WO2010063256A2 - Verfahren zur herstellung von carotinoiden - Google Patents

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WO2010063256A2
WO2010063256A2 PCT/DE2009/001660 DE2009001660W WO2010063256A2 WO 2010063256 A2 WO2010063256 A2 WO 2010063256A2 DE 2009001660 W DE2009001660 W DE 2009001660W WO 2010063256 A2 WO2010063256 A2 WO 2010063256A2
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carotenoids
scenedesmus
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cultivation
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Carola Griehl
Claudia Grewe
Anja Pfeiffer
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Hochschule Anhalt (Fh)
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of carotenoids, such as, for example, lutein, canthaxanthin, adonixanthin and astaxanthin.
  • microalgae for the production of carotenoids and xanthophylls is primarily for the production of ⁇ -carotene [from Dunaliella salina with 100-140 mg ⁇ -carotene / g dry matter (TS) (Del Campo, JA, Garcia-Gonzalez, M.
  • the microalgae used hitherto commercially are also very limited in their carotenoid diversity and require very specific cultivation conditions.
  • the carotenoids produced in Haematococcus pluvialis contain mainly astaxanthin (> 95%), most of which are in the form of fatty acid monoesters and -
  • Haematococcus pluvialis requires due to its low
  • Astaxanthin whose yield is up to 40 mg / g TS.
  • Dunaliella sp. which mainly produces ß-carotene, offers higher growth rates, but it needs
  • Carotene yields high salt contents [up to 30% salt causes a ß- Carotene content up to 13% of dry matter (El Baz, FK, Aboul-Enein, AM, El-Baroty 5 GS, Youssef, AM, Abdel-Baky, HH, 2002, Accumulation of antioxidant vitamins in Dunaliella salina, OnLine J Biol Sei, 2 / 4, 220-223)].
  • EP 1 681 060 A1 discloses an improved process for the production of active substances from algae (eg Haematococcus sp.) And cyanobacteria, which are carried out in a photobioreactor at constant light intensity in two process steps (1st step, green phase, 2nd step, red phase) becomes. The induction of product formation takes place by hydrogen peroxide (chemical stress).
  • algae eg Haematococcus sp.
  • cyanobacteria which are carried out in a photobioreactor at constant light intensity in two process steps (1st step, green phase, 2nd step, red phase) becomes.
  • the induction of product formation takes place by hydrogen peroxide (chemical stress).
  • Haematococcus sp. in the green phase, this must be done especially in closed systems, since Haematococcus sp. is extremely susceptible to contamination, with variations in the cultivation conditions (pH, temperature) must be avoided because they are not tolerated.
  • the disadvantage of the previously known methods is that the carotenoids (for example, lutein, canthaxanthin, adonixanthin and astaxanthin) are obtained with a high content of carotenoid esters (for example Haematococcus p luvalis 96% esterified products).
  • the carotenoids for example, lutein, canthaxanthin, adonixanthin and astaxanthin
  • carotenoid esters for example Haematococcus p luvalis 96% esterified products.
  • the object of the invention is to specify a method in which carotenoids (for example lutein, canthaxanthin, adonixanthin and astaxanthin) are obtained with significantly lower ester content and significantly higher yield than the prior art.
  • carotenoids for example lutein, canthaxanthin, adonixanthin and astaxanthin
  • the essence of the invention is that a method is provided in which Scenedesmus-fettresmus Stemmo at low Requirements for the culture medium high growth rates and high product formation [in the range of 10 mg carotenoids per gram of biomass] in a relatively short time show a carotenoid content of 1% (and more) of the dry matter is obtained, of which 60-80% are unesterified (In comparison, the proportion of unincorporated carotenoids in Haematococcus pluvalis is ⁇ 1%).
  • the method according to the invention comprises the following method steps 1 to 7: 1. Pre-cultivation of the scenedesmus ZTetradesmus strains for the production of biomass
  • nitrate in the concentration range of 1.5 to 2 g / L and the use of phosphate in the concentration range of 0.15 to 0.2 g / L.
  • the microalgae used do not require any added vitamins (eg vitamin Bl, vitamin B 12).
  • As a cultivation temperature the range of 22 to 26 ° C has been found to be optimal.
  • the sub-cultivation of the scenedesmus fTetradesmus strains is also carried out in a nitrate and phosphate-containing mineral salt medium for green algae (Setlik 1969, see Table), but using Carbon dioxide in the aeration as a carbon source and a continuous light intensity of 60 to 100 ⁇ E * m ⁇ * s " Green algae of the genus Scenedesmus I Tetradesmus can be successfully propagated by cultivating them with the nutrient medium in transparent bubble column reactors, in the soil A compressed air / CO 2 mixture (2-5% CO 2 ) is added The height / diameter ratio should be between 8 and 10.
