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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden,
wie bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin.
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Auf
dem Gebiet der Carotinoidproduktion werden derzeit hauptsächlich
chemische Syntheseverfahren (wie bspw. die chemische Synthese von
Astaxanthin, welche 90% der weltweiten Astaxanthinproduktion beträgt
und 14 Syntheseschritte umfasst, die zu einem Isomerengemisch führen)
sowie Extraktionsverfahren aus Pflanzen (wie bspw. die Extraktion
von Lutein aus Tagetes erecta L.) angewendet.
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Der
Nachteil chemischer Syntheseverfahren ist, dass die Carotinoide
nicht in enantiomerenreiner Form erhalten werden.
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Neben
den chemischen Syntheseverfahren sind auch zahlreiche Verfahren
zur biologischen Produktion oder Aufarbeitung von Carotinoiden,
bei denen u. a. Mikroalgen verwendet werden, bekannt (siehe bspw.
DE 10 2005 007 885
A1 ;
EP 1808483
A1 ;
WO 9423057
A1 ;
WO
2004070021 A1 ;
US 2949700 ;
JP 2006240991 ,
JP 08089279 ).
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Die
Verwendung von Mikroalgen zur Gewinnung von Carotinoiden und Xanthophyllen
findet vor allem für die Herstellung von β-Carotin
[aus Dunaliella salina mit 100–140 mg β-Carotin/g
Trockenmasse (TS) (Del Campo, J. A., Garcia-Gonzalez, M.,
Guerrero, M. G., 2007, Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production:
current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 74/6,
1163–1174)] und für die Herstellung von
Astaxanthin [aus Haematococcus pluvalis mit bis zu 40 mg Astaxanthin/g
TS (davon 0,4 mg unverestert) (Aflalo, C., Meshulam, Y.,
Zarka, A., Boussiba, S., 2007, On the relative efficiency of two-
vs. one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematocloccus
pluvialis. Biotechnology and Bioengineering, 98/1, 300–305),
Chlorella zofingiensis mit 1,5 mg Astaxanthin/g TS – hauptsächlich
verestert – (Del Campo, J. A., Rodriguez, H., Moreno,
J., Vargas, M. Á., Rivas, J., Guerrero, M. G., 2004, Accumulation
of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta).
Appl Microbiol Biotechnol, 64, 848–854)] Anwendung.
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Aber
auch die Herstellung von Lutein [aus Muriellopsis sp. mit 4–6
mg/g TS (
Blanco, A. M., Moreno, J., Del Campo, J. A., Rivas'
J., Guerrero, M. G., 2007, Outdoor cultivation of lutein-rich cells
of Muriellopsis sp. in open ponds, Appl. Microbiol Biotechnol, 73/6,
1259–1266), aus Chlorococum sp. mit 7,6 mg/g TS
(
EP 1 808 483 A1 )
und aus Dunaliella salina mit 6 mg/g TS (
Garcia-Gonzalez,
M., Moreno, J., Manzano, J. C., Florencio, F. J., Guerrero, M. G.,
2005, Production of Dunaliella salina biomass rich in 9-cis-β-carotene
and lutein in a closed tubular photobioreactor. Journal of Biotechnology
115, 81–90)] ist bereits bekannt.
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Nachteilig
bei der biologischen Produktion zur Gewinnung von Carotinoiden und
Xanthophyllen vermittels Mikroalgen sind die meist geringen Wachstumsraten
sowie die geringen Carotinoidgehalte.
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Die
bisher kommerziell verwendeten Mikroalgen sind in ihrer Carotinoidvielfalt
zudem sehr eingeschränkt und erfordern sehr spezifische
Kultivierungsbedingungen. Die in Haematococcus pluvialis gebildeten Carotinoide
enthalten hauptsächlich Astaxanthin (> 95%), wovon der überwiegende
Teil in Form von Fettsäure-Monoestern und -Diestern (> 99%) vorliegt und
nur ein geringer Anteil (< 1%)
unverestert ist (Lee, Y., Zhang, D., 1999, Production of
astaxanthin by Haematococcus. In Chemicals from microalgae (Ed,
Cohen, Z.) Taylor & Francis
Ltd., London, pp. 173–195). Die Kultivation des
Haematococcus pluvialis erfordert auf Grund seiner geringen Wachstumsrate
(0,013 h–1), seiner hohen Kontaminationsanfälligkeit
und des Bedarfes an Vitaminen im Nährmedium einen hohen
Grad an Reinheit und technischem Aufwand sowie viel Zeit zur Produktion
des Astaxanthins, dessen Ausbeute bei bis zu 40 mg/g TS liegt.
