实施例1步骤1～步骤3同样的方法进行，进一步按照实施例1步骤4减压过滤步骤3所得的冷却浓缩液约80g，得到含有类胡萝卜素的沉淀物滤饼。进一步从滤饼上方加入20g乙醇进行过滤洗涤，然后，取干燥滤饼的一部分用于考察沉淀物类胡萝卜素含量。然后，省略干燥步骤，从滤饼上方加入100g含水25％的乙醇进行进一步过滤洗涤。将该过滤洗涤滤饼在35℃减压干燥过夜，得到含水25％乙醇洗涤干燥物1.5g。该用含水25％乙醇洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为38％和64％；相比之下，用含水25％乙醇洗涤后的干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为52％和88％。

此外，从按照实施例1步骤4进行沉淀物滤取得到的滤液约100g(约120mL)中，回收了乙醇85g。

[实施例4]使用了回收溶剂的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的制造2

向31g实施例3使用的干燥菌体中，加入9kg实施例3所得馏出液(乙醇)，按照实施例1步骤2进行类胡萝卜素的提取和菌体过滤，得到提取液9kg。按照实施例1步骤3减压浓缩该提取液后，得到冷却的浓缩液约40g。按照实施例1步骤4的方法，从该冷却的浓缩液中滤取沉淀物。然后，与实施例3相同省略干燥步骤，从沉淀物滤饼的上方加入含水25％的乙醇50g(由实施例3所得回收乙醇37.5g与水12.5g混合而成)进行过滤洗涤。在35℃，将该过滤洗涤滤饼减压干燥过夜，得到了含水25％乙醇洗涤干燥物0.58g。用含水25％乙醇洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为38％和64％；相比之下，用含水25％乙醇洗涤后的干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为52％和88％。

通过以上操作，可以确定：即便使用实施例4减压蒸馏回收的乙醇，也不会降低洗涤能力。

[食品例1]人造奶油

作为抗氧化剂以及着色剂，将实施例1所得虾青素组合物添加到植物油中，使其重量为人造奶油重量的5％，然后与乳化剂等一起搅拌均匀，利用通常的方法制作了人造奶油。该人造奶油与通常的人造奶油相比，由于存在虾青素，呈淡红色。

[食品例2]人工鱼子

将实施例1所得虾青素组合物添加到1％褐藻酸钠水溶液中，使之浓度为0.6％，用匀浆机分散后，滴加到5％氯化钙凝固液中，成型为直径5mm的球状。从外观的自然相似度、形状、色调以及味道的角度来讲，与鱼子酷似。

[制剂例1]含有虾青素的片剂

相对于120重量份实施例1所得含类胡萝卜素组合物，使用结晶纤维素330重量份、羧甲纤维素钙15重量份、羟丙基纤维素10重量份以及注射用水60重量份，以通常的方法进行配合、干燥，然后添加10重量份硬酯酸镁，进行制片，得到了每片含20mg含类胡萝卜素组合物的100mg的片剂。

[制剂例2]含有虾青素的软胶囊

将1重量份实施例1所得含类胡萝卜素组合物混悬于5倍重量份的大豆油中，充分混合使之匀质，然后用胶囊填充机进行胶囊填充，得到了内容物约300mg的红褐色胶囊。

[化妆品例]含有虾青素的膏剂(化妆品)

将实施例1所得含有虾青素的组合物添加到白色凡士林中，使其浓度为10％，与芳香剂等一起搅拌均匀，利用通常的方法制作了膏剂。

[实施例5]高虾青素含量的高纯度类胡萝卜素的制造3

步骤1：E-396菌株的培养步骤

将包含葡萄糖2g/L、肉提取物3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L的培养基10ml加入到直径18mm的试管中，在121℃蒸汽灭菌15分钟。向其中接种一个白金接种环的E-396菌株(FERM BP-4283)，在30℃，300rpm反复振荡培养6日。将该培养液200管(2L)离心分离后冷冻干燥，得到了1g中含有16mg虾青素的干燥菌体。