  • the starting concentration of the biomass is 0.08 to 0.2 g / L TS and the Cultivation is carried out at a temperature of 16 to 28 ° C. and a pH range of 6 to 8 for a period of 7 to 10 days.
  • the gassing rate is advantageously 2 to 4 .mu.m.
  • the algae produce 3.5 during this time up to 5 g biomass (TS) per L culture volume with a lutein content of 2 to 6 mg / g TS, maximum between 4.9 to 7 g DM per L culture volume
  • the cultivation of the Scenedesmus- / Tetradesmus-Stwamo can in principle in each Reactor, which supplies the culture with light and CO 2 . Examples of these are tube and plate reactors according to EP 0 402 496 A1, DE 4 134 813 A1.
  • the limitation of the nitrate and phosphate source in the mineral salt medium (modified) is used to stimulate product formation (secondary carotenoids).
  • the use of NaCl in the concentration range of 0.3 to 0.5%, particularly advantageously of 0.4% (w / v), has proved favorable.
  • the method can also be carried out with deionized water as the medium.
  • the continuously employed light intensity is increased in the described invention to 250 to 400 ⁇ E * m "2 * s 4 , particularly advantageously to 350 ⁇ M * 2 ⁇ s at the culture surface also a compressed air / CO 2 mixture registered (2-5% CO 2 (v / v), gassing: 3 wm), the cultivation is carried out in bubble column reactors in the pH range of 6 to 8 and a temperature range of 20 to 35 0 C.
  • the starting concentration of the biomass is 0.3 g / L TS and the Cultivation time advantageously 10 to 14 days, after which the orange coloration of the culture entering the product does not further intensify.
  • the algae produce 0.8 to 1 g biomass (TS) per L culture volume with a secondary carotenoid content of 8 to 12 mg / g TS 5, of which 70 to 86% of the newly synthesized carotenoids (adonixanthin, astaxanthin and canthaxanthin) present unrested.
  • the biomass is separated from the culture suspension by centrifugation at 4000-6000 * g for 4 to
  • the digestion of the biomass to release the intracellular carotenoids present is done mechanically, for example by the use of a vibrating mill.
  • the carotenoid-containing biomass is mixed in a ratio of 1: 1 (v / v) with sea sand and moistened with an organic, lipophilic solvent, which increases the degree of digestion.
  • the digestion is carried out for 15 to 30 minutes, preferably in a vibration mill for 20 minutes at a frequency of 30 S- 1 .
  • the carotenoids formed are extracted using organic, lipophilic solvents. This is done by the addition of solvent, for example acetone or ethyl acetate, to the disintegrated biomass and thorough mixing of the suspension.
  • solvent for example acetone or ethyl acetate
  • the carotenoids dissolve in the lipophilic phase, the suspension is subsequently centrifuged and the supernatant decanted. Extraction is done until the sediment is colorless, the supernatants become each collected after the centrifugation and united. Subsequently, the organic solvent is removed by means of a vacuum rotary evaporator and the carotenoids are concentrated in this way.
  • the chromatographic separation of the carotenoids is carried out to identify and quantify the individual carotenoids in the carotenoid mixture.
  • the carotenoid extract dissolved in an organic solvent is filtered through a filter having a pore size of 0.2 ⁇ m and analyzed by means of an HPLC system equipped with an Alltech Grom RP-30 column measuring 250 ⁇ 4 mm, 5 ⁇ m particle size, 100 ⁇ Pore width, is equipped.
  • the carotenoids are detected and quantified by means of a diode array detector.
  • an HPLC-MS coupling is used to identify the carotenoid fatty acid esters. With the help of mass spectrometry, the structural elucidation of the carotenoid esters takes place.
  • the Scenedesmus or Tetradesmus strains obtained from the strain collection of the University of Göttingen (SAG) under the following strain numbers: Scenedesmus producto c ⁇ pit ⁇ tus SAG 21.81, Scenedesmus rubescens SAG 5.95, Scenedesmus p ectin ⁇ tus SAG 2003 Tetr ⁇ desmus wisconsiniensis SAG 3.99 are each as a single strain into an Erlenmeyer flask (V 250 mL) filled with 100 mL sterilized Setlik medium (see table). The cell density is initially 1-3 * 10 3 ZImL.
  • the illumination intensity is 80 ⁇ E * m "2 * s " 1 , 6 OSRAM fluorescent tubes a 36 W (light color Warm White) are used as the light source.
  • 50 mg of lyophilized biomass are mixed with sea sand (50:50 v / v), mixed with a glass rod and moistened with 1 mL of acetone.
  • the mechanical digestion of the biomass is carried out in a vibrating ball mill at a frequency of 30 s ' 1 for 20 min. The homogenate is extracted in 5 mL increments with acetone until the biomass test is colorless (five Steps).