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Dunaliella
sp., welche hauptsächlich β-Carotin bildet, bietet
hingegen höhere Wachstumsraten, benötigt jedoch
für ihre maximalen β-Carotinausbeuten hohe Salzgehalte
[bis 30% Salz bewirkt einen β- Carotingehalt bis 13% der
Trockenmasse (El Baz, F. K., Aboul-Enein, A. M., El-Baroty,
G. S., Youssef, A. M., Abdel-Baky, H. H., 2002, Accumulation of
antioxidant vitamins in Dunaliella salina. OnLine J Biol Sci, 2/4,
220–223)].
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EP 1 681 060 A1 offenbart
ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von aktiven Wirkstoffen
aus Algen (bspw. Haematococcus sp.) und Cyanobakterien, das in einem
Photobioreaktor bei konstanter Lichtintensität in zwei
Verfahrensschritten (1. Schritt s. g. Grünphase, 2. Schritt
s. g. Rotphase) durchgeführt wird. Die Induktion der Produktbildung
erfolgt dabei durch Wasserstoffperoxid (chemischen Stress). Die
Kultivierung von Haematococcus sp. in der grünen Phase
muss dabei insbesondere in geschlossenen Systemen erfolgen, da Haematococcus
sp. extrem anfällig für Kontaminationen ist, wobei
Schwankungen der Kultivierungsbedingungen (pH-Wert, Temperatur)
vermieden werden müssen, da diese nicht toleriert werden.
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Der
Nachteil der bisher bekannten Verfahren ist, dass die Carotinoide
(bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin) mit
einem hohen Gehalt an Carotinoidestern gewonnen werden (bspw. Haematococcus
pluvalis 96% veresterte Produkte).
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, bei dem aufwandgering
Carotinoide (bspw. Lutein, Canthaxanthin, Adonixanthin und Astaxanthin)
mit gegenüber dem Stand der Technik deutlich reduziertem
Estergehalt und deutlich höherer Ausbeute gewonnen werden.
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Erfindungsgemäß wird
diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des 1. Patentanspruchs gelöst.
Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der
Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.
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Das
Wesen der Erfindung besteht darin, dass ein Verfahren bereitgestellt
wird, bei dem Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme bei geringen Anforderungen
an das Kultivierungsmedium hohe Wachstumsraten sowie eine hohe Produktbildung
[im Bereich von 10 mg Carotinoiden pro Gramm Biomasse] in relativ
kurzer Zeit zeigen, wobei ein Carotinoidgehalt von 1% (und mehr)
der Trockenmasse erhalten wird, von denen 60–80% unverestert
vorliegen (im Vergleich dazu liegt der Anteil unveresterter Carotinoide
in Haematococcus pluvalis bei < 1%).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren umfasst folgende Verfahrensschritte
1 bis 7:
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1. Vor-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
zur Gewinnung von Biomasse
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Die
Vor-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme erfolgt
in einem Nitrat- und Phosphat-haltigen Mineralsalzmedium für
Grünalgen (Setlik 1969, siehe Tabelle) in Schüttelkolben
mit einer Animpfdichte von 1 bis 3·103 Z/mL.
Grundsätzlich sind alle mineralischen Nährmedien
geeignet, die eine Nitrat- und Phosphatquelle als Nährstoffe,
sowie Salze wie Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen und Spurenelemente wie
Zink, Cobalt, Kupfer, Mangan enthalten. Medien, die eine Nitratkonzentration
von 0,25 bis 2 g/L bzw. eine Phosphatkonzentration von 0,02 bis
0,2 g/L enthalten, sind zu bevorzugen. Besonders vorteilhaft sind
der Einsatz von Nitrat im Konzentrationsbereich von 1,5 bis 2 g/L
und der Einsatz von Phosphat im Konzentrationsbereich von 0,15 bis
0,2 g/L. Die verwendeten Mikroalgen benötigen keine Vitaminzusätze
(z. B. Vitamin B1, Vitamin B12). Als Kultivierungstemperatur hat
sich der Bereich von 22 bis 26°C als optimal erwiesen.
