DE60015756T2

DE60015756T2 - Verfahren zur gewinnung eines thermostabilen mikroalgenextraktes mit oxidationshemmender- und wundheilender aktivität

Info

Publication number: DE60015756T2
Application number: DE60015756T
Authority: DE
Inventors: Jacques Point; Jean-Claude Baccou; Bruno Baroux
Original assignee: AQUAMER (SAEM); AQUAMER SAEM MEZE
Current assignee: AQUAMER (SAEM); AQUAMER SAEM MEZE
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2020-05-16
Also published as: EP1190036A1; ATE282085T1; ES2232450T3; CA2376629A1; EP1190036B1; DE60015756D1; WO2000075282A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines thermostabilen Extrakts aus einer Mikro-Algen-Kultur, der eine oxidationshemmende und die Narbenbildung fördernde Wirkung besitzt, die mit einem hohen Gehalt an superoxyddismutasenartigen Substanzen und an sulfatierten Polysacchariden im Zusammenhang steht, und der eine Anwendung in der chemischen Industrie, der Kosmetikindustrie, der Pharmaindustrie und der Landwirtschaftsindustrie, sowie im Bereich der Nutrazeutik und der Diätetik finden kann.
Im Kosmetikbereich wurden bereits zahlreiche Arbeiten durchgeführt, um Radikalenfänger-Substanzen zu entwickeln, die insbesondere geeignet sind, die Hautalterung zu verlangsamen. Parallel dazu erfolgten Forschungen im medizinischen Bereich, um Produkte mit entzündungshemmender Wirkung zu gewinnen, die vor allem in der Rheumatologie und bei der Behandlung von Krankheiten im Zusammenhang mit oxidativem Stress und Erkrankungen des Verdauungssystems und des kardiovaskulären Systems eingesetzt werden können.
In den letzten Jahren befassten sich die Forschungen bewusst mit dem Pflanzensektor, um infektiöse Stoffe zu vermeiden, die in tierischen Extrakten drohen können. Hierbei führte die Mikroalgenkultur zur Gewinnung interessanter Produkte ausgehend von der Algenbiomasse.
Patent Nr. EP 0 437 393 nimmt Bezug auf ein Verfahren und einen Photo-Bioreaktor, die für die Produktion und Extraktion von Anti-Oxidantien aus einer Mikroorganismenkultur bestimmt sind, wobei das Verfahren darin besteht, in dem Photo-Bioreaktor Mikroalgen zu kultivieren, die sich in dem Kulturmedium in Suspension befinden und den von den Mikroalgen per Photosynthese erzeugten Sauerstoff zu sammeln, um ihn anschließend in das Kulturmedium zurückzuführen, die Mikroalgen von dem Nährboden zu trennen, sie zu solubilisieren, die Lösung zu zermahlen, ein Lösungsmittel hinzuzufügen, um die Anti-Oxidantien zu solubilisieren und die vorliegenden flüssigen Phasen zu trennen.
Patent Nr. EP 0 628 629 beschreibt ein Verfahren zur Produktion und Extraktion von thermostabilen Superoxid-Dismutasen ausgehend von einer in einem Kulturmedium suspendierten Mikroorganismenkultur, wobei diese aus der Gruppe der Mikroalgen und der Zyanobakterien ausgewählt sind, und dieses Verfahren darin besteht, in einem Photoreaktor thermophile, aerobe, photosynthetische, Sauerstoff erzeugende Mikroorganismen zu kultivieren, aus dem Nährboden vermittels Zellzerkleinerung, Ultrafiltration und selektiver Fällung die Superoxid-Dismutasen zu extrahieren.
Jedoch weisen die eingesetzten Techniken den Nachteil auf, dass sie komplex sind und zur Verwerfung des Nährbodens der bezeichneten Mikroalgen führen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung der unerwarteten Eigenschaften des Nährbodens der Mikroalgen, der unter bestimmten Bedingungen große Mengen von superoxyddismutasenartigen Substanzen (SOD like) und sulfatierten Polysacchariden (PS) erzeugen kann.
Superoxyddismutaseartige Substanzen (SOD like) sind Produkte, die die gleiche Aktivitätsart aufweisen wie die Superoxyddismutasen (SOD), jedoch mit dem Vorteil gegenüber letzteren, dass sie thermostabil sind, was bei den Enzymen im allgemeinen und bei den Superoxyddismutasen im besonderen nicht der Fall ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung eines Mikroalgenkulturextraktes, wobei dieses Verfahren im Wesentlichen dadurch charakterisiert wird, dass zunächst die Kultur der genannten Mikroalgen durchgeführt wird, anschließend eine Übersättigung mit Sauerstoff stattfindet, die eine Stoffwechselankurbelung bewirkt, die zu einer Überproduktion von oxidationshemmenden Verbindungen führt.