  • the collected extracts are concentrated by rotary vacuum evaporator (water bath temperature 30 0 C) to dryness. Due to the light- and temperature-sensitive carotenoids, all analytical steps are performed under low light ( ⁇ 15 ⁇ E * m "2 * s " 1 ) and on ice. Solvents are quickly removed, and a storage of the dry extracts and reference compounds is carried out under nitrogen at -8O 0 C.
  • the carotinoid-containing dry extract is dissolved in a round bottom flask in 1500 ⁇ L of ethyl acetate and filtered through a 0.2 ⁇ , m syringe filter prior to HPLC analysis.
  • the carotenoid analyzes are performed on a HPLC system equipped with a diode array detector (Hitachi system consisting of an L-7612 degasser, a L-6200 pump (low pressure gradient), an L-4500 diode array detector, an L-4000 integrator and an AS -4000 autosampler with a 20 ⁇ L sample loop).
  • a diode array detector Hitachi system consisting of an L-7612 degasser, a L-6200 pump (low pressure gradient), an L-4500 diode array detector, an L-4000 integrator and an AS -4000 autosampler with a 20 ⁇ L sample loop).
  • a constant temperature control of the Alltech Grom-RP-30 column (dimensions 250 * 4 mm, particle size 5 micron, pore size 100 A; pre-column: RP-30, 10 * 4 mm) at 25 0 C is essential for a correct quantification of the carotenoids .
  • the separation of the synthesized carotenoids is carried out at a flow rate of the mobile phase of 0.6 mL / min and a gradient elution of a solvent mixture of ethyl acetate, methanol and water (A: MeOHTH 2 O (75/25 v / v), B: EtOAc) in 25 min from 70% to 45% A, in another 25 min to 10% A, constant for 10 min. .
  • the detection of the carotenoids and their fatty acid derivatives is carried out at a wavelength of 470 nm for the MS analyzes a Bruker Esquire 3000 mass spectrometer (Ion Trap) with APCI- (Atmopheric chemical ionization) source used under the following conditions: APCI Temperature 270 0 C, nebulizer 40 psi, dry gas temperature (nitrogen) 300 0 C; Drying gas flow rate 8 L / min; Corona voltage 4 kV. Detection takes place in the mass range from 50 to 2000 m / z in positive APCI mode. Helium is used as a collision gas for structure clarification.
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, wie bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, bei dem aufwandgering Carotinoide mit geringem Gehalt an Carotinoidester aus der Biomasse isoliert werden können, wird dadurch gelöst, dass eine phototrophe Kultivierung eines Scenedesmus- oder Tetradesmus-Stammes in einem geeigneten Mineralsalze sowie eine limitierte Nitrat- und Phosphat-Quellen enthaltenden Medium für eine Dauer von 10 bis 14 Tagen bei Temperaturen von 16 bis 35°C im Aziditätsbereich von 6 bis 8 und einer Luft/CO2-Gemisch von 2-5 % (v/v) und einer Begasungsrate von 2 bis 4 vvm durchgeführt wird, wobei der Scenedesmus- oder Tetradesmus-Stamm nach dem Abschluss der Vorkultivierung bei einer erhöhten Chloridionenkonzentration in einem Bereich von bis zu 0,3 bis 0,5 % (w/v) Nitrat- und Phosphat-freiem Medium in einem Reaktor bei einer erhöhten Lichtintensität von 250 bis 400 μE*m-2*s-1 kultiviert wird, die Carotinoide mit geringem Carotinoidestergehalt enthaltenden Zellen vom Kulturfiltrat abgetrennt, die abgetrennten Zellen aufgeschlossen und die Carotinoide mit geringem Carotinoidestergehalt extrahiert werden und der Extrakt abschließend in die Carotinoide enthaltende Fraktion sowie die verbleibenden Bestandteile des Zelllysats enthaltende Fraktion getrennt wird, wobei die einzelnen Carotinoide durch Chromatographie getrennt werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden, wie bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin.
Auf dem Gebiet der Carotinoidproduktion werden derzeit hauptsächlich chemische Syntheseverfahren (wie bspw. die chemische Synthese von Astaxanthin, welche 90 % der weltweiten Astaxanthinproduktion beträgt und 14 Syntheseschritte umfasst, die zu einem Isomerengemisch fuhren) sowie Extraktionsverfahren aus Pflanzen (wie bspw. die Extraktion von Lutein aus Tagetes erecta L.) angewendet.
Der Nachteil chemischer Syntheseverfahren ist, dass die Carotinoide nicht in enantiomerenreiner Form erhalten werden.
Neben den chemischen Syntheseverfahren sind auch zahlreiche Verfahren zur biologischen Produktion oder Aufarbeitung von Carotinoiden, bei denen u.a. Mikroalgen verwendet werden, bekannt (siehe bspw. DE 10 2005 007 885 Al; EP 1808483 Al; WO 9423057 Al; WO 2004070021 Al; US 2949700; JP 2006240991, JP 08089279).
