CN113260709A - 从微藻萃取颜料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从微藻萃取颜料的方法。

Description

从微藻萃取颜料的方法
技术领域
本发明涉及一种从微藻萃取颜料的方法。
背景技术
也被称为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮的虾青素(C40H52O4)是一种红色类胡萝卜素，其在食品工业中、例如在鲑鱼的水产养殖中以及在化妆品工业中被用作着色剂。虾青素是一种强氧化剂，稳定并还原自由基。虾青素天然存在于微藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(H.pluvialis)中。虾青素可以从雨生红球藻(H.pluvialis)萃取，然而，所述萃取伴有例如用于产品纯化的高成本。
此外，可以合成生产虾青素。然而，合成的虾青素与从雨生红球藻(H.pluvialis)生物技术生产的虾青素相比具有低20倍的抗氧化效果[1]。
使用雨生红球藻(H.pluvialis)的虾青素的生物技术生产通过例如利用硝酸盐耗竭或高光强度在所述微藻中富集虾青素来进行，所述硝酸盐耗竭或高光强度导致虾青素在雨生红球藻(H.pluvialis)细胞的细胞质中积累到高达5wt.-％干重。然而，虾青素合成伴随着厚的抗性细胞壁的形成，这使得从所述具有厚细胞壁的细胞直接萃取虾青素成为一种低效的过程。在虾青素的生物技术生产过程中，通常通过离心将细胞悬液浓缩，然后干燥。在使用珠磨机将细胞机械破碎后，使用必须被压缩至高达1000巴的超临界二氧化碳从生物质萃取虾青素[2]。使用二氧化碳萃取是一种常用的虾青素萃取工艺，然而，由于干燥步骤和超临界二氧化碳所需的高压，所述工艺非常耗能。此外，每个工艺步骤都伴随着虾青素产率的损失，这对所述工艺的总效率产生负面影响。
由于处于孢囊阶段的雨生红球藻(H.pluvialis)的所述厚细胞壁，在溶剂中直接萃取虾青素是不可能的。所述厚细胞壁的一种天然破碎方法是通过使所述处于孢囊阶段的细胞经历生长条件而诱导萌发。此类诱导萌发的条件诱导处于孢囊阶段的雨生红球藻(H.pluvialis)萌发，以进入有鞭毛阶段[3]。在所述有鞭毛阶段中，所述细胞在短期内不具有厚细胞壁，仅具有薄细胞膜。Praveenkumar等，2014描述了从处于所述有鞭毛阶段的细胞萃取虾青素，其包括将处于有鞭毛阶段的细胞离心，并使用离子液体从所述细胞萃取虾青素[3]。然而，离子液体非常昂贵，因此不适合于虾青素的工业规模萃取。
离心分配色谱(CPC)已被用于从藻类和真菌萃取类胡萝卜素。例如，Marchal等人使用CPC系统，使用生物相容性溶剂从盐生杜氏藻(Dunaliella salina)(D.salina)萃取β-胡萝卜素[4]。与在孢囊阶段含有厚细胞壁的雨生红球藻(H.pluvialis)相反，盐生杜氏藻(D.salina)在任何细胞阶段中不含厚细胞壁，这允许使用溶剂从盐生杜氏藻(D.salina)直接萃取颜料。
CPC系统以及逆流色谱(CCC)系统的优点在于通过优化运行参数，可以降低萃取过程中细胞的破碎和机械应力。因此，经过使用这种优化工艺的萃取方法的细胞可以被重新培养并用于多次萃取[4]。
Du等人[5]使用逆流色谱(CCC)系统从红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)萃取物分离和纯化虾青素。所述富含虾青素的萃取物在用DSMO破碎细胞，然后使用几种溶剂进行几个萃取步骤后获得。将所述萃取物注入到CCC装置中，并使用由正己烷-丙酮-乙醇-水(1:1:1:1，v/v/v/v)构成的双相系统分离，导致从100mg红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)粗提物产出20.6mg虾青素，纯度为92.0％。
然而，对在产率和溶剂消耗方面高效，优选地允许降低溶剂消耗并降低溶剂回收成本的颜料萃取方法，存在着需求。
本发明的目的是一种从微藻萃取颜料、特别是从雨生红球藻(H.pluvialis)萃取虾青素的高效方法。另一个目的是通过用可以提高效率并降低成本的高效工艺步骤代替能量密集型工艺步骤例如生物质的浓缩、干燥和用超临界二氧化碳萃取虾青素，来优化从微藻萃取虾青素。另一个目的是使微藻中富含的颜料例如虾青素可用于使用溶剂直接萃取所述颜料。
发明内容
所述技术难题通过提供一种从微藻萃取颜料的方法得以解决，所述方法包括下述步骤：提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料；使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段和/或破碎所述微藻产生包含所述破碎的微藻和所述颜料的悬液；以及使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻和/或所述悬液萃取所述颜料。
在一个实施方式中，本发明的方法利用微藻的天然细胞周期的性质，使用溶剂直接萃取颜料例如虾青素。在一个实施方式中，本发明的方法与常规虾青素生产的区别在于在胁迫诱导的虾青素产生后，所述颜料不从所述孢囊细胞直接萃取，而是相反，在萃取所述颜料之前诱导有鞭毛细胞阶段，在所述阶段中细胞仅具有薄细胞膜。在一个实施方式中，在通过离心浓缩所述细胞之前或之后诱导所述孢囊细胞的萌发。在一个实施方式中，在萃取所述颜料之前使所述有鞭毛细胞任选地经历机械破碎。
本发明允许使用液-液萃取系统从处于有鞭毛阶段的微藻直接萃取虾青素。由此避免了高成本的过程例如干燥、脱水和使用超临界二氧化碳的萃取，并提高了虾青素萃取的效率。
此外，除了成本和时间效益高之外，本发明的方法的另一个优点在于，在使用长链溶剂例如癸烷或十二烷的一个实施方式中，它可以以对所述微藻细胞来说非侵入性的方式进行，使得可以从微藻萃取虾青素，并且随后可以将所述微藻重新培养以富集虾青素，随后可以在所述微藻内富集虾青素后萃取它们。因此，在一个实施方式中，本发明的方法可以使用相同的微藻原料执行多次。
在下文中将描述本发明的要素。这些要素随着特定实施方式列出，但应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方式。所描述的各种不同实施例和优选实施方式不应被解释为将本发明仅限于所述明确描述的实施方式。这种描述应该被理解为支持并涵盖了组合所述明确描述的实施方式中的两者或更多者或组合所述明确描述的实施方式中的一者或更多者与任何数量的所公开和/或优选的要素的实施方式。此外，本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应该被认为被本申请的说明书所公开，除非上下文指明不是如此。
本发明涉及从微藻萃取颜料的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段，和/或破碎所述微藻以产生包含所述破碎的微藻和所述颜料的悬液，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻和/或从所述悬液萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
在一个实施方式中，所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
在一个实施方式中，所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)破碎所述微藻以产生所述破碎的微藻和所述颜料的悬液，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述悬液萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
在一个实施方式中，所述微藻一开始处于孢囊阶段，并被使用诱导萌发的条件进行诱导以进入有鞭毛阶段。
在一个实施方式中，所述诱导萌发的条件选自光养条件、混合营养条件和异养条件。
在一个实施方式中，其中所述微藻被机械破碎，例如通过使用均质机、研磨机、珠磨机、珠磨法、搅拌机、超声处理、压力循环、微射流机、螺旋压榨机或冻融循环。
在一个实施方式中，所述步骤c)后跟有