Die Algen werden bei kontinuierlicher Beleuchtung (Lichtintensität
im Bereich von I = 40 bis 60 μE·m–2·s–1) und bei Schüttlung
mit einer Drehzahl im Bereich von 110 rpm über 10 bis 14
Tage kultiviert.
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2. Haupt-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
zur Gewinnung von Biomasse
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Die
Sub-Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme erfolgt
ebenfalls in einem Nitrat- und Phosphat-haltigen Mineralsalzmedium
für Grünalgen (Setlik 1969, siehe Tabelle), jedoch
unter Verwendung von Kohlendioxid in der Belüftung als
Kohlenstoffquelle und einer kontinuierlichen Lichtintensität
von 60 bis 100 μE·m
–2·s
–1. Grünalgen der Gattung
Scenedesmus/Tetradesmus können erfolgreich vermehrt werden,
indem sie mit dem Nährmedium in transparenten Blasensäulen-Reaktoren
kultiviert werden, in die am Boden ein komprimiertes Luft/CO
2-Gemisch (2–5% CO
2)
eingetragen wird. Das Höhe/Durchmesser-Verhältnis
sollte zwischen 8 und 10 liegen. Die Startkonzentration der Biomasse
beträgt 0,08 bis 0,2 g/L TS und die Kultivierung erfolgt
bei einer Temperatur von 16 bis 28°C und einem pH-Bereich
von 6 bis 8 für die Dauer von 7 bis 10 Tagen. Vorteilhaft
beträgt die Begasungsrate 2 bis 4 vvm. Durch diese Kultivierungsart
produzieren die Algen in dieser Zeit 3,5 bis 5 g Biomasse (TS) pro
L Kulturvolumen mit einem Luteingehalt von 2 bis 6 mg/g TS, maximal zwischen
4,9 bis 7 g TS pro L Kulturvolumen. Die Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
kann grundsätzlich in jedem Reaktor erfolgen, der die Kultur
mit Licht und CO
2 versorgt. Beispiele hierfür
sind Röhren- und Plattenreaktoren gemäß
EP 0 402 496 A1 ,
DE 4 134 813 A1 .
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3. Kultivierung der Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
zur Gewinnung der Sekundärcarotinoide
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Gemäß der
Erfindung wird die Limitierung der Nitrat- und Phosphat-Quelle im
Mineralsalzmedium (modifiziert) zur Anregung der Produktbildung
(Sekundärcarotinoide) verwendet. Hierbei hat sich die Verwendung
von NaCl im Konzentrationsbereich von 0,3 bis 0,5%, besonders vorteilhaft
von 0,4% (w/v), als günstig erwiesen. Grundsätzlich
kann die Methode auch mit entionisiertem Wasser als Medium durchgeführt
werden. Die kontinuierlich eingesetzte Lichtintensität
wird in der beschriebenen Erfindung auf 250 bis 400 μE·m–2·s–1, besonders
vorteilhaft auf 350 μE·m–2·s–1 an der Kulturoberfläche
erhöht. Diese Stressexposition der Algen induziert die
Sekundärcarotinoidbiosynthese. Es wird ebenfalls ein komprimiertes
Luft/CO2-Gemisch eingetragen (2–5%
CO2 (v/v), Begasungsrate: 3 vvm), die Kultivierung
erfolgt in Blasensäulen-Reaktoren im pH-Bereich von 6 bis
8 und einem Temperaturbereich von 20 bis 35°C. Die Startkonzentration
der Biomasse beträgt 0,3 g/L TS und die Kultivierungszeit
vorteilhaft 10 bis 14 Tage, wonach sich die durch die Produktbildung
eintretende orange Färbung der Kultur nicht weiter intensiviert.
Durch diese Kultivierungsart produzieren die Algen in dieser Zeit
0,8 bis 1 g Biomasse (TS) pro L Kulturvolumen mit einem Sekundärcarotinoidgehalt
von 8 bis 12 mg/g TS, wovon 70 bis 86% der neu synthetisierten Carotinoide
(Adonixanthin, Astaxanthin und Canthaxanthin) unverestert vorliegen.
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4. Separation der Biomasse
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Nach
Beendigung der Kultivierung erfolgt die Separation der Biomasse
aus der Kultursuspension per Zentrifugation bei 4000–6000·g
für 4 bis 10 Minuten, vorteilhaft bei 5000·g für
5 Minuten. Im Anschluss wird das Sediment 2mal mit aqua dest. gewaschen
und die feuchte Biomasse lyophilisiert (p = 0,3 mbar, T = –80°C). Die
Restfeuchte der Biomasse wird mit einer Trocknungswaage (bei 105°C
bis zur Gewichtskonstanz) bestimmt. Die so behandelte Biomasse wird
in einem zuvor evakuierten Exsikkator mit Stickstoff überschichtet und
bei –80°C gelagert.
