CN108865891A - 一种法夫酵母细胞机械破壁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，具体为：法夫酵母发酵液1‑4L在5000‑10000rpm下离心5‑10min后保留沉淀；再加入与离心前发酵液等体积的蒸馏水混匀后离心；将沉淀进行称重后用蒸馏水将浓度稀释至20‑50％，调节pH为5‑8；在压力70‑100Mpa，往复泵单次流量5‑8mL，往复泵伸出速度20‑50次/min的条件下，将菌液通过高压均质机进行破壁2‑5次；显微镜观察菌液中细胞全部破壁后离心，向沉淀中添加100‑1000mL有机溶剂萃取细胞内容物。本发明工艺简单，易于操作，破壁速度快，节约时间，可连续生产，适用于法夫酵母胞内虾青素、多糖、氨基酸和多肽的提取。
Description
技术领域
本发明涉及一种方法，尤其涉及一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
法夫酵母最初是二十世纪七十年代从日本及阿拉斯加落叶植物的分泌物中分离得到的。法夫酵母通过代谢能够产天然虾青素，虾青素是动物中广泛存在的一种非维生素A源的类胡萝卜素，被证实广泛存在于虾、蟹及其他各类水产品中的天然产物，具有显色、抗氧化和增强免疫力等作用。天然虾青素的来源主要有3种：水产品的废弃物(虾蟹等甲壳类)、红法夫酵母和微藻(雨生红球藻)。水产品废弃物中虾青素含量较低，与之相比雨生红球藻细胞中的虾青素含量最高，可达细胞干重的5％，但雨生红球藻细胞的培养周期长，生产设备复杂，需要光照等条件限制而无法大规模生产。而通过法夫酵母发酵生产虾青素，具有生长速度快、发酵周期短、发酵工艺简单、易于控制、可进行高密度培养等优点，受到越来越多的关注。
法夫酵母破壁就是对法夫酵母细胞壁进行破碎，释放出里面的营养物质，从而便于虾青素的提取。目前常见的酵母破壁方法有酶法、超声波法和自溶法等，但是以上方法工艺复杂、耗时较长、细胞破碎不彻底使收集不完全、不能连续生产从而不能进一步工业化。
发明内容
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种法夫酵母细胞机械破壁的方法。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：
步骤一，法夫酵母发酵液1-4L在5000-10000rpm下离心5-10min，以充分将发酵液中固体物质以及细胞内含物与水分进行分离，然后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤二，向沉淀中加入与步骤一中离心前发酵液相同体积的蒸馏水混匀，以清洗菌体表面，降低细胞破壁时的杂质，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤三，将离心后的沉淀进行称重，称重后加入蒸馏水将浓度稀释至20- 50％，充分混匀，调节pH 5-8；
步骤四，在压力70-100Mpa、往复泵单次流量5-8mL、往复泵伸出速度20-5 次/min的条件下，将稀释后菌液通过高压均质机进行机械破壁2-5次；
步骤五，显微镜观察菌液中革兰氏染色后的细胞破壁情况；若仍存在完整的细胞壁，重复步骤四，直至所有细胞均破壁完成；
步骤六，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，向沉淀中添加 100-1000mL的有机溶剂，依据相似相容原理对细胞内含物进行萃取。
进一步地，革兰氏染色方法为：涂片固定；草酸铵结晶紫染色1min；蒸馏水冲洗；碘液覆盖1min；蒸馏水冲洗，吸水纸吸去水分；95％酒精脱色30s；番红染色液染色10s，蒸馏水冲洗，干燥。
进一步地，有机溶剂为大豆油、花生油、玉米油、菜籽油、葵花油、调和油、橄榄油、甘油、石油醚、丙酮、异丙醇、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或多种的组合。
进一步地，所述方法适用于对无性型法夫酵母细胞以及有性型法夫酵母细胞进行机械破壁。
本发明适用于法夫酵母胞内虾青素、多糖、氨基酸和多肽的提取。此方法工艺简单，易于操作和控制，破壁速度快，节约时间，可连续生产。此机械破壁方法简便高效，实现工业化连续生产，具有重要的研究价值和应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：