Die Verwendung von Mikroalgen zur Gewinnung von Carotinoiden und Xanthophyllen rindet vor allem für die Herstellung von ß-Carotin [aus Dunaliella salina mit 100 - 140 mg ß-Carotin / g Trockenmasse (TS) (Del Campo, J. A., Garcia-Gonzalez, M., Guerrero, M. G., 2007, Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current State and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 74/6, 1163-1174)] und für die Herstellung von Astaxanthin [aus Haematococcus pluvalis mit bis zu 40 mg Astaxanthin / g TS (davon 0,4 mg unverestert) (Aflalo, C, Meshulam, Y., Zarka, A., Boussiba, S., 2007, On the relative efficiency of two- vs. one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematocloccus pluvialis. Biotechnology and Bioengineering, 98/1, 300-305), Chlorella zofingiensis mit 1,5 mg Astaxanthin / g TS - hauptsächlich verestert - (Del Campo, J. A., Rodriguez, H., Moreno, J., Vargas, M. A., Rivas, J., Guerrero, M. G., 2004, Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta). Appl Microbiol Biotechnol, 64, 848-854)] Anwendung.
Aber auch die Herstellung von Lutein [aus Muriellopsis sp. mit 4 - 6 mg / g TS (Blanco, A.M., Moreno, J., Del Campo, J.A., Rivas' J., Guerrero, M.G., 2007, Outdoor cultivation of lutein-rich cells of Muriellopsis sp. in open ponds, Appl. Microbiol Biotechnol, 73/6, 1259- 1266), aus Chlorococum sp. mit 7,6 mg /g TS (EP 1 808 483 Al) und aus Dunaliella salina mit 6 mg/g TS (Garcia-Gonzälez, M., Moreno, J., Manzano, J.C., Florencio, FJ., Guerrero, M.G., 2005, Production of Dunaliella salina biomass rieh in 9-czs-ß-carotene and lutein in a closed tubulär photobioreactor. Journal of Biotechnology 115, 81-90)] ist bereits bekannt.
Nachteilig bei der biologischen Produktion zur Gewinnung von Carotinoiden und Xanthophyllen vermittels Mikroalgen sind die meist geringen Wachstumsraten sowie die geringen Carotinoidgehalte.
Die bisher kommerziell verwendeten Mikroalgen sind in ihrer Carotinoidvielfalt zudem sehr eingeschränkt und erfordern sehr spezifische Kultivierungsbedingungen. Die in Haematococcus pluvialis gebildeten Carotinoide enthalten hauptsächlich Astaxanthin (> 95 %), wovon der überwiegende Teil in Form von Fettsäure-Monoestern und -
Diestern (> 99 %) vorliegt und nur ein geringer Anteil (< 1 %) unverestert ist (Lee, Y., Zhang, D., 1999, Production of astaxanthin by
Haematococcus. In Chemicals from microalgae (Ed, Cohen, Z.) Taylor
& Francis Ltd., London, pp. 173-195). Die Kultivation des
Haematococcus pluvialis erfordert auf Grund seiner geringen
Wachstumsrate (0,013h'1), seiner hohen Kontaminationsanfälligkeit und des Bedarfes an Vitaminen im Nährmedium einen hohen Grad an
Reinheit und technischem Aufwand sowie viel Zeit zur Produktion des
Astaxanthins, dessen Ausbeute bei bis zu 40 mg/g TS liegt.
Dunaliella sp., welche hauptsächlich ß-Carotin bildet, bietet hingegen höhere Wachstumsraten, benötigt jedoch für ihre maximalen ß-
Carotinausbeuten hohe Salzgehalte [bis 30 % Salz bewirkt einen ß- Carotingehalt bis 13 % der Trockenmasse (El Baz, F.K., Aboul-Enein, A.M., El-Baroty5 G.S., Youssef, A.M., Abdel-Baky, H.H., 2002, Accumulation of antioxidant vitamins in Dunaliella salina, OnLine J Biol Sei, 2/4, 220-223)].
EP 1 681 060 Al offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von aktiven Wirkstoffen aus Algen (bspw. Haematococcus sp.) und Cyanobakterien, das in einem Photobioreaktor bei konstanter Lichtintensität in zwei Verfahrensschritten (1. Schritt s.g. Grünphase, 2. Schritt s.g. Rotphase) durchgeführt wird. Die Induktion der Produktbildung erfolgt dabei durch Wasserstoffperoxid (chemischen Stress).
Die Kultivierung von Haematococcus sp. in der grünen Phase muss dabei insbesondere in geschlossenen Systemen erfolgen, da Haematococcus sp. extrem anfallig für Kontaminationen ist, wobei Schwankungen der Kultivierungsbedingungen (pH- Wert, Temperatur) vermieden werden müssen, da diese nicht toleriert werden.