步骤d)通过所述溶剂的冷冻干燥、冷冻、蒸发或通过将所述颜料溶解在营养油或另一种溶剂例如有机溶剂、水基溶剂、植物油或深共熔溶剂中或其组合来获得所述颜料。
在一个实施方式中，所述微藻通过营养耗竭、过度曝光、高盐度和/或由所述微藻的遗传修饰引起的过表达而变得富含所述颜料。
在一个实施方式中，所述微藻为绿藻门，优选为绿藻纲，更优选为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。
在一个实施方式中，所述微藻选自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella zofingiensis)、新绿球藻(Neochloris wimmeri)和雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)。
在一个实施方式中，所述液-液萃取系统是膜辅助液-液萃取系统。
在一个实施方式中，所述液-液萃取系统是选自离心分配色谱系统和逆流色谱系统的液-液色谱系统。
在一个实施方式中，所述溶剂在25℃和环境压力下具有至少10毫巴、优选地至少64毫巴的蒸气压。
在一个实施方式中，所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丁-1-醇、二氯甲烷、氯仿、二乙醚、乙基甲基醚、甲苯、苯、酮、1,1-二氯乙烷、环己烷、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲乙酮、甲基环己烷、2,2,4-三甲基戊烷、二甲苯、戊-1-醇、十二烷、癸烷、丙酮、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、甲醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、乙酸、乙二醇、正烷烃和油类例如营养油或其组合，优选地选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚或其组合。
在一个实施方式中，所述颜料是酮基-类胡萝卜素，优选为虾青素。
在一个实施方式中，所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段，并任选地破碎所述微藻以产生包含所述破碎的微藻和所述颜料的悬液，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻和/或从所述悬液萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
详细描述
当在本文中使用时，术语“提供在水性培养基中的微藻”涉及提供用于颜料萃取的微藻。在一个实施方式中，所述提供涉及提供处于孢囊阶段的微藻。所述处于孢囊阶段的微藻可以被诱导进入有鞭毛阶段，以允许从所述有鞭毛阶段直接萃取颜料并因此允许从所述细胞非破碎性萃取。可选地，在一个实施方式中，所述提供可以涉及提供处于孢囊阶段的微藻，其中所述处于孢囊阶段的微藻在所述颜料萃取之前被破碎，并且可以从得到的破碎细胞悬液萃取所述颜料。在一个实施方式中，所述提供涉及提供处于有鞭毛阶段的微藻。在一个实施方式中，所述有鞭毛细胞可用于颜料的直接萃取以及因此非破碎性萃取，和/或所述有鞭毛细胞可以被破碎，并且可以从得到的破碎细胞悬液萃取所述颜料。在一个实施方式中，所述提供涉及提供含有处于孢囊阶段和有鞭毛阶段的微藻两者的混合培养物，其中所述处于孢囊阶段或有鞭毛阶段的微藻各自可以是完整的或破碎的。在一个实施方式中，提供在水性培养基中的微藻不是指提供微藻的干燥生物质并将所述干燥生物质重悬浮在水性培养基中。
当在本文中使用时，术语“萃取”是指一种分离过程，其中使用溶剂将物质例如颜料从物质混合物例如含有富含颜料的细胞的细胞培养基中分离出来。为了允许颜料的高效萃取，所述溶剂应该能够选择性溶解所述颜料并溶解大量颜料。如果使用适合的溶剂作为萃取手段，所述待萃取的物质在所述溶剂中溶解得比在所述物质混合物中更好，因此所述溶剂将所述物质从所述物质混合物中萃取出来。在优选实施方式中，萃取是指从微藻分离颜料的过程。在一个实施方式中，萃取不是指仅仅从颜料混合物例如颜料粗提物或在以前的步骤中从微藻分离的颜料混合物中分离颜料，而是指从微藻分离颜料。在一个实施方式中，从微藻萃取颜料不涉及从干燥的微藻生物质萃取颜料。在一个实施方式中，从微藻萃取颜料不涉及从已经历干燥步骤的微藻萃取颜料。在一个实施方式中，从微藻萃取颜料在<40℃的温度、优选地在环境温度下进行。
当在本文中使用时，术语“颜料”是指作为波长选择性吸收的结果改变被反射或透射的光的颜色的材料。在一个实施方式中，颜料是指选自原始类胡萝卜素例如紫黄素、新黄素、叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素、其他类胡萝卜素例如金盏花黄素、金盏花红素、斑蝥黄素和海胆烯酮、采取游离形式的虾青素以及采取脂肪酸单酯或二酯形式的虾青素的物质。在一个实施方式中，颜料是指叶黄素或酮基-类胡萝卜素。在一个优选实施方式中，颜料是指虾青素。在一个实施方式中，颜料可以以游离形式或衍生物形式例如颜料的脂肪酸酯存在。
当在本文中使用时，术语“富含颜料”是指在微藻细胞内积累颜料。所述微藻可以通过例如营养耗竭、特别是硝酸盐和/或磷酸盐耗竭、过度光照、高盐度和/或代谢工程而变得富含颜料例如虾青素。在一个实施方式中，微藻被遗传工程改造以过表达参与颜料生产的蛋白质。在一个实施方式中，由所述微藻的遗传修饰、即代谢工程改造而引起的参与颜料生产的蛋白质的过表达导致在所述工程化微藻内颜料的过量生产。在一个实施方式中，使选自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella zofingiensis)、新绿球藻(Neochloris wimmeri)和雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)的微藻富集颜料，优选为虾青素。在一个实施方式中，使蓝藻富集颜料。在一个实施方式中，富含颜料的微藻处于孢囊阶段。在一个实施方式中，在从所述微藻萃取所述颜料之前，必须在所述富含颜料并处于孢囊阶段的微藻中诱导有鞭毛阶段。在一个实施方式中，从微藻萃取颜料涉及从已经历孢囊阶段的微藻萃取颜料。
当在本文中使用时，术语“过度光照”是指使微藻经历比所述微藻在正常生理条件下经历的更高强度的光和/或其他波长的光，其中所述经历导致在所述微藻中诱导胁迫状态。
当在本文中使用时，术语“高盐度”是指使微藻经历比所述微藻在正常生理条件下经历的更高浓度的盐和/或其他类型的盐，其中所述经历导致在所述微藻中诱导胁迫状态。
当在本文中使用时，术语“胁迫状态”是指微藻的一个休眠阶段，在所述阶段中所述微藻形成不动孢子(孢囊)。在胁迫状态下，微藻通过形成厚细胞壁变得自我保护，并可能积累高水平的次生类胡萝卜素例如虾青素。在一个实施方式中，胁迫状态通过非生长条件例如在过度光照、高盐度和/或营养耗竭下诱导。在一个实施方式中，在本发明的方法中，微藻的胁迫状态不通过Fe2+来诱导。在一个实施方式中，微藻例如绿色有鞭毛微藻被胁迫以诱导颜料例如虾青素的产生。
当在本文中使用时，术语“酮基-类胡萝卜素”是指含有酮基的类胡萝卜素，其中类胡萝卜素是属于四萜类的有机颜料。
当在本文中使用时，术语“叶黄素”是指由类胡萝卜素类的两种主要分型之一形成的黄色颜料。叶黄素在结构上与胡萝卜素相似，区别在于含有氧原子。叶黄素包含诸如虾青素、玉米黄素和新黄素的物质。
当在本文中使用时，术语“虾青素”是指属于萜烯类别的酮基-类胡萝卜素。虾青素是一种脂溶性颜料，并且可用作膳食增补剂。它表现出红-橙颜色，其源自于所述化合物中心处共轭双键的伸展链。虾青素天然存在于微藻、酵母、鲑鱼、鳟鱼、磷虾、虾、鳌虾、甲壳类以及某些鸟类的羽毛中，并且也可能存在于遗传修饰的生物体例如大肠杆菌细菌中。
当在本文中使用时，术语“微藻”是指作为单细胞物种的微小藻类，其单独地、成串或成组存在。通常，微藻存在于淡水系统或海水系统中。微藻可能生产诸如类胡萝卜素、抗氧化剂、脂肪酸、酶、聚合物、肽、毒素和甾类的产物。在一个实施方式中，微藻是指小球藻(Chlorella zofingiensis)、新绿球藻(Neochloris wimmeri)或雪地衣藻(Chlamydomonasnivalis)，并且还可以是指绿色微藻。在一个实施方式中，术语“微藻”还可以包括蓝藻。在一个优选实施方式中，微藻是指雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。在一个实施方式中，术语“微藻”和“细胞”可互换使用。