步骤2：丙酮提取步骤

向50g本实施例步骤1所得干燥菌体中加入丙酮2.2kg，于50℃搅拌1小时，对含有虾青素的类胡萝卜素进行提取。然后通过过滤除去菌体，进一步用丙酮洗涤菌体滤饼，得到了含有虾青素0.034％(wt/wt)、类胡萝卜素重量浓度0.077％(wt/wt)的提取液2.3kg。

步骤3：浓缩提取液、以及析出步骤

将本实施例步骤2所得提取液2.3kg用蒸发器减压浓缩，得到了含有沉淀物的浓缩液(约80g)和馏出液(约2kg丙酮)。将该浓缩液在环境温度5℃下边冷却边搅拌1小时。

步骤4：沉淀物滤取、以及干燥步骤

将本实施例步骤3所得冷却浓缩液约80g减压过滤，得到含有类胡萝卜素的沉淀物滤饼。进一步从滤饼上方加入20g丙酮进行过滤洗涤，然后于35℃减压干燥过夜，得到了沉淀物的干燥物2.13g。该干燥物中虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为34％和71％。

步骤5：乙醇洗涤步骤、以及干燥步骤

向本实施例步骤4所得沉淀物的干燥物2.13g中加入80g乙醇，在混悬相当于1.8％的类胡萝卜素的状态下，于室温搅拌洗涤1小时。减压过滤收集所得洗涤物，于35℃减压干燥过夜，得到乙醇洗涤干燥物1.49g。该乙醇洗涤干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为47％和98％。

步骤6：通过减压蒸馏回收溶剂

通过减压蒸馏，从约100g(约120mL)步骤4产生的滤液中，以馏出液的形式回收了丙酮80g。此外，通过减压蒸馏，从约80g(约100mL)步骤5产生的滤液中，以馏出液的形式，回收了76g乙醇。

[实施例6]使用了回收溶剂的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的制造3

向实施例5步骤1所得干燥菌体25g中，加入1.1kg实施例5步骤3得到的馏出液(丙酮)，按照实施例5步骤2进行类胡萝卜素的提取和菌体过滤，得到提取液1.2kg。按照实施例5步骤3的方法减压浓缩该提取液后，得到冷却浓缩液约40g。按照实施例5步骤4的方法从该冷却浓缩液中滤取沉淀物。然后，从沉淀物滤饼上方加入实施例5步骤6回收的丙酮10g进行过滤洗涤，然后进行干燥，得到1.00g干燥物。向该干燥物中加入实施例5步骤6回收的乙醇40g，按照实施例5步骤5的方法进行洗涤以及干燥，得到了乙醇洗涤干燥物0.72g。乙醇洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为33％和70％；相比之下，乙醇洗涤后的干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为46％和97％。

通过以上操作，可以确定回收溶剂再利用无任何问题。

[实施例7]高虾青素含量的高纯度类胡萝卜素的制造4

菌体的培养、提取、浓缩以及析出步骤像实施例5步骤1～步骤3那样进行，进一步按照实施例5步骤4，将步骤3所得冷却浓缩液约80g减压过滤，得到含有类胡萝卜素的沉淀物滤饼。进一步从滤饼上方加入20g丙酮进行过滤洗涤，然后取滤饼的一部分用于考察沉淀物类胡萝卜素含量。然后，省略干燥步骤，从滤饼上方加入80g乙醇进行进一步过滤洗涤。将该过滤洗涤滤饼于35℃减压干燥过夜，得到了乙醇洗涤干燥物1.50g。该乙醇洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为33％和70％；相比之下，乙醇洗涤后的干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为46％和97％。

此外，从按照实施例5步骤4进行沉淀物滤取所得的滤液约100g(约120mL)中，回收了丙酮85g，并且，从按照实施例5步骤5进行的乙醇洗涤步骤中得到的约80g(约100mL)滤液中，回收了仅混有少量丙酮的乙醇75g。