Der Nachteil der bisher bekannten Verfahren ist, dass die Carotinoide (bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin) mit einem hohen Gehalt an Carotinoidestern gewonnen werden (bspw. Haematococcus p luvalis 96 % veresterte Produkte).
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, bei dem aufwandgering Carotinoide (bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin) mit gegenüber dem Stand der Technik deutlich reduziertem Estergehalt und deutlich höherer Ausbeute gewonnen werden.
Erfmdungsgemäß wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des 1. Patentanspruchs gelöst. Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass ein Verfahren bereitgestellt wird, bei dem Scenedesmus-fTetradesmus-Stämmo bei geringen Anforderungen an das Kultivierungsmedium hohe Wachstumsraten sowie eine hohe Produktbildung [im Bereich von 10 mg Carotinoiden pro Gramm Biomasse] in relativ kurzer Zeit zeigen, wobei ein Carotinoidgehalt von 1 % (und mehr) der Trockenmasse erhalten wird, von denen 60-80 % unverestert vorliegen (im Vergleich dazu liegt der Anteil unveresterter Carotinoide in Haematococcus pluvalis bei < 1 %).
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst folgende Verfahrensschritte 1 bis 7: 1. Vor-Kultivierung der Scenedesmus-ZTetradesmus-Stämme zur Gewinnung von Biomasse
Die Vor-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämm.Q erfolgt in einem Nitrat-und Phosphat-haltigen Mineralsalzmedium für Grünalgen (Setlik 1969, siehe Tabelle) in Schüttelkolben mit einer Animpfdichte von 1 bis 3*103 ZAnL. Grundsätzlich sind alle mineralischen Nährmedien geeignet, die eine Nitrat- und Phosphatquelle als Nährstoffe, sowie Salze wie Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen und Spurenelemente wie Zink, Cobalt, Kupfer, Mangan enthalten. Medien, die eine Nitratkonzentration von 0,25 bis 2 g/L bzw. eine Phosphatkonzentration von 0,02 bis 0,2 g/L enthalten, sind zu bevorzugen. Besonders vorteilhaft sind der Einsatz von Nitrat im Konzentrationsbereich von 1,5 bis 2 g/L und der Einsatz von Phosphat im Konzentrationsbereich von 0,15 bis 0,2 g/L. Die verwendeten Mikroalgen benötigen keine Vitaminzusätze (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B 12). Als Kultivierungstemperatur hat sich der Bereich von 22 bis 26°C als optimal erwiesen. Die Algen werden bei kontinuierlicher Beleuchtung (Lichtintensität im Bereich von I = 40 bis 60 μE*m"2*s"1) und bei Schüttlung mit einer Drehzahl im Bereich von 110 rpm über 10 bis 14 Tage kultiviert. 2. Haupt-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetmdesmus-§tämmG zur Gewinnung von Biomasse
Die Sub-Kultivierung der Scenedesmus-fTetradesmus-Stämme erfolgt ebenfalls in einem Nitrat- und Phosphat-haltigen Mineralsalzmedium für Grünalgen (Setlik 1969, siehe Tabelle), jedoch unter Verwendung von Kohlendioxid in der Belüftung als Kohlenstoffquelle und einer kontinuierlichen Lichtintensität von 60 bis 100 μE*m~ *s" . Grünalgen der Gattung Scenedesmus I Tetradesmus können erfolgreich vermehrt werden, indem sie mit dem Nährmedium in transparenten Blasensäulen- Reaktoren kultiviert werden, in die am Boden ein komprimiertes Luft/CO2-Gemisch (2-5 % CO2) eingetragen wird. Das Höhe/ Durchmesser-Verhältnis sollte zwischen 8 und 10 liegen. Die Startkonzentration der Biomasse beträgt 0,08 bis 0,2 g/L TS und die Kultivierung erfolgt bei einer Temperatur von 16 bis 280C und einem pH-Bereich von 6 bis 8 für die Dauer von 7 bis 10 Tagen. Vorteilhaft beträgt die Begasungsrate 2 bis 4 wm. Durch diese Kultivierangsart produzieren die Algen in dieser Zeit 3,5 bis 5 g Biomasse (TS) pro L Kulturvolumen mit einem Luteingehalt von 2 bis 6 mg/g TS, maximal zwischen 4,9 bis 7 g TS pro L Kulturvolumen. Die Kultivierung der Scenedesmus-/ Tetradesmus-Stwamo kann grundsätzlich in jedem Reaktor erfolgen, der die Kultur mit Licht und CO2 versorgt. Beispiele hierfür sind Röhren- und Plattenreaktoren gemäß EP 0 402 496 Al, DE 4 134 813 Al.