当在本文中使用时，术语“培养基”是指用于培养和营养微藻例如雨生红球藻(H.pluvialis)的介质。这种介质可以含有营养物例如氮、磷、钾、硫、铁、镁、钠、钙、氯、锌、铜、硼、钼、锰、镍、钒、维生素B12、生物素和硫胺素。在一个实施方式中，适合的培养基选自Bold改良的基础淡水营养物溶液(BBM)、BG-11培养基、OHM培养基和KM1培养基。在一个实施方式中，所述培养基可以含有采取某种组合的一种或多种上述营养物。此外，可以添加碳源例如葡萄糖、果糖、乙酸盐、甘油、谷氨酸盐、乳酸盐、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、乙酸或任何其他单糖、二糖、寡糖或多糖。
当在本文中使用时，术语“孢囊阶段”是指微生物例如微藻的一种休眠阶段。微生物的孢囊形成允许抵抗不利环境中的条件例如缺少营养物或氧、极端温度、缺少水分和存在有毒化学品。微生物例如雨生红球藻(H.pluvialis)可能在其孢囊阶段中具有刚性细胞壁结构，其由包括三层鞘(TLS)、次生壁(SW)和三生壁(TW)的几个层构成。
当在本文中使用时，术语“有鞭毛阶段”是指微藻的一个阶段，其中所述微藻以具有一个或多个鞭毛为特征。在一个实施方式中，处于有鞭毛阶段的微藻是能动的。在一个实施方式中，处于有鞭毛阶段的微藻不具有厚细胞壁。在一个实施方式中，可以通过诱导萌发的条件将处于孢囊阶段的微藻诱导进入有鞭毛阶段，导致失去在所述孢囊阶段中存在的厚细胞壁。在一个实施方式中，富集在处于孢囊阶段的微藻细胞中的颜料保留在所述一开始处于孢囊阶段并随后进入有鞭毛阶段的细胞中，直至直接从所述细胞或从处于破碎形式的所述细胞萃取所述颜料。雨生红球藻(H.pluvialis)的有鞭毛阶段不包含孢囊阶段的雨生红球藻(H.pluvialis)的刚性细胞壁结构。处于有鞭毛阶段的雨生红球藻(H.pluvialis)被薄细胞膜包围。在一个实施方式中，被诱导进入有鞭毛阶段的雨生红球藻(H.pluvialis)细胞保留在处于孢囊阶段期间富集在所述细胞内的虾青素。在本发明的一个实施方式中，在雨生红球藻(H.pluvialis)的有鞭毛阶段中缺少厚细胞壁，使得能够使用所述没有厚细胞壁的细胞执行高效的虾青素萃取方法。在一个实施方式中，将细胞内虾青素从处于有鞭毛阶段的微藻直接萃取到溶剂中而不需所述微藻的机械破碎。
当在本文中使用时，术语“诱导萌发的条件”是指在微生物例如微藻中诱导萌发的条件。在一个实施方式中，根据本发明所述的“诱导萌发的条件”中的温度范围是10℃至35℃之间，优选为20℃至30℃之间。在一个实施方式中，“诱导萌发的条件”和“生长条件”同义使用。在微藻例如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中诱导萌发的条件可以选自例如光养、混合营养和异养条件。在一个实施方式中，所述条件包含选自氮、磷、钾、硫、铁、镁、钠、钙、氯、锌、铜、硼、钼、锰、镍、钒、维生素B12、生物素和硫胺素的一种或多种组分。在一个实施方式中，所述诱导萌发的条件是光养萌发条件，并包括0.01至10％v/v的CO2含量、0.01至5vvm的通气量和光。在一个实施方式中，使用波长范围为300nm至800nm的光，优选地使用更大量的400nm至500nm和/或550nm至700nm范围内的光。光强度(光子通量密度)通常在10至10000μmol m-2s-1的范围内。
在一个实施方式中，所述诱导萌发的条件是混合营养萌发条件，并包括0.01至10％v/v的CO2含量、0.01至5vvm的通气量、光以及碳源例如乙酸盐、乙酸、甘油、谷氨酸盐、乳酸盐、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和/或糖类例如葡萄糖和果糖或任何其他的单糖、二糖、寡糖或多糖。在一个实施方式中，使用波长范围为300nm至800nm的光，优选地使用更大量的400nm至500nm和/或550nm至700nm范围内的光。光强度(光子通量密度)通常在10至10000μmol m-2s-1的范围内。
在一个实施方式中，所述诱导萌发的条件是异养条件，并包括碳源例如乙酸盐、乙酸、甘油、谷氨酸盐、乳酸盐、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和/或糖类例如葡萄糖和果糖或任何其他的单糖、二糖、寡糖或多糖，并使用0.01至5vvm空气的通气量。
在一个实施方式中，诱导萌发的条件被用于诱导富含颜料、优选地富含虾青素的微藻进入有鞭毛阶段。在一个实施方式中，在富含颜料、优选地富含虾青素的微藻中诱导萌发。在一个实施方式中，在微藻富集颜料之前不在所述微藻中诱导萌发。
当在本文中使用时，术语“悬液”是指含有固体粒子并且也可能含有溶质的非均质混合物。在一个实施方式中，悬液含有液体和处于孢囊阶段和/或有鞭毛阶段的微藻。在一个实施方式中，悬液含有液体和破碎的微藻，其中所述破碎的微藻可以源自于处于孢囊阶段或有鞭毛阶段的微藻细胞。在一个实施方式中，悬液不含源自于干燥的微藻生物质的微藻。在一个实施方式中，悬液含有液体和处于孢囊阶段和/或有鞭毛阶段的微藻，并含有破碎的微藻。在一个实施方式中，术语“细胞悬液”与术语“发酵液”或“细胞发酵液”同义使用。
当在本文中使用时，术语“发酵液”或“细胞发酵液”是指含有处于有鞭毛阶段和/或孢囊阶段的微藻细胞和/或破碎细胞的培养基或不同的水性介质，其中所述破碎细胞是破碎的有鞭毛细胞和/或破碎的孢囊细胞。在一个实施方式中，发酵液、细胞发酵液和藻类发酵液可互换使用。
当在本文中使用时，术语“破碎所述微藻”是指破坏微藻细胞完整性的过程，其中得到的细胞被称为“破碎细胞”。通过破碎微藻，所述微藻细胞内部的组分得以释放，例如储存在所述细胞内的颜料如虾青素。破碎微藻可以例如通过机械破碎所述细胞来进行，例如使用均质机、研磨机、珠磨机、珠磨法、搅拌机、超声处理、压力循环、微射流机、螺旋压榨机或冻融循环。“破碎细胞”是指源自于处于孢囊阶段或有鞭毛阶段的细胞的被破碎的细胞。在一个实施方式中，破碎微藻是指破碎悬液中的微藻，即包含在液体例如细胞培养发酵液中的微藻。在一个实施方式中，破碎微藻不是指破碎干燥的微藻生物质。在一个实施方式中，在所述微藻富集颜料之间，即在提供富含颜料的微藻的步骤与破碎所述微藻的步骤之间，不将微藻干燥。
当在本文中使用时，术语“液-液色谱系统”是指利用液体流动相和液体固定相的色谱系统.在一个实施方式中，所述液-液色谱系统是指利用液体流动相和在离心力场的帮助下保持在所述系统中的液体固定相的色谱系统。在液-液层析中，混合物的物质分离由所述物质在两种不混溶的液体相之间的分配产生。在一个实施方式中，液-液色谱系统是指逆流色谱系统(CCC)或离心分配色谱系统(CPC)。
当在本文中使用时，术语“离心分配色谱”或“CPC”是指其中固定和流动相均为液体，并且所述固定相通过离心力场的施加而被固定的色谱技术。离心分配色谱系统包含萃取区室的互连网络。环状盘和环状板是CPC系统的核心。区室在所述利用通道彼此相连的环状盘中磨碎。在每个环状盘之间存在环状板，其将环状盘的最后一个区室通过孔与下一个环状盘相连。所述环状盘和环状板交替放置在彼此顶上，并固定在离心机的轴上。通过旋转产生离心力，这是一个相保留在区室内(固定相)而另一个相(流动相)从一个区室泵向另一个区室的原因。所述流动相从一个区室泵向另一个区室，并且如果它是密度较大的相将朝向离心力场流过所述固定相(这种模式被称为下降模式)，或者如果所述流动相是密度较低的相将以向心方向流动(上升模式)。可商购的CPC系统可用于执行根据本发明所述的萃取颜料的方法。
所述有机溶剂通过施加离心力场在CPC系统的区室中保持固定。CPC系统允许利用离心提高萃取效率，因为水性相例如细胞悬液在有机相中的分散被增强。必须找出适合的溶剂，其在水中具有低溶解性，可以在CPC系统中保持固定，并且能够从处于有鞭毛阶段的微藻或从破碎的处于孢囊阶段或有鞭毛阶段或两者的微藻萃取虾青素。在萃取虾青素并在所述溶剂饱和后，在所述CPC系统内将所述含有虾青素的溶剂用泵入到所述CPC系统中的水代替，并由此获得所述含有虾青素的溶剂。在一个实施方式中，通过所述溶剂的蒸发对所述得到的含有虾青素的溶剂进行处理，由此获得浓缩的虾青素。因此，本发明的方法是非常高效的过程，允许修改和/或代替虾青素萃取中的耗能且耗时的工艺步骤，例如生物质的干燥、机械细胞破碎和二氧化碳萃取。
