CN104003920B - 绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，收集不产氧光合细菌湿菌体，加入碱性低浓度乙醇水溶液，选择性提取并去除湿菌体中的细菌叶绿素，而不提取类胡萝卜素；去除细菌叶绿素后，再用无水乙醇提取湿菌体中的类胡萝卜素。本发明采用乙醇水工艺提取不产氧光合细菌类胡萝卜素，选择性好，类胡萝卜素纯度高，操作简单，条件温和，除乙醇和水作为溶剂外，全过程不使用其他有机溶剂，减少了有机溶剂的有害残留，绿色环保，操作简单方便，易于规模化生产。

Description

绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法

技术领域

本发明涉及微生物学技术领域，具体地说是涉及一种绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素不仅色泽丰富，而且具有抗氧化、清除自由基、免疫调节、调控细胞增殖和分化、信号传导和细胞间隙连接通讯等生理活性，也可作为重要的营养要素，能增加机体免疫功能、防病保健，甚至能够抑制肿瘤的发生和生长，对眼部疾病和心血管疾病具有良好的预防作用。因此，类胡萝卜素在医药、保健、化妆、美容、营养食品和饲料添加剂等方面具有广泛用途。由于化学合成色素的毒副作用，多种化学合成类胡萝卜素已被限制或禁止使用，天然来源的类胡萝卜素再度受到了极大重视。目前类胡萝卜素需求日益增长，随着不与人争粮、不与粮争地战略思想的贯彻，已刺激和吸引人们积极开发各种天然来源的类胡萝卜素。而微生物资源丰富，易于规模化生产，因此，微生物源的类胡萝卜素逐渐呈现出替代化学合成和动植物源类胡萝卜素产品的趋势。其中，不产氧光合细菌能合成除链孢红素和番茄红素以外的多种类胡萝卜素，其化学结构独特，不同于藻类、真菌、动物和植物来源的类胡萝卜素，是开发新型类胡萝卜素的良好资源。

不产氧光合细菌除了富含类胡萝卜素以外，还富含细菌叶绿素，因此，制备不产氧光合细菌类胡萝卜素过程中，面临着将类胡萝卜素与细菌叶绿素进行分离的问题。目前，不产氧光合细类胡萝卜素制备方法主要包括有机溶剂提取—皂化—萃取法、酸化预处理—有机溶剂提取法、有机溶剂提取—柱层析、超临界萃取等工艺。超临界萃取法安全可靠，无溶剂残留，但投资大、成本高，规模化生产难以普及；除了超临界萃取法外，大多涉及有机溶液提取—皂化—萃取工艺，如采用丙酮、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醚等以及几种溶剂按不同比例混合作为提取剂，通常通过有机溶剂提取总色素，经过皂化去除总色素中的细菌叶绿素、再经过萃取得到类胡萝卜素。例如，牟海津等报道的一种方法，用石油醚-甲醇溶液(2:1)悬浮菌体，再加入相当于10％甲醇量的KOH，加热提取，再加入少量无水Na2SO4除去其中的蛋白质等极性物质，然后加石油醚于抽提液中，充分振荡，静置分层，取出上层石油醚溶液，依次用甲醇和水分别洗涤2～3次，经减压干燥，即可获得类胡萝卜素制品(牟海津等，光合细菌类胡萝卜素的研究，《海洋湖沼通报》，1998年第4期第33页)；又如，一种藻类色素提取和皂化同步进行的方法，以乙醇悬浮细胞，加入60％KOH溶液，乙醇与KOH溶液的比例为10:1，搅拌均匀，60℃提取皂化20分钟，离心取上清，菌体沉淀再用乙醇提取2次，合并3次提取液，用乙醚萃取3次，合并萃取液反复经水洗涤至水层呈中性，用于藻类色素含量的检测(王业勤、李勤生，《天然类胡萝卜素—研究进展、生产、应用》196页)。本发明人所在课题组也报道了一种同时制备细菌叶绿素和类胡萝卜素2种色素的方法，采用有机溶剂提取不产氧光合细菌色素，通过硅胶柱层析同时制备细菌叶绿素和类胡萝卜素这2种色素(《微生物学通报》，2014年第一期26-34页)。由此可见，目前的制备方法均是将菌体中的类胡萝卜素和细菌叶绿素同时提取出来，再通过皂化—萃取或柱层析工艺得到类胡萝卜素，虽然提取和皂化过程可以同时进行，简化了提取工艺，但无论是皂化萃取工艺，还是柱层析工艺，都涉及到了除乙醇和水以外有机溶剂的使用，特别是大规模生产时，有机溶剂用量较大，不仅对环境造成污染，而且不可避免地会带来溶剂残留，影响后续的食品药品安全。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，实现了以乙醇和水为溶剂，不使用其它有机溶剂，选择性地去除菌体中的细菌叶绿素，高效地提取菌体中的类胡萝卜素，克服了现有方法中有机溶剂的使用和残留问题，绿色环保，简单易行，容易实现规模化生产。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)取不产氧光合细菌之湿菌体，按浴比为1:4～30(w/v)加入含有5.0～10.0％(w/v)碱试剂的25～50％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提8.0～40.0分钟，湿菌体再重复浸提0～2次，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1：8～16(w/v)加入无水乙醇，常温避光浸提40.0分钟～3.0小时，湿菌体再重复避光浸提0～2次，合并提取液，低于50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