Die im Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Mikroalgen werden vorzugsweise aus der Gruppe der Rhodophycae, und in erster Linie Porphyridium cruentum (PC) ausgewählt.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Mikroalgenkultur in einem Photo-Bioreaktor des herkömmlichen Typs, in dem die Sonnenenergie oder geeignete Beleuchtung die Durchführung der Photosynthese auf der Grundlage der bezeichneten Kultur unter kontrollierten Bedingungen hinsicht lich Temperatur, pH-Wert und Zufuhr von Kohlenstoffdioxid CO2 ermöglicht.
Die CO2- Versorgung des Nährbodens sowie die für die gute Entwicklung der Mikroalgen erforderliche Bewegung kann durch sprudelnde, mit komprimiertem CO2 angereicherte Luftblasen oder jedwedes gleichwertige Mittel erfolgen.
Nach einer ausreichend langen Kulturzeit in der Größenordnung von 6 bis 12 Tagen, wenn die Zelldichte des Nährbodens optimal ist, werden 100 mg/l Kaliumhydrogenkarbonat zugegeben, dann wird der Reaktor geschlossen und die Kultur über einen Zeitraum in der Größenordnung von 1 bis 3 Tagen fortgesetzt, um bewirkt durch die Übersättigung des Nährbodens mit aus der Photosynthese stammendem Sauerstoff eine Stoffwechselankurbelung auszulösen, wobei das Kaliumhydrogenkarbonat den für diese Photosynthese erforderlichen Kohlenstoff zuführt.
Die Algen werden anschließend durch Zentrifugieren oder Filterung vom Nährboden getrennt. Eine Filterung über einen geeigneten Filter ermöglicht anschließend die Abtrennung des oxidationshemmenden Extrakts.
Bei dem für die Abtrennung des angestrebten Extrakts verwendeten Filter kann es sich um eine Cellulosemembran mit Porengröße 1 bis 1,5 μm handeln.
Das so aus dem Mikroalgennährboden extrahierte Produkt beinhaltet mindestens 30 Einheiten SOD like pro Milliliter, gemessen mit dem unter der Bezeichnung „SOD-525" verkauften Kit. Es beinhaltet außerdem mindestens 1 mg/ml sulfatierte Polysaccharide.
Der hohe SOD like-Gehalt des Extrakts gemäß der Erfindung verleiht diesem entzündungshemmende Eigenschaften, die eine Anwendung in der Rheumatologie finden können, sowie Radikalenfängereigenschaften, die in der Kosmetik bei der Herstellung von Cremes gegen Hautalterung eingesetzt werden können.
Außerdem verleiht der hohe Gehalt an sulfatierten Polysacchariden des Extrakts gemäß der Erfindung diesem Gewebe regenerierende Eigenschaften, die diesen zusammen mit den Radikalenfänger-Eigenschaften der SOD like zu einem ausgezeichneten Produkt für die Wundheilung machen.
Das Produkt gemäß der Erfindung kann ebenfalls dazu verwendet werden, die oxidationshemmenden Wirkungen anderer Pflanzenextrakte zu verstärken, insbesondere bei der biologischen Bekämpfung von Pflanzenschädlingen. So können Produkte mit einer Peroxidasewirkung durch circa 10-prozentige Zugabe des Extrakts gemäß der Erfindung eine deutlich höhere Wirkung zeigen.
Das Produkt gemäß der Erfindung hat den Vorteil, dass es thermostabil ist, insbesondere bei 121°C über zwanzig Minuten.
Je nach der geplanten Anwendung des Extrakts gemäß der Erfindung kann man diesen verwenden so wie er gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gewonnen wird. Man kann jedoch auch die wirksamen Verbindungen trennen, so dass man zwei Produkte mit unterschiedlicher Wirkung erhält, nämlich eines, das die SOD like enthält und ein anderes, welches die sulfatierten Polysaccharide beinhaltet.
Das Abtrennen des Teils, der die SOD like beinhaltet, kann durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittels wie Ethanol oder durch Abtrennen mit Hilfe einer organischen Membran, beispielsweise einer Cellulosemembran, mit Porengröße zwischen 1.000 und 50.000 Dalton erfolgen. Man erhält zwei Extrakte, wobei der eine, der die SOD like einschließt, eine oxidationshemmende Wirkung und eine Radikalenfänger-Wirkung aufweist, während der andere, der die sulfatierten Polysaccharide beinhaltet, eine Gewebe regenerierende Wirkung aufweist.
In Anbetracht der nachfolgenden Beispiele kann man die vorliegende Erfindung besser verstehen; diese Beispiele dienen rein der Illustration der Erfindung und schränken diese keineswegs ein.