当在本文中使用时，术语“逆流色谱”或“CCC”是指其中流动和固定相均为液体，并且所述固定相通过离心力场的施加而被固定的液-液层析技术。CCC柱是盘绕在以行星运动方式旋转的绕线轴上的开口管。CCC绕线轴中的行星运动改变了离心力场的强度和方向。在高离心力场下发生相倾析(沉降)，而在离心力场反转时，所述两个相混合并允许目标化合物的传质/萃取。混合区和沉降区沿整个管的长度依次分布。与CPC相似，CCC装置可以以上升模式(流动相是密度较低的相)或以下降模式(流动相是密度较高的相)运行。可商购的CCC系统可用于执行根据本发明所述的萃取颜料的方法。
利用施加的离心力场，所述有机溶剂在CCC系统的盘管中保持固定。CCC系统允许利用离心提高萃取效率，因为水性相例如细胞悬液在有机相中的分散被增强。必须找出适合的溶剂，其在水中具有低溶解性，可以在CCC系统中保持固定，并且能够从处于有鞭毛阶段的微藻或从破碎的处于孢囊阶段或有鞭毛阶段或两者的微藻萃取虾青素。在萃取虾青素并在所述溶剂饱和后，在所述CCC系统内将所述含有虾青素的溶剂用泵入到所述CCC系统中的水代替，并由此获得所述含有虾青素的溶剂。在一个实施方式中，通过所述溶剂的蒸发对所述得到的含有虾青素的溶剂进行处理，由此获得浓缩的虾青素。因此，本发明的方法是非常高效的过程，允许修改和/或代替虾青素萃取中的耗能且耗时的工艺步骤，例如生物质的干燥、机械细胞破碎和二氧化碳萃取。
当在本文中使用时，术语“液-液萃取系统”是指一种从微藻萃取颜料的手段，其中所述萃取使用两种液相来进行。在一个实施方式中，所述液-液萃取系统是指选自液-液色谱系统例如离心分配色谱和逆流色谱以及膜辅助液-液萃取系统的系统。在一个实施方式中，所述液-液萃取系统选自离心分配色谱、逆流色谱和膜辅助液-液萃取。在一个实施方式中，液-液萃取是指从包含在液体、优选地包含在细胞培养发酵液中的微藻萃取颜料，其中所述微藻优选是活的。在可选实施方式中，液-液萃取是指从破碎的微藻萃取颜料，其中所述破碎的微藻被包含在液体中，优选地包含在细胞培养发酵液中。在一个实施方式中，在从微藻萃取颜料之前或期间，所述微藻不被干燥。在一个实施方式中，液-液萃取不是指从干燥的生物质萃取，并且不是指从悬浮在液体中的干燥的生物质萃取。
当在本文中使用时，术语“膜辅助液-液萃取”是指一种萃取化合物例如颜料的方法，其包括被膜分隔开的两个液体相。在所述膜的每个孔口处形成液-液界面，并且所述膜充当进料(发酵液)和萃取相(溶剂或溶剂的混合物)之间的物理分隔屏障。通过在所述膜一侧上的略微超压使所述液-液界面稳定。在一个实施方式中，膜辅助液-液萃取包括使用中空纤维接触器以允许两个液体相通过微孔膜的无弥散接触。在一个实施方式中，所述两种液体是有机溶剂相和藻类发酵液，并且包含在所述发酵液中的颜料将根据其分配系数在所述相之间分配。在一个实施方式中，使用中空纤维接触器进行萃取与常规液-液萃取装置例如混合器-沉降器系统相比具有几个优点，即不需要一个相在另一个相中的分散并且在萃取后不需所述两个相的分离，不存在形成稳定乳液的危险，所述两个液体相可以具有相同的密度，所述两个相可以具有不同温度，并且存在大的比交换表面。在一个实施方式中，所述膜辅助液-液萃取是指渗透萃取和/或膜支撑萃取。在一个实施方式中，通常用于萃取系统的聚合物是聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)和/或聚四氟乙烯(PTFE)。
当在本文中使用时，术语“硝酸盐”是指具有分子式NO3的多原子离子、NH4 +、尿素及其盐或衍生物。所述术语还包含所述多原子离子的盐，例如无机硝酸盐包括硝酸钾、硝酸铵、硝酸钠、硝酸钙、硝酸镁。所述术语还涉及其他形式的硝酸盐，例如采取来自于氨基酸例如天冬酰胺的氨基的形式。
当在本文中使用时，术语“磷酸盐”是指磷酸根离子即PO4 3-及其盐或衍生物。所述术语还涉及无机磷酸盐，例如磷酸钠、磷酸钙、磷酸钾、磷酸铷和磷酸铵。
当在本文中使用时，术语“获得颜料”是指允许以适合于储存、运输和/或商业和/或科学配送的形式获得感兴趣的颜料的任何过程。此类过程可以是例如冷冻干燥所述颜料，干燥所述颜料，冷冻所述颜料，将所述颜料溶解在溶剂例如有机溶剂、水基溶液、植物油、深共熔溶剂或其混合物中，以及将所述颜料溶解在药品或营养品可接受的溶剂例如营养油中。在一个实施方式中，所述获得是指从溶剂获得所述颜料，例如通过所述溶剂的蒸发。在一个实施方式中，所述颜料通过将所述颜料溶解在营养油中来获得，并任选地随后加工成用于药品或营养品给药的胶囊。在一个实施方式中，所述颜料通过将所述颜料溶解在溶剂或包含一种或多种有机溶剂、水基溶液、植物油和/或深共熔溶剂的溶剂混合物中来获得。
当在本文中使用时，术语“绿藻门”是指绿藻的一个门类。
当在本文中使用时，术语“绿藻纲”是指绿藻的一个纲，其通常具有特征性的鞭毛排布。
当在本文中使用时，术语“雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)”或“雨生红球藻(H.pluvialis)”是指绿藻门的一个淡水物种，其属于绿藻纲。雨生红球藻(H.pluvialis)通常产生虾青素，并且虾青素在不利的环境条件例如高光强度、低营养物可利用性或高盐度下在其孢囊阶段中积累。在一个实施方式中，所述不利环境条件取决于生物质浓度、营养物供应、混合、通气量和光源到反应器的距离。在一个实施方式中，所述高光强度是指50至10.000μmol m-2s-1的光子通量密度。在一个实施方式中，低营养物可利用性可以是指低至0mM硝酸盐和/或0mM磷酸盐的浓度。在一个实施方式中，高盐度是指高达10wt％NaCl的浓度。雨生红球藻(H.pluvialis)可能以三种细胞形式之一存在；首先是能动的双鞭毛阶段，其次是不能动的裸露的胶群体阶段，第三是不能动的厚壁不动孢子阶段(也被称为孢囊阶段)。虾青素通常在孢囊阶段中积累在核周细胞质中的微滴中。
当在本文中使用时，术语“溶剂”是指溶解溶质例如虾青素以产生溶液的物质。存在极性和非极性溶剂。在本发明的方法中可以使用溶剂例如甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丁-1-醇、二氯甲烷、氯仿、二乙醚、乙基甲基醚、甲苯、苯、酮、1,1-二氯乙烷、环己烷、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲乙酮、甲基环己烷、2,2,4-三甲基戊烷、二甲苯、戊-1-醇、十二烷、癸烷、丙酮、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、甲醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、乙酸、乙二醇、正烷烃例如正庚烷和油类例如营养油或其组合。在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂是包含两种或更多种溶剂的溶剂混合物。在一个实施方式中，在根据本发明所述的从微藻萃取颜料的方法中，可以使用一种溶剂或溶剂的混合物萃取所述颜料。在一个实施方式中，术语“溶剂”还可以是指疏水性深共熔溶剂。在一个实施方式中，疏水性深共熔溶剂通过将氢键供体与氢键受体混合来产生。当在本文中使用时术语“溶剂”不是指离子性液体。在一个实施方式中，当从所述有鞭毛微藻萃取所述颜料，其中所述有鞭毛微藻不被破碎时，所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丁-1-醇、二氯甲烷、氯仿、二乙醚、乙基甲基醚、甲苯、苯、酮、1,1-二氯乙烷、环己烷、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲乙酮、甲基环己烷、2,2,4-三甲基戊烷、二甲苯、戊-1-醇、十二烷、癸烷、丙酮、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、甲醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、乙酸和乙二醇或其组合，优选地选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚。在一个实施方式中，当从破碎的微藻萃取所述颜料时，所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丁-1-醇、二氯甲烷、氯仿、二乙醚、乙基甲基醚、甲苯、苯、酮、1,1-二氯乙烷、环己烷、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲乙酮、甲基环己烷、2,2,4-三甲基戊烷、二甲苯、戊-1-醇、十二烷、癸烷、丙酮、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、甲醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、乙酸、乙二醇、正烷烃和油类例如营养油。在一个实施方式中，所述溶剂是溶剂的混合物，优选为乙酸乙酯、丁-1-醇和乙酸异丙酯的混合物或营养油与乙酸乙酯、乙醇和甲醇中的任一者的混合物，其中所述营养油优选地用乙酸乙酯、乙醇和甲醇中的任一者饱和。在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂是不与水混溶或与水部分混溶的溶剂，例如乙酸乙酯或甲基叔丁基醚，其任选地与醇、优选为乙醇混合。
当在本文中使用时，术语“固定相”是指色谱系统内允许样品分离的被固定的固体或液体物质。在一个实施方式中，所述固定相优选为色谱系统内被固定的液体物质。
当在本文中使用时，术语“流动相”是指在色谱系统内溶解和/或运载样品化合物，允许所述样品混合物与固定相相互作用的液体。在一个实施方式中，所述流动相含有待萃取的颜料。在一个实施方式中，所述流动相含有富含颜料的微藻，其中存在于所述流动相中的所述微藻可能是完整的并处于有鞭毛阶段，和/或破碎的并处于孢囊阶段，和/或破碎的并处于有鞭毛阶段。在一个实施方式中，所述包含在流动相中的颜料细胞内存在于所述微藻中或细胞外存在于细胞培养基中。
当在本文中使用时，术语“蒸气压”是指物质的挥发性的一种指标，并由在密闭系统中，在给定温度下，与其冷凝相处于热力学平衡的蒸气所施加的压力来定义。具有高蒸气压的物质通常被称为挥发物。在一个实施方式中，所述蒸气压是指在室温和环境压力下的给定蒸气压。当在本文中使用时，术语“高蒸气压”是指至少10mbar的蒸气压。在一个实施方式中，高蒸气压是指在25℃和环境压力下至少64mbar(例如庚烷)、至少124mbar(例如乙酸乙酯)或至少333mbar(例如甲基叔丁基醚)。在一个优选实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂具有高蒸气压。
当在本文中使用时，术语“油”是指在环境温度下是粘稠液体，并且既疏水又亲脂的任何非极性化学物质。油可以源自于动物来源、植物来源、其他生物体来源或石化来源。在一个实施方式中，当从破碎的细胞萃取虾青素时，使用油作为溶剂。在一个实施方式中，当从破碎的细胞萃取虾青素时，使用可食用植物或动物油作为溶剂，例如橄榄油、玉米油或葵花籽油。在一个实施方式中，使用油例如营养油作为用于所述颜料的溶剂，导致最终产品是包含颜料的油。
附图说明
现在，参考下述附图来进一步描述本发明。
图1是根据本发明使用CPC系统萃取物质的示意图。
在虾青素萃取开始时，CPC系统装有溶剂或溶剂混合物，并开始旋转。随后，将水泵入到CPC系统中充当流动相，并在CPC系统内将一部分溶剂即固定相用所述流动相代替，其中所述代替依赖于所述泵的流速和旋转速度(图1A)。
随后将发酵液泵入到CPC系统中。在所述CPC系统中发生物质转移，以便将虾青素从处于有鞭毛阶段的微藻萃取到所述溶剂中(图1B)。
可选地，在一个实施方式中，所述发酵液可以含有破碎的细胞，以便从所述含有由破碎细胞释放的虾青素的发酵液萃取虾青素。可选地，在一个实施方式中，所述发酵液可以既含有处于有鞭毛阶段的完整细胞又含有破碎的细胞，以便从完整的有鞭毛细胞和含有由破碎细胞释放的虾青素的发酵液两者萃取虾青素。
将所述发酵液泵入到CPC系统中，直至所述溶剂被虾青素饱和(图1C-E)。所述萃取过的细胞从最后一个区室在出口处离开CPC系统(图1D、E)。
在所述溶剂被虾青素饱和后，将水泵出最后一个区室，以从第一个区室收集所述饱和的溶剂(图1F)。含有虾青素的溶剂被完全推出所述CPC系统，并因此被收集。可以将所述溶剂蒸发以获得虾青素(图1G)。
所述萃取过程可以被重复任何次数。
图2是示例性膜辅助萃取系统的示意图。展示了虾青素从细胞发酵液通过膜的孔眼向溶剂的转移。在时间t开始时，示例性溶剂或溶剂混合物与含有虾青素的发酵液发生接触。随着时间流逝，虾青素穿过所述孔眼并溶解在所述溶剂或相应的溶剂混合物中。在无限长时间t∞后，虾青素根据其分配系数在所述相之间分配。
在典型的运行中，一种流体相(润湿相)由于毛细管力而填充膜孔，另一种流体相是非润湿的。在一个实施方式中，使用疏水膜。示例性溶剂(或溶剂混合物)是所述润湿相，而所述水性藻类发酵液是所述非润湿相。溶剂(或溶剂混合物)填充所述膜的孔眼。在一个实施方式中，为了使孔口处的液-液界面稳定，将所述非润湿流体保持在略微更高的压力下，产生大约0.1bar的跨膜压力。在优选实施方式中，为了使孔口处的液-液界面稳定，将所述非润湿流体保持在略微更高的压力下，产生0.01-0.1bar范围内的跨膜压力。
图3示出了在诱导萌发后0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h和64h，使用甲基叔丁基醚作为溶剂从萌发的雨生红球藻(H.pluvialis)细胞萃取虾青素的产率。所述产率根据公式2计算。
图4示出了在诱导萌发后48h部分萃取的雨生红球藻(H.pluvialis)细胞的显微镜图像。对于所述萃取来说，将1mL萌发的藻类发酵液与5mL甲基叔丁基醚混合。
图5示出了在0h(诱导萌发后立即)和诱导萌发后24h，使用不同溶剂(正庚烷、丁-1-醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷)获得的萃取物中的虾青素浓度。
图6描绘了在t＝诱导萌发后0h和24h时，使用溶剂丁-1-醇、庚烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷(从左至右)的摇瓶实验。
图7示出了对于0.5mL的进样体积和三种不同洗脱时间6.9min、18.9min和36.9min来说，使用运行条件A获得的第一收集级分中虾青素的萃取量、摇瓶实验中的虾青素萃取量和产率Y萃取物。
图8示出了运行条件C的三种不同进样体积2mL(t洗脱＝8.40min)、5mL(t洗脱＝11.4min)和10mL(t洗脱＝16.4min)得到的产率Y萃取物。对所有收集的级分的虾青素含量和进样样品的虾青素含量(进样的发酵液的虾青素量)进行定量，以计算产率(Y萃取物)。
图9示出了运行条件C的三种不同进样体积2mL、5mL和10mL的进样藻类发酵液的级分1、级分2和剩余级分的虾青素浓度。随着进样体积增加，可以看到收集的级分1和2中虾青素浓度提高。使用10mL-1的进样体积，原始的进料虾青素浓度65mg L-1在级分1和2中被浓缩到507mg L-1和302mg L-1。
图10示出了膜辅助液-液萃取的原理。
A)允许两种流体通过微孔膜的无弥散接触的平行管中空纤维接触器的横截面的示意图。在所述膜的每个孔口处形成流体-流体界面。通过在所述膜的一侧上略微超压，使所述流体-流体界面稳定。所述膜充当进料与萃取相(溶剂或溶剂的混合物)之间的物理分隔屏障。溶质在所述两个相中的浓度梯度是跨流体-流体界面的物质转移和溶质从一个流体相(进料)萃取到另一个流体相(萃取相)中的驱动力。
B)用于从藻类发酵液萃取虾青素的中空纤维接触器中试装置的流程图。将右侧储池中的藻类发酵液泵入到中空纤维的管中，将左侧储池中的溶剂泵入到外壳一侧。两个料流同向流动并被再循环。
图11示出了根据本发明使用CPC/CCC系统萃取物质的另一个示意图。
在虾青素萃取开始时，CPC/CCC系统装有溶剂或溶剂混合物，并开始旋转。随后，将水泵入到CPC/CCC系统中充当流动相，并在CPC/CCC系统内将一部分溶剂即固定相用所述流动相代替，其中所述代替依赖于所述泵的流速和旋转速度(图11A).