一实施例中：所述步骤1)中，取不产氧光合细菌之湿菌体，按浴比为1:15～30(w/v)加入含有5.0～10.0％(w/v)碱试剂的30～40％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提8.0～20.0分钟，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素。

一实施例中：所述碱试剂为NaOH或KOH中的一种。

一实施例中：所述不产氧光合细菌为含有螺菌黄质系、球形烯系和奥氏酮系中的至少一系的类胡萝卜素的不产氧光合细菌。

本发明中所述的湿菌体即为不产氧光合细菌菌泥。

本发明中所述的浴比为湿菌体质量与所加入溶剂体积之比例(w/v,g/ml)。

本发明中所述常温指一般的环境温度，即操作过程中不需加温也不需降温的任一温度，一般为5℃至32℃范围内均可。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明采用两步法提取制备类胡萝卜素，首先采用碱性低浓度乙醇水溶液作为溶剂，选择性提取去除湿菌体中的细菌叶绿素成分，而类胡萝卜素仍留在菌体中，基本不损失；再收集去除细菌叶绿素后的湿菌体，用无水乙醇提取菌体中的类胡萝卜素；与现有技术中，将细菌叶绿素和类胡萝卜素一并提取后再分离相比，本发明细菌叶绿素去除更为干净，分离更彻底，类胡萝卜素损失少，得率高。

2.现有技术是将细菌叶绿素和类胡萝卜素同时提取，再采用皂化—萃取工艺或柱层析纯化工艺制备类胡萝卜素，或者提取和皂化一步完成再行萃取制备类胡萝卜素。但无论是皂化—萃取工艺还是柱层析工艺，都不可避免地使用大量的有机溶剂如甲醇、丙酮、乙醚和石油醚等，有机溶剂易泄露挥发，污染环境，同时溶剂残留也难以避免，影响后续食品和药品安全。而本发明仅使用乙醇和水为溶剂，工艺更安全、更环保，克服了传统工艺中多种有机溶剂的有害残留和环境污染问题。

3.本发明所提供的一种绿色环保制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，试剂来源广泛，易于获得，成本低廉，且反应条件温和，操作简便，尤其适合大规模工业化生产。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1

海洋着色菌283-1菌株中奥氏酮系类胡萝卜素的制备：

1)取厌氧光照培养5天的283-1湿菌体等量4份，每份2.0g，按浴比为1:5(w/v)分别加入10ml含有5.0％(w/v)NaOH的25、30、40和50％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提10.0分钟，离心收集湿菌体，再重复浸提1次，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1：5(w/v)加入10ml蒸馏水，洗涤菌体3次至菌体pH值为6.8～7.1，按浴比为1：16(w/v)加入32ml无水乙醇，常温避光浸提40.0分钟，湿菌体再重复避光浸提2次，合并提取液，30℃～50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

经检测，当乙醇水溶液浓度分别设置为25、30、40和50％(v/v)时，海洋着色菌283-1湿菌体类胡萝卜素提取量分别为1.09、1.14、1.16和1.03mg/g，制备的类胡萝卜素中均未检测到细菌叶绿素组分。表明在此技术方案下，菌体中的细菌叶绿素去除良好，且类胡萝卜素未见明显损失。