步骤一，法夫酵母发酵液1-4L在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤二，向沉淀中加入步骤一中与离心前发酵液相同体积的蒸馏水混匀，以清洗菌体表面，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤三，将离心后的沉淀进行称重，称重后加入蒸馏水将浓度稀释至20- 50％，充分混匀，调节pH5-8；
步骤四，在压力70-100Mpa、往复泵单次流量5-8mL、往复泵伸出速度20-5 次/min的条件下，将稀释后菌液通过高压均质机进行机械破壁2-5次；
步骤五，显微镜观察菌液中革兰氏染色后的细胞破壁情况；若仍存在完整的细胞壁，重复步骤四，直至所有细胞均破壁完成；
步骤六，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，向沉淀中添加 100-1000mL的有机溶剂，对细胞内含物进行萃取。
革兰氏染色方法为：涂片固定；草酸铵结晶紫染色1min；蒸馏水冲洗；碘液覆盖1min；蒸馏水冲洗，吸水纸吸去水分；95％酒精脱色30s；番红染色液染色10s，蒸馏水冲洗，干燥。
有机溶剂为大豆油、花生油、玉米油、菜籽油、葵花油、调和油、橄榄油、甘油、石油醚、丙酮、异丙醇、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或多种的组合。
所述方法适用于对无性型法夫酵母细胞以及有性型法夫酵母细胞进行机械破壁。
下面结合具体实施例对本发明的技术效果做进一步展示。
实施例一、
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：法夫酵母发酵液2L 在8000rpm下离心6min后去掉上清液得到沉淀，加入2L蒸馏水混匀，在6000rpm 下离心9min去掉上清保留沉淀。用蒸馏水将离心后的沉淀浓度稀释至40％，充分混匀，调节pH为7，通过高压均质机机械破壁。均质机破壁压力90Mpa，往复泵单次流量7mL，往复泵伸出速度30次/min，显微镜观察革兰氏染色后的细胞形态，处理次数3次后细胞全部破壁。6000rpm下离心9min，去除上清液，加入300mL异丙醇提取细胞内含物。
本实施例构成的法夫酵母细胞机械破壁的方法提取虾青素时可达到100％的酵母细胞破壁，整个过程用时40min，通过有机试剂收集到虾青素含量为 9402.7μg/L，较其他酵母破壁方法用时减少了80％，虾青素回收率提高了20％。
实施例二、
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：法夫酵母发酵液3L 在9000rpm下离7min后去掉上清液得到沉淀，加入3L蒸馏水混匀，在7000rpm下离心8min去掉上清保留沉淀。用蒸馏水将离心后的沉淀浓度稀释至30％，充分混匀，调节pH为6，通过高压均质机机械破壁。均质机破壁压力80Mpa，往复泵单次流量6mL，往复泵伸出速度40次/min，显微镜观察革兰氏染色后的细胞形态，处理次数4次后细胞全部破壁。8000rpm下离心7min，去除上清液，加入 600mL乙醇提取细胞内含物。
本实施例构成的法夫酵母细胞机械破壁的方法提取虾青素时可达到100％的酵母细胞破壁，整个过程用时47min，通过有机试剂收集到虾青素含量为 9226.4μg/L，较其他酵母破壁方法用时减少了74％，虾青素回收率提高了18％。
实施例三、
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：法夫酵母发酵液1L 在5000rpm下离心5min后去掉上清液得到沉淀，加入1L蒸馏水混匀，在 7000rpm下离心6min去掉上清保留沉淀。用蒸馏水将离心后的沉淀浓度稀释至 20％，充分混匀，调节pH为5，通过高压均质机机械破壁。均质机破壁压力 70Mpa，往复泵单次流量5mL，往复泵伸出速度20次/min，显微镜观察革兰氏染色后的细胞形态，处理次数2次后细胞全部破壁。6000rpm下离心7min，去除水相，加入100mL石油醚提取细胞内含物。