随后将发酵液泵入到CPC/CCC系统中(图11B)。在所述CPC/CCC系统中发生物质转移，以便将虾青素从处于有鞭毛阶段的微藻萃取到所述溶剂中(图11C、D)。可选地，在一个实施方式中，所述发酵液可以含有破碎的细胞，以便从所述含有由破碎细胞释放的虾青素的发酵液萃取虾青素。可选地，在一个实施方式中，所述发酵液可以既含有处于有鞭毛阶段的完整细胞又含有破碎的细胞，以便从完整的有鞭毛细胞和含有由破碎细胞释放的虾青素的发酵液两者萃取虾青素。
将所述发酵液泵入到CPC/CCC系统中，直至所述溶剂被虾青素饱和(图11C-E)。所述萃取过的细胞从出口的末端离开CPC/CCC系统(图11E)。
在预定的切换时间t洗脱后，将所述固定相推出所述柱。这可以通过改变所述流动相(水)的流动方向、从下降模式切换到上升模式(图11F、G选项1)或通过以下降模式泵送溶剂(图11F、G选项2)来实现。在两种情况下，含有虾青素的溶剂被完全推出所述CPC/CCC系统并收集。在图11F、G中，示出了分级的固定相，从最浓的级分开始编号。可以将所述溶剂蒸发以获得虾青素。
所述萃取过程可以被重复任何次数。
图12示出了对于2mL、5mL和10mL的进样体积来说，在200bar下高压均化的生物质的级分1、级分2、级分3和剩余级分的虾青素浓度，进样的虾青素浓度和计算的产率Y进料。使用10mL的进样体积，原始的进料虾青素浓度254mg L-1在级分1和2中被浓缩到2771mg L-1和2376mg L-1。
图13示出了对于10mL的进样体积来说，在200bar下高压均化的生物质的收集的级分1、级分2、级分3和剩余级分。使用10mL的进样体积，原始的进料虾青素浓度254mg L-1在级分1和2中被浓缩到2771mg L-1和2376mg L-1。
图14示出了使用膜辅助液-液萃取，在富水相和溶剂中的虾青素油性树脂浓度。在1410min的萃取时间后，水中的虾青素油性树脂浓度从23.77mg L-1降低到5.05mg L-1，而在溶剂中达到31.7mg L-1的终浓度。
图15示出了使用膜辅助液-液萃取，藻类发酵液(萌发的)和溶剂中的虾青素含量。在165min的萃取时间后，藻类发酵液中的虾青素含量从10.9mg降低到0.32mg，而溶剂中的含量提高到1.4mg。
实施例
实施例1：微藻培养
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(SAG编号192.80)购自德国哥廷根大学藻类培养物保藏中心(Culture Collection of Algae at the University of
Figure BDA0003128312940000211
Germany)(SAG)。作为培养基，使用Bold改良的基础淡水营养物溶液(BBM)。它通过将20mL来自于Sigma-Aldrich(Taufkirchen,Germany)的Bold改良的基础淡水营养物溶液(50×浓缩物)用980mL去离子水稀释来制备，得到下述组成(每升)：11.42mg H3BO3，25.0mg CaCl2·2H2O，0.49mg Co(NO3)2·6H2O，1.57mg CuSO4·5H2O，50.0mg EDTA(游离酸)，4.98mgFeSO4·7H2O，75mg MgSO4·7H2O，1.44mg MnCl2·4H2O，0.71mg MoO3，0.003mg NiCl2·6H2O，31.0mg KOH，0.003mg KI，175.0mg KH2PO4，75mg K2HPO4，25mg NaCl，250.0mg NaNO3，0.002mg Na2SeO3，0.001mg SnCl4，0.0022mg VOSO4·3H2O和8.82mg ZnSO4·7H2O。此外，向所述培养基添加1.64g乙酸钠(分子生物学等级，>99.0％)。将pH调整到6.8。
将部分雨生红球藻(H.pluvialis)菌落从琼脂板转移到250mL锥形摇瓶中，并在150mL BBM+20mM乙酸钠中培养。将所述培养物在摇床上在24℃培养16天，直至在750nm处的光密度(OD)达到0.6。光由一个光强度(光子通量密度)为50μmol m-2s-1的冷荧光灯持续供应。随后，将发酵液转移到2000mL锥形瓶中，装入新鲜培养基(工作体积为1600mL)，并在前述条件下温育14天。该发酵液被用作在总体积为22升的自己设计的敞池中进行培养的接种物。将750nm处的初始OD调整到0.1，并使用8升的工作体积。每24小时一次通过添加蒸馏水补偿由蒸发造成的失水。将所述敞池在24±1℃的恒定室温下，用两个光强度(光子通量密度)为100μmol m-2s-1的冷荧光灯持续照射14天。
在750nm处的OD为0.8下，通过将光强度(光子通量密度)提高到250μmol m-2s-1持续7天，进行虾青素合成的诱导(虾青素在细胞中的富集)。
实施例2：萌发的诱导
为了诱导雨生红球藻(H.pluvialis)孢囊细胞的萌发，将400mL孢囊培养发酵液转移到500mL锥形瓶中，并在50μmol m-2s-1的光强度(光子通量密度)和24±1℃的温度下，在摇床(175rpm)上放置24小时。随后将发酵液以5500rpm离心2min并舍弃上清液。将孢囊生物质悬浮在新鲜的BBM+20mM乙酸钠中，并将30mL转移到50mL锥形瓶中，使750nm处的OD为4。在摇床上的培养条件与实施例1中所述相同。
实施例3：溶剂适合性
报告了几种溶剂的相关物理性质(表1)。溶剂根据它们从萌发的藻类细胞萃取虾青素的能力、在水中的最大溶解性、它们的疏水性和汽化焓进行选择。
表1：所测试的溶剂的物理性质[6].
Figure BDA0003128312940000231
实施例4：生物质浓度的确定
一式四份确定了干重(DW)生物质浓度。将1mL培养物等分试样转移到2mL微量离心管中，以5500rpm离心5min并舍弃上清液。将生物质用蒸馏水清洗，在以5500rpm离心后舍弃上清液，并将潮湿的生物质储存在-80℃，随后冷冻干燥。将冷冻干燥的样品称重并计算生物质浓度。为此，称量在冷冻干燥之前的空管和冷冻干燥之后带有生物质的每个Eppendorf管的重量。将每个管的干重生物量(DW)除以1mL。
实施例5：虾青素定量
为了确定藻类发酵液中的虾青素含量，使用Satorius天平(
Figure BDA0003128312940000241
Germany)称出5mg DW。对于细胞均化来说，将所述生物质用研钵和研杵处理。通过添加10mL二氯甲烷实现虾青素从破碎细胞的萃取。将所述萃取重复三次，直至细胞碎片无色。将富含虾青素的二氯甲烷萃取物用来自于Heidolph Instruments(Schwabach,Germany)的旋转蒸发仪蒸发，并使用Taucher等人[7]的方法在室温和暗处皂化3h。为此，向萃取的虾青素添加2.25mL丙酮、0.25mL MeOH和0.5mL0.05M NaOH在MeOH中的溶液。然后添加3mL石油醚。将所述混合物用3mL 10wt％NaCl水溶液洗涤，并以5500rpm离心2min，舍弃下层相。将所述使用NaCl溶液的洗涤步骤再重复两次。蒸发掉有机相，将萃取的虾青素溶解在3mL用于HPLC方法的溶剂B(甲醇：MTBE：水，8:89:3，v/v)中，并通过来自于Berrytec(Grünwald,Germany)的0.22μm一次性尼龙注射式滤器过滤。
将所述去酯化的虾青素样品用高效液相色谱装置(HPLC装置)(LC-20AB高效液相色谱，Shimadzu,Japan)进行分析，所述装置由YMC Carotenoid柱(C30，3μm，150×4.6mm，YMC Co.,Japan)和二极管阵列检测器(SPD-M20A高效二极管阵列检测器，Shimadzu,Japan)组成。作为流动相，使用具有下述梯度的溶剂A(甲醇：MTBE：水，81:15:4，v/v)和溶剂B(甲醇：MTBE：水，8:89:3，v/v)：2％溶剂B 11min，7min内从2％溶剂B至40％溶剂B的线性梯度，40％溶剂B 6.5min，然后是2.5min内直至100％溶剂B的线性梯度，100％溶剂B 3min，3min内直至2％溶剂B的线性梯度，保持7min。流速为1mL min-1，进样体积为10μl，并且柱温保持在22℃。对于虾青素定量来说，使用来自于Dr.Ehrenstorfer GmbH(Augsburg,Germany)的化学标准品产生校准曲线。二极管阵列检测器的信号在478nm处记录。
实施例6：萌发的雨生红球藻(H.pluvialis)细胞的最佳萃取时间
为了确定从萌发的细胞萃取虾青素的理想时间，如实施例2中所述制备了具有8小时时间间隔的两种用于萌发的培养物，即培养物1和培养物2。为了确定虾青素产率，在萌发开始后0h、16h、24h、40h、48h和64h(培养物1)以及8h、32h和56h(培养物2)进行了一次摇瓶萃取实验。在每个所提到的时间点，将1mL藻类发酵液转移到15mL falcon管中。添加5mL甲基叔丁基醚，并使用来自于bioSan(Riga,Latvia)的Multi Bio RS-24将所述二元混合物在24±1℃的室温下剧烈振摇30min。随后，为了分离所述相，将样品以5500rpm离心2min。取出4mL富含虾青素的甲基叔丁基醚相并用来自于Heidolph Instruments(Schwabach,Germany)的旋转蒸发仪蒸发。使用实施例5中描述的HPLC方法定量所述萃取物中的虾青素含量。分别如实施例4和实施例5中所述定量所有研究的时间间隔的藻类发酵液的生物质浓度和虾青素含量。萃取物中的虾青素质量、藻类发酵液中的虾青素质量和产率展示在图3中。