3. Kultivierung der Scenedesmus-ZTetradesmus-Stämme zur Gewinnung der Sekundärcarotinoide
Gemäß der Erfindung wird die Limitierung der Nitrat- und Phosphat- Quelle im Mineralsalzmedium (modifiziert) zur Anregung der Produktbildung (Sekundärcarotinoide) verwendet. Hierbei hat sich die Verwendung von NaCl im Konzentrationsbereich von 0,3 bis 0,5 %, besonders vorteilhaft von 0,4 % (w/v), als günstig erwiesen. Grundsätzlich kann die Methode auch mit entionisiertem Wasser als Medium durchgeführt werden. Die kontinuierlich eingesetzte Lichtintensität wird in der beschriebenen Erfindung auf 250 bis 400 μE*m"2*s4, besonders vorteilhaft auf 350 μΕ*m~2*s~ι an der Kulturoberfläche erhöht. Diese Stressexposition der Algen induziert die Sekundärcarotinoidbiosynthese. Es wird ebenfalls ein komprimiertes Luft/CO2-Gemisch eingetragen (2-5 % CO2 (v/v), Begasungsrate: 3 wm), die Kultivierung erfolgt in Blasensäulen-Reaktoren im pH-Bereich von 6 bis 8 und einem Temperaturbereich von 20 bis 350C. Die Startkonzentration der Biomasse beträgt 0,3 g/L TS und die Kultivierungszeit vorteilhaft 10 bis 14 Tage, wonach sich die durch die Produktbildung eintretende orange Färbung der Kultur nicht weiter intensiviert. Durch diese Kultivierungsart produzieren die Algen in dieser Zeit 0,8 bis 1 g Biomasse (TS) pro L Kulturvolumen mit einem Sekundärcarotinoidgehalt von 8 bis 12 mg/g TS5 wovon 70 bis 86 % der neu synthetisierten Carotinoide (Adonixanthin, Astaxanthin und Canthaxanthin) unverestert vorliegen.
4. Separation der Biomasse
Nach Beendigung der Kultivierung erfolgt die Separation der Biomasse aus der Kultursuspension per Zentrifugation bei 4000-6000*g für 4 bis
10 Minuten, vorteilhaft bei 5000*g für 5 Minuten. Im Anschluss wird das Sediment 2mal mit aqua dest. gewaschen und die feuchte Biomasse lyophilisiert (p = 0,3 mbar, T = -800C). Die Restfeuchte der Biomasse wird mit einer Trocknungswaage (bei 1050C bis zur Gewichtskonstanz) bestimmt. Die so behandelte Biomasse wird in einem zuvor evakuierten
Exsikkator mit Stickstoff überschichtet und bei -800C gelagert.
5. Aufschluss der Biomasse
Der Aufschluss der Biomasse zur Freisetzung der intrazellulär vorliegenden Carotinoide erfolgt mechanisch, z.B. durch die Verwendung einer Schwingmühle. Die carotinoidhaltige Biomasse wird im Verhältnis 1 :1 (v/v) mit Seesand vermischt und mit einem organischen, lipophilen Lösungsmittel befeuchtet, welches den Aufschlussgrad erhöht. Der Aufschluss erfolgt für 15 bis 30 Minuten, bevorzugt in einer Schwingmühle für 20 Minuten bei einer Frequenz von 30 S-1.
6. Extraktion der Syntheseprodukte
Nach dem Zellaufschluss werden die gebildeten Carotinoide mit Hilfe organischer, lipophiler Lösungsmittel extrahiert. Dies erfolgt durch die Zugabe von Lösungsmittel, z.B. Aceton oder Ethylacetat, zur desintegrierten Biomasse und intensives Durchmischen der Suspension. Die Carotinoide lösen sich in der lipophilen Phase, die Suspension wird nachfolgend zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Extraktion erfolgt solange, bis das Sediment farblos ist, die Überstände werden jeweils nach der Zentrifügation gesammelt und vereinigt. Im Anschluss wird das organische Lösungsmittel mittels Vakuumrotationsverdampfer entfernt und die Carotinoide auf diese Weise aufkonzentriert.
7. Chromatographische Auftrennung der Syntheseprodukte
Die chromatographische Auftrennung der Carotinoide wird zur Identifizierung und Quantifizierung der einzelnen Carotinoide im Carotinoidgemisch durchgeführt. Der in einem organischem Lösungsmittel gelöste Carotinoidextrakt wird durch einen Filter mit der Porengröße 0,2 μm filtriert und mit Hilfe einer HPLC-Anlage analysiert, die mit einer Alltech Grom RP-30 Säule der Abmessungen 250*4 mm, 5 μm Partikelgröße, 100 Ä Porenweite, ausgestattet ist. Die Carotinoide werden mittels Diodenarray-Detektor detektiert und quantifiziert. Zur Identifizierung der Carotinoid-Fettsäureester wird eine HPLC-MS- Kopplung eingesetzt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie erfolgt die Strukturaufklärung der Carotinoidester.