本实施例构成的法夫酵母细胞机械破壁的方法提取虾青素时可达到100％的酵母细胞破壁，整个过程用时22min，通过有机试剂收集到虾青素含量为 9411.8μg/L，较其他酵母破壁方法用时减少了88％，虾青素回收率提高了20％。
实施例四、
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：法夫酵母发酵液4L 在10000rpm下离心6min后去掉上清液得到沉淀，加入4L蒸馏水混匀，在 9000rpm下离心7min去掉上清保留沉淀。用蒸馏水将离心后的沉淀浓度稀释至 50％，充分混匀，调节pH为8，通过高压均质机机械破壁。均质机破壁压力 100Mpa，往复泵单次流量8mL，往复泵伸出速度50次/min，显微镜观察革兰氏染色后的细胞形态，处理次数5次后细胞全部破壁。8000rpm下离心8min，去除水相，加入500mL丙酮提取细胞内含物。
本实施例构成的法夫酵母细胞机械破壁的方法提取虾青素时可达到100％的酵母细胞破壁，整个过程用时65min，通过有机试剂收集到虾青素含量为 9365.3μg/L，较其他酵母破壁方法用时减少了64％，虾青素回收率提高了20％。
实施例五、
一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，由以下步骤组成：法夫酵母发酵液3L 在7000rpm下离心9min后去掉上清液得到沉淀，加入3L蒸馏水混匀，在6000rpm 下离心10min去掉上清保留沉淀。用蒸馏水将离心后的沉淀浓度稀释至30％，充分混匀，调节pH为7，通过高压均质机机械破壁。均质机破壁压力90Mpa，往复泵单次流量5mL，往复泵伸出速度30次/min，显微镜观察革兰氏染色后的细胞形态，处理次数4次后细胞全部破壁。10000rpm下离心5min，去除水相，加入 700mL调和油提取细胞内含物。
本实施例构成的法夫酵母细胞机械破壁的方法提取虾青素时可达到100％的酵母细胞破壁，整个过程用时50min，通过有机试剂收集到虾青素含量为 9336.7μg/L，较其他酵母破壁方法用时减少了73％，虾青素回收率提高了19％。
本发明具有易于操作和控制、破壁完全、节约时间、可连续生产等优势，并且对细胞内含物的回收率要高于市面上常用的酶法、超声波法和自溶法，具有工业化应用价值。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种法夫酵母细胞机械破壁的方法，其特征在于：所述方法的整体步骤为：
步骤一，法夫酵母发酵液1-4L在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤二，向沉淀中加入与步骤一中离心前发酵液相同体积的蒸馏水混匀，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，保留沉淀；
步骤三，将离心后的沉淀进行称重，称重后加入蒸馏水将浓度稀释至20-50％，充分混匀，调节pH 5-8；
步骤四，在压力70-100Mpa、往复泵单次流量5-8mL、往复泵伸出速度20-5次/min的条件下，将稀释后菌液通过高压均质机进行机械破壁2-5次；
步骤五，显微镜观察菌液中革兰氏染色后的细胞破壁情况；若仍存在完整的细胞壁，重复步骤四，直至所有细胞均破壁完成；
步骤六，在5000-10000rpm下离心5-10min后弃掉上清液，向沉淀中添加100-1000mL的有机溶剂，对细胞内含物进行萃取。
2.根据权利要求1所述的法夫酵母细胞机械破壁的方法，其特征在于：所述革兰氏染色方法为：涂片固定；草酸铵结晶紫染色1min；蒸馏水冲洗；碘液覆盖1min；蒸馏水冲洗，吸水纸吸去水分；95％酒精脱色30s；番红染色液染色10s，蒸馏水冲洗，干燥。
3.根据权利要求2所述的法夫酵母细胞机械破壁的方法，其特征在于：所述有机溶剂为大豆油、花生油、玉米油、菜籽油、葵花油、调和油、橄榄油、甘油、石油醚、丙酮、异丙醇、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的法夫酵母细胞机械破壁的方法，其特征在于：所述方法适用于对无性型法夫酵母细胞以及有性型法夫酵母细胞进行机械破壁。
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