[实施例8]使用了回收溶剂的高虾青素含量高纯度类胡萝卜素的制造4

向25g实施例7使用的干燥菌体中，加入实施例7所得馏出液(丙酮)1.1kg，按照实施例5步骤2的方法进行类胡萝卜素的提取和菌体过滤，得到提取液1.1kg。按照实施例5步骤3减压浓缩该提取液后，得到冷却浓缩液约40g。按照实施例5步骤4由该冷却浓缩液滤取沉淀物。然后从沉淀物滤饼的上方加入实施例7所得回收丙酮10g进行过滤洗涤，然后，与实施例7同样省略干燥步骤，加入实施例7回收的乙醇40g进行进一步过滤洗涤。将该过滤洗涤滤饼在35℃减压干燥过夜，得到了乙醇洗涤干燥物0.73g。乙醇洗涤前的减压干燥物中，虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为34％和71％；相比之下，乙醇洗涤干燥物中虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为46％和97％。

可以确定：在实施例8中，即使使用了减压蒸馏回收的混有丙酮的乙醇，也不会降低洗涤能力。但考虑到多次回收再利用，一个优选实施方式为：在乙醇洗涤步骤前，在尽量不残留丙酮的条件下，多加小心地滤取沉淀物。

[实施例9]高虾青素含量的高纯度类胡萝卜素的制造5

像实施例5进行操作，不同的是：用丙酮进行洗涤来取代实施例5中的乙醇洗涤，所得干燥物中虾青素以及类胡萝卜素的含量分别为45％和91％。

[参考例1]虾青素在室温下的溶解度的测定

测定虾青素(Sigma制)的室温溶解度，如表1所示。

表1

由表1可知，除在具有致癌性、变异原性的卤素溶剂中外，在其它溶剂中的溶解度均为1％以下的低浓度。因此，在现有技术的液液分配中，只要使用毒性较低的普通有机溶剂，用浓度大于1％的类胡萝卜素溶液进行高纯度化处理就是很困难的，在工业生产性上是大问题。

即，本发明的方法不进行液液分配，而采用固化/固体洗涤的方法。当使用只溶解1％以下浓度的、可安全使用的溶剂时，采用现有方法在分液操作时必须使用大量稀释液，因此需要很大的设备，效率低；相比之下，采用本发明的方法，以小规模就能够达到目的。

[比较例1]按照特开平8-253695号公报实施例1-1的制法

在像实施例5步骤1～2那样得到的虾青素浓度0.034％(wt/wt)、类胡萝卜素浓度0.077％(wt/wt)的提取液2.3kg(2.9L)中加入己烷1.9kg(2.9L)和1％食盐水2.9kg(2.9L)，搅拌1小时。静置后，分离成2层，得到上层的己烷层3.7L(2.5kg)和下层的水层5L(4.6kg)。将所得己烷层用蒸发器减压浓缩，制成约0.3L的浓缩液，然后，于4℃放置12小时后，减压过滤沉淀物，从沉淀物上方加入25mL己烷进行过滤洗涤，通过减压干燥进行干燥过夜，得到虾青素含量47％、类胡萝卜素含量98％的1.45g干燥物。

关于类胡萝卜素高纯度化处理时的条件，例如，实施例5中用约1.8％(wt/wt)的类胡萝卜素混悬液进行操作；相比之下，比较例1中对于类胡萝卜素浓度约0.07％(wt/wt)的低类胡萝卜素浓度的3.7L己烷溶液，必须使之与5L的水层相接触。从这一点来讲，本发明与比较例1的方法相比，工业效率更高。

此外，在操作总液量方面，与例如实施例5所用丙酮以及乙醇的总计容量2.925L相比，比较例1所使用的丙酮、己烷以及1％食盐水的总容量为8.725L，为约3倍的工作液操作量。因此，本发明的方法在工业上是高效率的。

关于回收提取所用的约2.9L丙酮，例如，实施例5以及7中，在减压浓缩制造步骤中的提取液的同时，可以以馏出液的形式回收丙酮约2.8L。相比之下，比较例1中，必须进行对己烷层减压浓缩所得的由丙酮和己烷组成的馏出液约3.4L重新分级来分别回收丙酮和己烷的操作、以及由约5L的水层重新回收丙酮的操作。因此，本发明的方法，其溶剂回收步骤更为简便。

[食品例3]人造奶油

将实施例5所得虾青素组合物作为抗氧化剂以及着色剂添加到植物油中，使其重量为人造奶油的5％，然后与乳化剂等一起搅拌均匀，利用通常的方法制作了人造奶油。该人造奶油与通常的人造奶油相比，由于存在虾青素，呈浅红色。