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5. Aufschluss der Biomasse
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Der
Aufschluss der Biomasse zur Freisetzung der intrazellulär
vorliegenden Carotinoide erfolgt mechanisch, z. B. durch die Verwendung
einer Schwingmühle. Die carotinoidhaltige Biomasse wird
im Verhältnis 1:1 (v/v) mit Seesand vermischt und mit einem
organischen, lipophilen Lösungsmittel befeuchtet, welches
den Aufschlussgrad erhöht. Der Aufschluss erfolgt für
15 bis 30 Minuten, bevorzugt in einer Schwingmühle für
20 Minuten bei einer Frequenz von 30 s–1.
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6. Extraktion der Syntheseprodukte
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Nach
dem Zellaufschluss werden die gebildeten Carotinoide mit Hilfe organischer,
lipophiler Lösungsmittel extrahiert. Dies erfolgt durch
die Zugabe von Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Ethylacetat,
zur desintegrierten Biomasse und intensives Durchmischen der Suspension.
Die Carotinoide lösen sich in der lipophilen Phase, die
Suspension wird nachfolgend zentrifugiert und der Überstand
dekantiert. Die Extraktion erfolgt solange, bis das Sediment farblos
ist, die Überstände werden jeweils nach der Zentrifugation
gesammelt und vereinigt. Im Anschluss wird das organische Lösungsmittel
mittels Vakuumrotationsverdampfer entfernt und die Carotinoide auf
diese Weise aufkonzentriert.
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7. Chromatographische Auftrennung
der Syntheseprodukte
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Die
chromatographische Auftrennung der Carotinoide wird zur Identifizierung
und Quantifizierung der einzelnen Carotinoide im Carotinoidgemisch
durchgeführt. Der in einem organischem Lösungsmittel
gelöste Carotinoidextrakt wird durch einen Filter mit der
Porengröße 0,2 μm filtriert und mit Hilfe
einer HPLC-Anlage analysiert, die mit einer Alltech Grom RP-30 Säule
der Abmessungen 250·4 mm, 5 μm Partikelgröße,
100 Å Porenweite, ausgestattet ist. Die Carotinoide werden
mittels Diodenarray-Detektor detektiert und quantifiziert. Zur Identifizierung
der Carotinoid-Fettsäureester wird eine HPLC-MS-Kopplung
eingesetzt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie erfolgt die Strukturaufklärung
der Carotinoidester.
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Die
Erfindung wird nachfolgend an hand der Ausführungsbeispiele
näher erläutert, ohne dadurch beschränkt
zu werden.
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Ausführungsbeispiel 1
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Die
Scenedesmus- bzw. Tetradesmus-Stämme, die von der Stammsammlung
der Universität Göttingen (SAG) unter folgenden
Stammnummern bezogen wurden:
- Scenedesmus producto capitatus
SAG 21.81,
- Scenedesmus rubescens SAG 5.95,
- Scenedesmus pectinatus SAG 2003
- Tetradesmus wisconsiniensis SAG 3.99
werden jeweils
als einzelner Stamm in einen Erlenmeyerkolben (V = 250 mL) überführt,
der mit 100 mL sterilisiertem Setlik-Medium (siehe Tabelle) gefüllt
ist. Die Zelldichte beträgt zunächst 1–3·103 Z/mL. Die Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
werden bei einer Temperatur von 25°C, kontinuierlicher
Beleuchtung (Lichtintensität I = 50 μE·m–2·s–1)
und einer Schüttlung von 110 rpm für 10 Tage kultiviert.
Die Subkultivierung erfolgt für 10 Tage in 2 L-Doppelmantel-Glaszylindern
(h = 70 cm, d = 8 cm), mit einer Startkonzentration der Biomasse von
0,14 g/L TS, bei 25°C, steriler Belüftung (Filter:
0,45 μm Porendurchmesser) mit einem Luft/CO2-Gemisch (3%
CO2 v/v) und einer Begasungsrate von 3 vvm.