从萌发的细胞萃取虾青素的最佳时间被确定是在诱导萌发后24h至32h之间(图3)。按照公式3计算的萃取产率在24h至32h之间几乎恒定，产率达到藻类发酵液中可用的总虾青素的56至60％。在40h后，产率降低到31％，并在诱导萌发后64h进一步降低到17％。在所调查的时间范围内，藻类发酵液中的虾青素含量保持恒定。32h后产率的降低由萌发的细胞的形态学变化引起。越来越多的萌发细胞失去它们的鞭毛并建立起强壮的细胞结构，对甲基叔丁基醚的通透性降低(图4)。
采用时间点t＝0h(萃取在添加新培养基后立即进行)和t＝诱导萌发后24h来确定表1中示出的溶剂的萃取效率。图5示出了在所提到的时间将5mL每种溶剂与1mL进料混合后，萃取相的庚烷、丁-1-醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷中的虾青素浓度。在t＝0h至t＝24h之间，由于萌发的藻类细胞数目的增加，每种溶剂的萃取效率逐渐提高。在诱导萌发后24h，所测试的溶剂的萃取效率的顺序为[甲基叔丁基醚]>[二氯甲烷]>[乙酸乙酯]>[丁-1-醇]>[庚烷](图5和图6)。
实施例7：使用逆流色谱(CCC)和离心分配色谱(CPC)系统的萃取
CCC实验在逆流色谱柱上进行，所述柱来自于Dynamic Extractions(Wales)，型号为HPCCC-Mini Centrifuge(0.8mm i.d.)，具有0.5至0.78之间的β-值和18.2mL的柱体积。两个装备有806Manometric模块(Gilson,USA)的等度Gilson 306泵(Gilson,USA)被用于递送流动和固定相。
CCC萃取实验使用甲基叔丁基醚作为萃取溶剂进行。因此，将甲基叔丁基醚与BBM+20mM乙酸钠培养基在24±1℃的室温下搅拌2小时。使用分液漏斗将所述平衡的系统分成富含溶剂的上层相和富含培养基的下层相。将所述相在超声波水浴中脱气。通过用所述富含溶剂的相即固定相装柱来准备CCC装置。旋转被设定在1900rpm，并将用甲基叔丁基醚饱和的培养基(流动相)以1mL min-1的流速F，以下降模式泵入。在柱中达到平衡条件后，将萌发的生物质通过进样环进样到柱中。在相应的洗脱时间(对于每种运行条件来说示出在表2中)后，将固定相推出所述柱。这通过从下降模式切换到上升模式来进行。将所述固定相分级在2mL HPLC小瓶中，直至不再有固定相从柱中出来。将所述收集的级分的限定部分吸取到圆底烧瓶中，蒸发并如实施例5中所解释的进一步处理，用于HPLC分析。
CPC实验在具有双池的CPC 250PRO SPECIAL BIO VERSION柱中进行，所述柱来自于Gilson Purifications SAS(以前的Armen Instruments,France)，总体积为250mL：
所述CPC柱具有12个盘，其中每个盘含有20个雕刻的双池，总共240个池。所述柱被连接到总体积为5升的压力容器(Apache Stainless Equipment Corporation,USA)，用于将藻类发酵液泵入到CPC中。通过自制的压缩空气管线提供高达7.3bar的超压。
所述CPC实验使用乙酸乙酯作为萃取溶剂来进行。将乙酸乙酯与去离子水在24±1℃搅拌2小时。将分离的相用超声波水浴脱气。将所述CPC装置装入富含溶剂的相即固定相。在将系统的旋转速度设定到1350rpm后，将流动相(用乙酸乙酯饱和的水)在7.3bar的压力下以下降模式进料到CPC装置，这在所述设定的压力下产生30mL min-1的流速。随后，将720mL 750nm处的OD为4的萌发的藻类发酵液泵入到具有相同压力的CPC柱中。24min(在此流速下对应于720mL藻类发酵液)后，停止藻类向所述CPC的流入。向压力容器装入去离子水(用乙酸乙酯饱和)，并以上升模式将固定相推出所述柱。将所述固定相分级在15mL falcon管中，直至不再有固定相从所述柱出来。将所述收集的级分的限定部分吸取到圆底烧瓶中，蒸发并如实施例5中所解释的进一步处理，用于HPLC分析。
洗脱时间t洗脱是从生物质进样(即泵入)到CCC(CPC)柱开始至从下降切换到上升模式以将固定相从柱中推出之间的时间跨度。将进样的生物质当作追踪物，公式1给出了萃取的生物质(细胞)离开柱所需的最短时间。
Figure BDA0003128312940000271
VMP是流动相的体积，V进样是进样体积。
在洗脱时间t洗脱后，通过泵入富含培养基(CCC)或相应的水(CPC)的相，将所述固定相以上升模式推出所述柱。在两种情况下，所述相被用于萃取的溶剂饱和，即对于CCC来说甲基叔丁基醚，对于CPC来说乙酸乙酯。收集从所述柱出来的溶解在溶剂中的虾青素的级分，蒸发，并按照实施例5中描述的程序确定虾青素含量。
产率Y进料被计算为收集的级分中虾青素的质量m虾青素,级分与进样的进料生物质中的虾青素质量m虾青素,进料的商，如公式2中所示。
Figure BDA0003128312940000272
另外，在每个CCC(CPC)实验中进行三个摇瓶实验，以便确定可以从处于相应细胞阶段的细胞萃取的虾青素的量。因此，将1mL藻类发酵液与5mL甲基叔丁基醚(CCC实验)或相应的乙酸乙酯(CPC实验)混合30min。在以5500rpm离心5min后，取出4mL溶剂，并按照实施例5中描述的程序确定虾青素含量。将可以从处于相应细胞阶段的细胞萃取的虾青素的量考虑在内的产率Y萃取物按照公式3来定义，
Figure BDA0003128312940000281
其中m虾青素,萃取物,摇瓶是在摇瓶实验的萃取物中萃取的虾青素的量。由于摇瓶实验总是使用1mL藻类发酵液来进行，因此需要因子N将所述值调整到进样到CCC/CPC中的进料。例如，如果将5mL藻类发酵液进样到CCC/CPE中并且摇瓶实验使用1mL藻类发酵液进行，这导致N的值为5。
实施例8：CCC和CPC实验
根据前面的实施例例如实施例6中示出的结果，甲基叔丁基醚在所有CCC实验中并且乙酸乙酯在CPC实验中用作萃取溶剂。按照前面的实施例中描述的条件诱导萌发。在CCC中检查了下述5种运行条件并在CPC柱中检查了一种运行条件(表2)。得到的结果概述在表2中。
表2：在CCC柱中实验A、B、C、D和F以及在CPC柱中实验E的运行条件
Figure BDA0003128312940000282
Figure BDA0003128312940000291
表2续
Figure BDA0003128312940000292
·运行条件A
在运行条件A中，检查了三种不同的洗脱时间，即6.9min、18.9min和36.9min。进样体积(萌发的藻类发酵液)为0.5mL，导致虾青素的进样量为0.026mg。在这里，调查了增加的洗脱时间对产率的影响。只有第一和最浓的级分被分析其虾青素含量并用于产率的计算。正如在图7中展示的，t洗脱从6.9min增加到36.9min不影响萃取的虾青素的产率Y萃取物。计算的产率Y萃取物在60至76％的范围内。
·运行条件B
为了验证来自于运行条件A的结果，在运行条件B中对于0.5mL和2mL的进样体积检查了三种不同洗脱时间。对于0.5mL来说，洗脱时间被选择成与运行条件A相似，其中在进样0.5mL萌发的藻类细胞后6.9、18.9和36.9min将柱排空。对于2mL生物质的进样体积来说，检查了洗脱时间8.4min、20.4min和38.4min。只有第一和最浓的级分被分析其虾青素含量并用于产率的计算。
与运行条件A的结果相似，洗脱时间的增加不影响产率Y萃取物和Y进料。对于0.5mL的进样来说，为Y萃取物获得的值为48％左右，为Y进料获得的值为28％左右。2mL萌发的藻类发酵液的进样显示出相似的趋势。对于8.4min和38.4min的洗脱时间来说，Y萃取物为48％和54％。对于20.4min的洗脱时间来说，计算的Y萃取物为72％。对于Y进料来说，可以看到相似的趋势，对于8.4min、20.4min和36.4min的洗脱时间来说分别获得27％、42％和31％的产率。
·运行条件C
在运行条件C中，检查了三种不同进样体积2mL、5mL和10mL对虾青素的产率和浓度的影响。确定了前两个收集的级分中的虾青素含量，并且低浓度剩余级分的含量在将这些级倒在一起后确定。为了使用公式(2)和(3)计算产率，将级分1、级分2和剩余级分中的虾青素质量(m虾青素,级分)加在一起。正如在前述运行条件A和B中所示，比使用公式(1)计算的更长的洗脱时间不影响虾青素的萃取量和相应的获得的产率。因此，按照公式(1)，对于2mL、5mL和10mL的进样体积来说，t洗脱被确定为8.4min、11.4min和16.4min。计算产率Y萃取物对于8.4min和16.4min的洗脱时间来说为113％，对于11.4min来说为130％，并呈现在图8中。获得的产率Y进料对于8.4min和16.4min的洗脱时间来说为65％，对于11.4min的洗脱时间来说为75％。
在图9中，示出了三种进样体积的进样的藻类发酵液和收集的级分1、级分2和剩余级分的浓度。正如可以看到的，当进样10mL时，进样的藻类发酵液中65mg虾青素L-1的起始浓度被浓缩到级分1和级分2中的500mg虾青素L-1和300mg虾青素L-1。
·运行条件D
在运行条件D中，将具有两种不同生物质浓度的萌发的藻类发酵液以两种不同的进样体积2mL和5mL进样。对于2mL的进样体积来说进样16.8mg mL-1生物质，并且对于5mL的进样体积来说进样6.72mg mL-1生物质。因此，在这些实验中生物质以及相应的虾青素的进样量是相同的。对于所述进样体积来说，实现的Y萃取物是44％，Y进料是39％。在进样2mL藻类发酵液的运行中，在第一和第二级分中达到的浓度是195mg虾青素L-1和48mg虾青素L-1。当进样5mL时达到相似的值，对于级分1和2来说导致180mg虾青素L-1和50mg虾青素L-1的浓度。