Die Erfindung wird nachfolgend an hand der Ausfuhrungsbeispiele näher erläutert, ohne dadurch beschränkt zu werden.
Ausführungsbeispiel 1
Die Scenedesmus- bzw. Tetradesmus -Stämme, die von der Stammsammlung der Universität Göttingen (SAG) unter folgenden Stammnummern bezogen wurden: Scenedesmus producto cαpitαtus SAG 21.81, Scenedesmus rubescens SAG 5.95, Scenedesmus p ectinαtus SAG 2003 Tetrαdesmus wisconsiniensis SAG 3.99 werden jeweils als einzelner Stamm in einen Erlenmeyerkolben (V = 250 mL) überfuhrt, der mit 100 mL sterilisiertem Setlik-Medium (siehe Tabelle) gefüllt ist. Die Zelldichte beträgt zunächst 1-3*103 ZImL. Die Scenedesmus-/ 'Tetrαdesmus-Stämmβ werden bei einer Temperatur von 25°C, kontinuierlicher Beleuchtung (Lichtintensität I = 50 /xE*m"2*s"1) und einer Schüttlung von HO rpm für 10 Tage kultiviert. Die Subkultivierung erfolgt für 10 Tage in 2 L-Doppelmantel-Glaszylindern (h = 70 cm, d = 8 cm), mit einer Startkonzentration der Biomasse von 0,14 g/L TS, bei 25°C, steriler Belüftung (Filter: 0,45 μm Porendurchmesser) mit einem Luft/CO2 -Gemisch (3 % CO2 v/v) und einer Begasungsrate von 3 vvm. Die Beleuchtungsintensität beträgt 80 μE*m"2*s"1, es werden 6 OSRAM Leuchtstoffröhren a 36 W (Lichtfarbe Warm White) als Lichtquelle eingesetzt. Zur Stammhaltung werden dem Setlik-Flüssigmedium 1,5 % (w/v) Agar zugefügt.
Ausführungsbeispiel 2
Für die Induktion der Sekundärcarotinoid-Biosynthese in den Mikroalgen werden diese mittels Zentrifugation (5 min bei 5000*g) aus dem Setlik-Medium geerntet und zur Entfernung von Salzrückständen zweimal mit aqua dest. gewaschen. Die Kultivierung unter Sekundärcarotinoidbiosynthese-induzierenden Bedingungen erfolgt mit einer Startkonzentration der Biomasse von 0,34 g/L TS für 14 Tage, wofür die separierten Zellen in einem Mangel-Medium (modifiziertes Setlik-Medium, siehe Tabelle) resuspendiert werden. Zur Herstellung dieses Mangelmediums werden dem Setlik-Medium keine Nitrat- und Phosphatquellen sowie 0,4 % (w/v) NaCl zugesetzt (siehe Tabelle). Zusätzlich erfolgt eine Erhöhung der Lichtintensität auf 350 μE*m"2*s'1. Die Kultivierungstemperatur liegt bei 280C, die Begasungsrate mit einem Luft/CO2 -Gemisch (3 % CO2 v/v) bei 3 wm.
Ausführungsbeispiel 3
Nach Beendigung der Kultivierung werden die Algenkulturen 5 min abzentrifugiert (5000*g), zweimal mit aqua dest. gewaschen und die feuchte Biomasse anschließend lyophilisiert (p = 0,3 mbar, T = -8O0C). Zur Isolierung der Carotinoide werden 50 mg lyophilisierte Biomasse mit Seesand versetzt (50:50 v/v), mit einem Glasstab vermischt und mit 1 mL Aceton befeuchtet. Anschließend erfolgt der mechanische Aufschluss der Biomasse in einer Schwingkugelmühle bei einer Frequenz von 30 s'1 für 20 min. Das Homogenisat wird in 5 mL - Schritten mit Aceton extrahiert, bis der Biomasserest farblos ist (fünf Schritte). Die gesammelten Extrakte werden mittels Rotationsvakuumverdampfer (Wasserbadtemperatur 300C) bis zur Trockene eingeengt. Aufgrund der Licht- und Temperaturempfindlichen Carotinoide werden alle Analysenschritte unter Schwachlicht (< 15 μE*m"2*s"1) und auf Eis durchgeführt. Lösungsmittel werden schnellstmöglich entfernt und eine Lagerung der trockenen Extrakte und Referenzsubstanzen erfolgt unter Stickstoff bei -8O0C.