Die Beleuchtungsintensität beträgt 80 μE·m–2·s–1,
es werden 6 OSRAM Leuchtstoffröhren a 36 W (Lichtfarbe
Warm White) als Lichtquelle eingesetzt. Zur Stammhaltung werden
dem Setlik-Flüssigmedium 1,5% (w/v) Agar zugefügt.
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Ausführungsbeispiel 2
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Für
die Induktion der Sekundärcarotinoid-Biosynthese in den
Mikroalgen werden diese mittels Zentrifugation (5 min bei 5000·g)
aus dem Setlik-Medium geerntet und zur Entfernung von Salzrückständen
zweimal mit aqua dest. gewaschen. Die Kultivierung unter Sekundärcarotinoidbiosynthese-induzierenden
Bedingungen erfolgt mit einer Startkonzentration der Biomasse von
0,34 g/L TS für 14 Tage, wofür die separierten
Zellen in einem Mangel-Medium (modifiziertes Setlik-Medium, siehe
Tabelle) resuspendiert werden. Zur Herstellung dieses Mangelmediums
werden dem Setlik-Medium keine Nitrat- und Phosphatquellen sowie
0,4% (w/v) NaCl zugesetzt (siehe Tabelle). Zusätzlich erfolgt
eine Erhöhung der Lichtintensität auf 350 μE·m–2·s–1.
Die Kultivierungstemperatur liegt bei 28°C, die Begasungsrate
mit einem Luft/CO2-Gemisch (3% CO2 v/v) bei 3 vvm.
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Ausführungsbeispiel 3
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Nach
Beendigung der Kultivierung werden die Algenkulturen 5 min abzentrifugiert
(5000·g), zweimal mit aqua dest. gewaschen und die feuchte
Biomasse anschließend lyophilisiert (p = 0,3 mbar, T = –80°C).
Zur Isolierung der Carotinoide werden 50 mg lyophilisierte Biomasse
mit Seesand versetzt (50:50 v/v), mit einem Glasstab vermischt und
mit 1 mL Aceton befeuchtet. Anschließend erfolgt der mechanische
Aufschluss der Biomasse in einer Schwingkugelmühle bei
einer Frequenz von 30 s–1 für
20 min. Das Homogenisat wird in 5 mL – Schritten mit Aceton
extrahiert, bis der Biomasserest farblos ist (fünf Schritte).
Die gesammelten Extrakte werden mittels Rotationsvakuumverdampfer
(Wasserbadtemperatur 30°C) bis zur Trockene eingeengt.
Aufgrund der Licht- und Temperaturempfindlichen Carotinoide werden
alle Analysenschritte unter Schwachlicht (< 15 μE·m–2·s–1) und auf Eis durchgeführt.
Lösungsmittel werden schnellstmöglich entfernt
und eine Lagerung der trockenen Extrakte und Referenzsubstanzen
erfolgt unter Stickstoff bei –80°C.
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Ausführungsbeispiel 4
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Der
carotinoidhaltige trockene Extrakt wird im Rundkolben in 1500 μL
Ethylacetat gelöst und vor der HPLC-Analyse durch einen
0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert. Die Carotinoid-Analysen
werden mit einer HPLC-Anlage, die mit einem Diodenarraydetektor
ausgestattet ist, durchgeführt (Hitachi Anlage bestehend aus
einem L-7612 Degasser, einer L-6200 Pumpe (Niederdruckgradient),
einem L-4500 Diodenarraydetektor, einem L-4000 Integrator und einem
AS-4000 Autosampler mit einer 20 μL Probenschleife). Eine
konstante Temperierung der Alltech Grom-RP-30-Säule (Abmaße
250·4 mm, Partikelgröße 5 μm,
Porengröße 100 Å; Vorsäule:
RP-30, 10·4 mm) bei 25°C ist für eine
korrekte Quantifizierung der Carotinoide unerlässlich.
Die Trennung der synthetisierten Carotinoide erfolgt bei einer Fließgeschwindigkeit
der mobilen Phase von 0,6 mL/min und einer Gradientenelution eines
Lösungsmittelgemisches aus Ethylacetat, Methanol und Wasser
(A: MeOH/H
2O (75/25 v/v), B: EtOAc) in 25
min von 70% auf 45% A, in weiteren 25 min auf 10% A, 10 min konstant.