[食品例4]人工鱼子

将实施例5所得虾青素组合物加入到1％褐藻酸钠水溶液中，使其浓度为0.6％，用匀浆机分散后，滴加到5％氯化钙凝固液中，成型为直径5mm的球状。外观的自然近似度、形状、色调、以及味道方面与鱼子酷似。

[制剂例3]含有虾青素的片剂

对于120重量份实施例5所得含类胡萝卜素组合物，使用结晶纤维素330重量份、羧甲纤维素钙15重量份、羟丙基纤维素10重量份以及注射用水60重量份以通常的方法配合，干燥后添加10重量份硬酯酸镁，制片，得到了每片含20mg含类胡萝卜素组合物的100mg的片剂。

[制剂例4]含有虾青素的软胶囊

将1重量份实施例5所得含类胡萝卜素组合物混悬于5倍重量份的大豆油中，充分混合使其匀质，然后用胶囊填充机填充胶囊，得到了内容物约300mg的红褐色状胶囊。

[化妆品例]含有虾青素的膏剂(化妆品)

将实施例5所得含有虾青素的组合物加入到白色凡士林中，使其终浓度为10％，与芳香剂等一起搅拌均匀，用通常的方法制备了膏剂。

工业实用性

通过本发明，可以提供天然物来源的高纯度、低成本且安全的类胡萝卜素高含量组合物及其工业制造方法，其结果还可以提供含有该组合物的功能性食品、医药组合物或化妆品。

序列表自由正文(フリ一テキスト)

SEQ ID NO：1

未知(Unknown)的信息：E-396

n为a、c、g或t(存在位置：1350)

序列表

<110>旭化成制药株式会社(Asahi Kasei Pharma Corporation)

新日本石油株式会社(Nippon Oil Corporation)

<120>类胡萝卜素的制造方法

<130>PCT07-0006

<150>JP2006-087223

<151>2006-03-28

<150>JP2006-149794

<151>2006-05-30

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1452

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>E-396

<220>

<221>misc_feature

<222>(1350)..(1350)

<223>n为a，c，g或t

<400>1

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ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac    1080

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gatcacctcc tt                                                        1452

Claims (12)

1.含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括以下步骤1)～3)：

1)用选自低级醇类、含水低级醇类、低级二烷基酮类及醚类中的至少1种对微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物进行提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用选自低级醇类、含水低级醇类、烃类溶剂类及低级二烷基酮类中的至少1种洗涤沉淀物的步骤。

2.含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括以下步骤1)～3)：

1)用乙醇或丙酮对微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物进行提取的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇、含水乙醇或丙酮洗涤沉淀物的步骤。

3.含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括以下步骤1)～3)：

1)用乙醇提取微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用含水乙醇洗涤沉淀物的步骤。

4.含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括以下步骤1)～3)：

1)用丙酮提取微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物的步骤；

2)浓缩所得提取液，得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇洗涤沉淀物的步骤。

5.含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法包括以下步骤1)～3)：

1)用丙酮对微生物的培养物、该培养物的浓缩物、或者它们的干燥物进行提取的步骤；

2)浓缩所得提取液得到沉淀物的步骤；

3)用乙醇洗涤沉淀物的步骤。

6.权利要求1～5中任1项的含类胡萝卜素组合物的制造方法，该制造方法还包括以下的1个步骤：

4)用己烷进一步洗涤步骤3)所得沉淀物的步骤。

7.权利要求1～6中任1项的制造方法，其中含类胡萝卜素组合物含有80％以上的类胡萝卜素。

8.权利要求1～7中任1项的制造方法，其中，类胡萝卜素含有40％以上的虾青素。

9.权利要求1～8中任1项的制造方法，其中，与微生物的16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列是与SEQ ID NO：1记载的碱基序列基本上同源的碱基序列。

10.权利要求1～9中任1项的类胡萝卜素的制造方法，其中，微生物是保藏号为FERM BP-4283的E-396株或其变异株。

11.用权利要求1～10中任1项的制造方法获得的含类胡萝卜素组合物。

12.含有权利要求11的含类胡萝卜素组合物的食品、医药组合物或化妆品。