Ausführungsbeispiel 4 Der carotinoidhaltige trockene Extrakt wird im Rundkolben in 1500 μL Ethylacetat gelöst und vor der HPLC-Analyse durch einen 0,2 μ,m Spritzenvorsatzfilter filtriert. Die Carotinoid- Analysen werden mit einer HPLC-Anlage, die mit einem Diodenarraydetektor ausgestattet ist, durchgeführt (Hitachi Anlage bestehend aus einem L-7612 Degasser, einer L-6200 Pumpe (Niederdruckgradient), einem L-4500 Diodenarraydetektor, einem L-4000 Integrator und einem AS -4000 Autosampier mit einer 20 μL Probenschleife). Eine konstante Temperierung der Alltech Grom-RP-30-Säule (Abmaße 250*4 mm, Partikelgröße 5 μm, Porengröße 100 Ä; Vorsäule: RP-30, 10*4 mm) bei 250C ist für eine korrekte Quantifizierung der Carotinoide unerlässlich. Die Trennung der synthetisierten Carotinoide erfolgt bei einer Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase von 0,6 mL/min und einer Gradientenelution eines Lösungsmittelgemisches aus Ethylacetat, Methanol und Wasser (A: MeOHTH2O (75/25 v/v ), B: EtOAc) in 25 min von 70 % auf 45 % A, in weiteren 25 min auf 10 % A, 10 min konstant. Die Detektion der Carotinoide und ihrer Fettsäurederivate erfolgt bei einer Wellenlänge von 470 nm. Für die MS-Analysen wird ein Bruker Esquire 3000 Massenspektrometer (Ionenfalle) mit APCI-(Atmopheric Chemical Ionization)-Quelle verwendet unter folgenden Bedingungen: APCI Temperatur 2700C, Nebulizer 40 psi, Trocknungsgas-Temperatur (Stickstoff) 3000C; Trocknungsgas-Flussrate 8 L/min; Corona- Spannung 4 kV. Die Detektion erfolgt im Massenbereich von 50 bis 2000 m/z im positiven APCI-Modus. Helium wird als Stoßgas zur Strukturaufklärung eingesetzt. Medienzusammensetzung:
Figure imgf000011_0001
Bei den Ausfiihrangsbeispielen verwendete Scenedesmus-/ Tetradesmus- Stämme der Stammsammlung der Universität Göttingen (SAG):
• Scenedesmus producto capitatus SAG 21.81,
• Scenedesmus rubescens SAG 5.95,
• Scenedesmus pectinatus SAG 2003
• Tetradesmus wisconsiniensis SAG 3.99
Alternativ dazu besteht auch die Möglichkeit, Scenedesmus- bzw. Tetradesmus- Stämme gemäß dem Stand der Technik aus der Natur zu isolieren bzw. in anderen Algen-Stammsammlungen vorhandene Stämme, deren Varianten oder Mutanten mit ähnlichem Carotinoidsyntheseverhalten zu verwenden.
Alle in der Beschreibung, den Ausfuhrungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch phototrophe Kultivierung eines Scenedesmus- oder eines Tetradesmus- Stammes in einem geeignete Mineralsalze sowie eine limitierte Nitrat- und
Phosphat-Quelle enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, dass der Scenedesmus- oder Tetradesmus- Stamm nach dem Abschluss der Vor- und Subkultivierung bei einer Chloridionenkonzentration in einem Bereich von bis zu 3 bis 5 Gramm pro Liter Nitrat- und Phosphat- freiem Medium in einem Reaktor bei einer Lichtintensität von 250 bis 400 μE*m"2*s"1 für eine Dauer von 10 bis 14 Tagen bei Temperaturen von 20 bis 350C im Aziditätsbereich von 6 bis 8 und einer Luft/CO2-Gemisch-Begasungsrate von 3 vvm kultiviert wird, dass die Carotinoide enthaltenden Zellen vom Kulturfiltrat abgetrennt, die abgetrennten Zellen aufgeschlossen und die Carotinoide extrahiert werden und das Extrakt abschließend in die Carotinoide enthaltende Fraktion sowie die verbleibenden Bestandteile des Zelllysats enthaltende Fraktion getrennt wird, wobei die einzelnen Carotinoide durch Chromatographie getrennt werden und bei diesen ein 60 bis 80%iger Gehalt an Carotinoidestern zu verzeichnen ist.
2. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Scenedesmus-Stamm ein Scenedesmus rubescens-, Scenedesmus producto-capitatus- oder Scenedesmus pectinatus-Stamm eingesetzt wird.
3. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Tetradesmus-Stamm ein Tetrαdesmus wisconsinien.sis-Std.mm eingesetzt wird.
4. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass 2-5 % CO2 v/v bei der Begasung eingesetzt werden.
5. Verwendung des Verfahrens zur Herstellung von Carotinoiden gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die unveresterten Carotinoide Adonixanthin, Astaxanthin, Lutein und Canthaxanthin sind.
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