实施例2

沼泽红假单胞菌CQV97菌株中螺菌黄质系类胡萝卜素的制备：

1)取CQV97湿菌体2.0g，按浴比为1:4(w/v)分别加入8ml含有10.0％(w/v)KOH的40％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提40.0分钟，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1：5(w/v)加入10ml蒸馏水，加入适量1mol/LHCl调节菌体pH值为6.8～7.1，按浴比为1：8(w/v)加入16ml无水乙醇，常温避光浸提3小时，30℃～50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

经检测，沼泽红假单胞菌CQV97湿菌体类胡萝卜素提取量为0.97mg/g，制备的类胡萝卜素中未检测到细菌叶绿素组分。

实施例3

固氮红杆菌R7菌株中球形烯系类胡萝卜素的制备：

1)取R7湿菌体2.0g，按浴比为1:30(w/v)分别加入60ml含有5.0％(w/v)NaOH的30％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提8.0分钟，离心收集湿菌体，再重复浸提2次，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1：5(w/v)加入10ml蒸馏水，洗涤菌体4次至菌体pH值为6.8～7.1，按浴比为1：16(w/v)加入32ml无水乙醇，常温避光浸提2小时，湿菌体再重复避光浸提2次，合并提取液，加入适量保护剂维生素C，30℃～50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

经检测，固氮红杆菌R7湿菌体类胡萝卜素提取量分别为0.73mg/g，制备的类胡萝卜素中未检测到细菌叶绿素组分。

实施例4

分别以沼泽红假单胞菌CQV97菌株、固氮红杆菌R7菌株和海洋着色菌283-1菌株这3株不产氧光合细菌的湿菌体为原料，采用本发明所提供的方法制备类胡萝卜素，并与常规的丙酮甲醇提取—皂化—乙醚萃取的方法进行比较。具体步骤如下：

1)取CQV97、R7和283-1三种不产氧光合细菌之湿菌体各2.0g，按浴比为1:15(w/v)分别加入30ml含有10.0％(w/v)NaOH的30％(v/v)乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提20.0分钟，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1：5(w/v)加入蒸馏水，洗涤菌体2次至菌体pH值为6.8～7.1，按浴比为1：8(w/v)加入16ml无水乙醇，常温避光浸提1.0小时，湿菌体再重复避光浸提1次，合并提取液，采用真空旋转蒸发仪，30℃～50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

经检测，CQV97、R7和283-1这3个菌株中湿菌体类胡萝卜素提取量分别为1.01、0.74和1.17mg/g，制备的类胡萝卜素中均未检测到细菌叶绿素组分。

另取CQV97、R7和283-1三种不产氧光合细菌之湿菌体，采用常规丙酮甲醇(v/v＝7:2)提取—皂化—乙醚萃取的方法，制得的3个菌株之湿菌体类胡萝卜素提取量分别为1.05、0.76和1.18mg/g。

由以上数据可知，采用本发明所提供的方法，与现有技术相比，类胡萝卜素产率未见明显降低，也没有明显的细菌叶绿素残留，且对不同种类的不产氧光合细菌中的类胡萝卜素提取均具有良好的适用性。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (4)

1.一种制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取不产氧光合细菌之湿菌体，按浴比为1克湿菌体加入4～30毫升溶剂的比例加入含有5.0～10.0％质量体积比碱试剂的25～50％体积比的乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提8.0～40.0分钟，湿菌体再重复浸提0～2次，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素；

2)收集去除细菌叶绿素的湿菌体，按浴比为1克湿菌体加入8～16毫升溶剂的比例加入无水乙醇，常温避光浸提40.0分钟～3.0小时，湿菌体再重复避光浸提0～2次，合并提取液，低于50℃回收溶剂、浓缩干燥，即得类胡萝卜素。

2.根据权利要求1所述的一种制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，取不产氧光合细菌之湿菌体，按浴比为1克湿菌体加入15～30毫升溶剂的比例加入含有5.0～10.0％质量体积比碱试剂的30～40％体积比的乙醇水溶液，悬浮细胞并摇匀后，常温浸提8.0～20.0分钟，选择性地提取去除湿菌体中的细菌叶绿素。

3.根据权利要求1所述的一种制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，其特征在于：所述碱试剂为NaOH或KOH中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种制备不产氧光合细菌类胡萝卜素的方法，其特征在于：所述不产氧光合细菌为含有螺菌黄质系、球形烯系和奥氏酮系中的至少一系的类胡萝卜素的不产氧光合细菌。