·运行条件E
在CPC运行中，将720mL萌发的细胞发酵液进样到CPC中，分别对应于6055mg生物质和63.95mg虾青素。在收集的第一级分中，测量到虾青素含量为338mg L-1。产率Y萃取物为21.9％。
·运行条件F
在运行条件F中，将三种不同生物质浓度的机械破碎的孢囊细胞进样到CCC装置中。对于每种生物质浓度来说，检查了三种不同的进样体积2mL、5mL和10mL。机械细胞破碎使用高压均质机(APV1000,APV Systems,Denmark)进行，其中将藻类发酵液以200bar的压力差挤压通过间隙。该压力差引起细胞壁破裂，并且细胞质与AXT一起被释放到培养基中。在生物质进样后，在如图11F、G(选项2)中所示的时间t洗脱后，通过以下降模式泵送溶剂将所述溶剂分级。
确定了前三个收集到的级分中的虾青素含量，并且低浓度的剩余级分的含量在将这些级分倒在一起后确定。为了使用公式(2)和(3)计算产率，将级分1、级分2、级分3和剩余级分中的虾青素质量(m虾青素,级分)加在一起。对于10mL的进样体积来说，随着进样的生物质从89mg增加到178.2mg和265mg，级分1中的虾青素浓度从420mg L-1提高到1554mg L-1和2771mg L-1。在图12中，呈现了对于进样生物质浓度为26.6g L-1的2mL、5mL和10mL的进样体积来说，前三个级分、剩余的级分的虾青素浓度和进样的虾青素浓度。在图13中，呈现了10mL的进样体积和26.6g L-1的生物质浓度的收集的级分。
实施例9：膜辅助液-液萃取
将使用总表面积为0.1619m2的PTFE中空纤维的中试装置用于膜辅助液-液萃取。将溶剂乙酸乙酯和均化的雨生红球藻(H.pluvialis)孢囊置于两个分开的储池中。将溶剂乙酸乙酯泵入到中空纤维膜模块的壳侧，并将均化的雨生红球藻(H.pluvialis)孢囊泵入到腔侧(管中)。将两种料流乙酸乙酯和均化的雨生红球藻(H.pluvialis)孢囊发酵液并流泵入并在膜的相应位点处流通(图10)。运行在3h后停止。虾青素从所述发酵液萃取到溶剂中。在运行之前，与CCC/CPC实验相似进行摇瓶实验。使用UV/Vis光谱在478nm处测量的萃取的颜料的吸光值为23.5。在运行开始后3小时，对于在所述装置的壳侧中流通的溶剂来说，测量到的478nm处的吸光值为0.333。假设无穷长的萃取时间，与摇瓶实验中的产率相同，即90％左右，这意味着可以预期实现单阶段萃取。
实施例10：膜辅助液-液萃取
将使用7个总表面积为0.00838m2的PTEE中空纤维的设备用于膜辅助液-液萃取。溶剂使用离心泵Iwaki MD-15RV-220N(Iwaki,JPN)泵送，发酵液使用双通道蠕动泵Verderflex EZi C(Verder GmbH u.Co.KG,DE)泵送。将乙酸乙酯用作溶剂，并在使用膜辅助液-液装置萃取之前用水饱和。通过添加确定量的乙酸乙酯，将发酵液用所述溶剂平衡。通过在所述装置的壳侧泵送发酵液来启动所述装置。随后在腔侧(纤维内部)泵送所述富含溶剂的相。在水侧设置大约40mbar的超压。每隔一定时间取出进料和溶剂的样品。表3示出了使用膜辅助液-液萃取器进行的两个实验V1和V2的两种运行条件。
表3：使用膜辅助液-液萃取器进行的两个实验V1和V2的运行条件
Figure BDA0003128312940000321
Figure BDA0003128312940000331
·V1
在V1中，将来自于NATECO2的虾青素油性树脂(Hopfenveredlung St.JohannGmbH,DE)溶解在用乙酸乙酯平衡的水中，达到31.7mg L-1的虾青素油性树脂起始浓度。所述富含虾青素油性树脂的水的流速被设定到265mL min-1。所述溶剂以13.3mL min-1的流速泵送。压力差被设定到40mbar。图14示出了从萃取开始起所述溶剂和富含水的相中的虾青素油性树脂浓度，直至在1410min后在所述溶剂中达到31.7mg L-1的虾青素油性树脂浓度。
·V2
在V2中，将具有萌发的藻类细胞的藻类发酵液用于虾青素的萃取。所述藻类发酵液以260mL min-1的流速泵送。所述溶剂以13.1mL min-1的流速泵送。压力差被调整到30mbar。图15示出了所述藻类发酵液和溶剂中的虾青素含量随萃取时间的变化。来自于藻类发酵液的虾青素含量从10.9mg的初始值降低到165min后的0.32mg。在同一时间段中，溶剂中的虾青素含量提高到1.4mg。观察到藻类生物质在壳的死区域中的沉积。
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在本说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特点，既可单独地也可以其任何组合的方式成为以各种不同形式实现本发明的材料。

Claims (15)

1.一种从微藻萃取颜料的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段，和/或破碎所述微藻以产生包含所述破碎的微藻和所述颜料的悬液，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻和/或从所述悬液萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)使用诱导萌发的条件诱导所述微藻进入有鞭毛阶段，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述有鞭毛微藻萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)提供在水性培养基中的微藻，其中所述微藻富含颜料，
b)破碎所述微藻以产生所述破碎的微藻和所述颜料的悬液，
c)使用包含溶剂的液-液萃取系统从所述悬液萃取所述颜料，其中所述液-液萃取系统选自逆流色谱系统、离心分配色谱系统和膜辅助液-液萃取系统。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微藻一开始处于孢囊阶段，并被使用诱导萌发的条件进行诱导以进入有鞭毛阶段。
5.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中所述诱导萌发的条件选自光养条件、混合营养条件和异养条件。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述微藻被机械破碎，例如通过使用均质机、研磨机、珠磨机、珠磨法、搅拌机、超声处理、压力循环、微射流机、螺旋压榨机或冻融循环。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述步骤c)后跟有
步骤d)通过所述溶剂的冷冻干燥、冷冻、蒸发或通过将所述颜料溶解在营养油或另一种溶剂例如有机溶剂、水基溶剂、植物油或深共熔溶剂中或其组合来获得所述颜料。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微藻通过营养耗竭、过度曝光、高盐度和/或由所述微藻的遗传修饰引起的过表达而变得富含所述颜料。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微藻为绿藻门，优选为绿藻纲，更优选为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。
10.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述微藻选自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella zofingiensis)、新绿球藻(Neochloriswimmeri)和雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述液-液萃取系统是膜辅助液-液萃取系统。
12.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述液-液萃取系统是选自离心分配色谱系统和逆流色谱系统的液-液色谱系统。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述溶剂在25℃和环境压力下具有至少10毫巴、优选地至少64毫巴的蒸气压。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丁-1-醇、二氯甲烷、氯仿、二乙醚、乙基甲基醚、甲苯、苯、酮、1,1-二氯乙烷、环己烷、乙酸异丙酯、2-甲基四氢呋喃、甲乙酮、甲基环己烷、2,2,4-三甲基戊烷、二甲苯、戊-1-醇、十二烷、癸烷、丙酮、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、甲醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、乙酸、乙二醇、正烷烃和油类例如营养油或其组合，优选地选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚或其组合。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述颜料是酮基-类胡萝卜素，优选为虾青素。
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