Die Detektion der Carotinoide und ihrer Fettsäurederivate
erfolgt bei einer Wellenlänge von 470 nm. Für die
MS-Analysen wird ein Bruker Esquire 3000 Massenspektrometer (Ionenfalle)
mit APCI-(Atmopheric Chemical Ionization)-Quelle verwendet unter
folgenden Bedingungen: APCI Temperatur 270°C, Nebulizer
40 psi, Trocknungsgas-Temperatur (Stickstoff) 300°C; Trocknungsgas-Flussrate
8 L/min; Corona-Spannung 4 kV. Die Detektion erfolgt im Massenbereich
von 50 bis 2000 m/z im positiven APCI-Modus. Helium wird als Stoßgas zur
Strukturaufklärung eingesetzt. Medienzusammensetzung:
| Nährsalz | Setlik
1969 mg/L | Modifiziertes
Setlik-Medium mg/L |
| KNO3 | 2020 | - |
| KH2PO4 | 340 | - |
| MgSO4·7H2O | 990 | 990 |
| NaCl | - | 4040 |
| Fe – EDTA | 18,5 | 18,5 |
| Ca(NO3)2·4H2O | 10,0 | 10,0 |
| H3BO3 | 3,09 | 3,09 |
| MnSO4·4H2O | 1,2 | 1,2 |
| CoSO4 | 1,4 | 1,4 |
| CuSO4·5H2O | 1,24 | 1,24 |
| ZnSO4 | 1,43 | 1,43 |
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 1,84 | 1,84 |
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Bei
den Ausführungsbeispielen verwendete Scenedesmus-/Tetradesmus-Stämme
der Stammsammlung der Universität Göttingen (SAG):
- • Scenedesmus producto capitatus SAG
21.81,
- • Scenedesmus rubescens SAG 5.95,
- • Scenedesmus pectinatus SAG 2003
- • Tetradesmus wisconsiniensis SAG 3.99
-
Alternativ
dazu besteht auch die Möglichkeit, Scenedesmus- bzw. Tetradesmus-Stämme
gemäß dem Stand der Technik aus der Natur zu isolieren
bzw. in anderen Algen-Stammsammlungen vorhandene Stämme, deren
Varianten oder Mutanten mit ähnlichem Carotinoidsyntheseverhalten
zu verwenden.
-
Alle
in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den
nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102005007885
A1 [0004]
- - EP 1808483 A1 [0004, 0006]
- - WO 9423057 A1 [0004]
- - WO 2004070021 A1 [0004]
- - US 2949700 [0004]
- - JP 2006240991 [0004]
- - JP 08089279 [0004]
- - EP 1681060 A1 [0010]
- - EP 0402496 A1 [0017]
- - DE 4134813 A1 [0017]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Del Campo,
J. A., Garcia-Gonzalez, M., Guerrero, M. G., 2007, Outdoor cultivation
of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives.
Appl Microbiol Biotechnol, 74/6, 1163–1174 [0005]
- - Aflalo, C., Meshulam, Y., Zarka, A., Boussiba, S., 2007, On
the relative efficiency of two- vs. one-stage production of astaxanthin
by the green alga Haematocloccus pluvialis. Biotechnology and Bioengineering, 98/1,
300–305 [0005]
- - Del Campo, J. A., Rodriguez, H., Moreno, J., Vargas, M. Á.,
Rivas, J., Guerrero, M. G., 2004, Accumulation of astaxanthin and
lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta). Appl Microbiol Biotechnol,
64, 848–854 [0005]
- - Blanco, A. M., Moreno, J., Del Campo, J. A., Rivas' J., Guerrero,
M. G., 2007, Outdoor cultivation of lutein-rich cells of Muriellopsis
sp. in open ponds, Appl. Microbiol Biotechnol, 73/6, 1259–1266 [0006]
- - Garcia-Gonzalez, M., Moreno, J., Manzano, J. C., Florencio,
F. J., Guerrero, M. G., 2005, Production of Dunaliella salina biomass
rich in 9-cis-β-carotene and lutein in a closed tubular
photobioreactor. Journal of Biotechnology 115, 81–90 [0006]
- - Lee, Y., Zhang, D., 1999, Production of astaxanthin by Haematococcus.
In Chemicals from microalgae (Ed, Cohen, Z.) Taylor & Francis Ltd.,
London, pp. 173–195 [0008]
- - El Baz, F. K., Aboul-Enein, A. M., El-Baroty, G. S., Youssef,
A. M., Abdel-Baky, H. H., 2002, Accumulation of antioxidant vitamins
in Dunaliella salina. OnLine J Biol Sci, 2/4, 220–223 [0009]