BEISPIEL 1
Gewinnung eines Extrakts aus dem Nährboden von Porphyridium cruentum (PC)
In einem 150 l-Photo-Bioreaktor wird die Alge auf einem Nährboden vom Typ Conway – künstliches Meerwasser kultiviert. Die Beimpfung erfolgt per 5 l Kultur mit 5 Millionen Zellen pro Milliliter. Die Durchsprudelung mit Luftblasen wird durch Sonnenenergie oder durch Lampen, welche 100μ Mole/m2/s verteilen, gewährleistet.
Nach 12 Tagen, wenn die Zelldichte optimal ist, werden 100 mg pro Liter, d.h. 15 g KHCO3 zugesetzt, anschließend wird der Reaktor geschlossen und die Kultur 2 Tage fortgesetzt, um eine Stoffwechselankurbelung zu bewirken.
Danach werden die Algen durch Zentrifugieren vom Nährboden getrennt, dann wird letzterer über Cellulosemembran mit Poren 1,2 μm abgefiltert.
Der so gewonnene Extrakt weist einen SOD like-Gehalt von 30 U/ml auf, gemessen mit dem SOD-525-Kit, und einen Gehalt an sulfatierten Polysacchariden von 1 mg/ml.
Dieser Extrakt kann bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert werden, dann in sterile Flaschen abgefüllt werden, ohne dass dieser Vorgang weder die SOD-Wirkung noch den PS-Gehalt abändert.
Man kann ihm auch zwecks anschließender Verwendung bei der Herstellung von Erzeugnissen, beispielsweise Tabletten, durch Gefriertrocknung Wasser entziehen.
BEISPIEL 2
Trennung der Wirkungen
Ausgehend von 10 l des in Beispiel 1 gewonnenen Extraktes trennt man durch Behandlung mit Ethanol den SOD like-Teil von den sulfatierten Polysacchariden, die ausfallen.
So erhält man zwei Extrakte; der eine weist eine durch die Trennung nicht beeinträchtigte Radikalenfängerwirkung auf, und der andere beinhaltet die sulfatierten Polysaccharide und weist eine Gewebe regenerierende Wirkung auf.
Die beiden Extrakte können nach Sterilisierung und Abfüllung in sterile Flaschen jeweils in wässriger Form aufbewahrt werden.
Die beiden Extrakte können nach Gefriertrocknung auch in Form von löslichem Pulver aufbewahrt werden.
BEISPIEL 3
Kosmetikprodukte
1) Creme gegen Hautalterung
In einem geeigneten Mischer wird folgende in Massenanteilen ausgedrückte Mischung hergestellt:
Eine In-vitro-Objektivierung der so gewonnenen Creme ermöglicht die Feststellung, dass die Fibroblasten sich stark vermehrt haben, auch wenn Vermehrungshemmer vor handen sind, die in den Nährboden eingegeben wurden, was ein Indiz für eine trophische und die Wiederherstellung fördernde Wirkung ist.
2) Zerstäuber Gewebeweichmacher für angegriffene Haut
Die Flüssigkeit aus Beispiel 1 wird in eine Flasche mit Stickstoff-Treibmittel abgefüllt.
BEISPIEL 4
Diätetisches Produkt gegen oxidativen Stress
Mit Hilfe des in Beispiel 1 gewonnenen Extraktes werden Gelatinekapseln aus 250 mg Pulver hergestellt, die für den nutrazeutischen und den parapharmazeutischen Bereich bestimmt sind.
Bei Versuchen mit Ratten, die täglich einmal 5 mg Pulver verabreicht bekamen, konnte man eine Zunahme der Radikalenfänger-Substanzen im Blutplasma beobachten.
BEISPIEL 5
Entzündungshemmende Augentropfen
Es werden Augentropfen entsprechend der folgenden Rezeptur hergestellt:
Die so gewonnenen Augentropfen können bei der Behandlung von Bindehautentzündungen eingesetzt werden.
BEISPIEL 6
Nahrungsmittel
Tomatenmark mit 50 Brix-Grad werden 0,1 Massenanteile des Pulvers aus Beispiel 1 zugesetzt, um dessen Haltbarkeitsdauer zu erhöhen.
BEISPIEL 7
Mittel gegen Pflanzenschädlinge
Der auf Pflanzen wie Melone oder Wein angewandte Extrakt aus Beispiel 2, der die PS enthält, bewirkt eine Peroxidasewirkung, die das Zeichen für eine potentielle Resistenz gegenüber Schädlingen wie z.B. Pilzen ist.
BEISPIEL 8
Anwendung bei Polymeren
Nach dem Wasserentzug kann der in Beispiel 1 gewonnene Extrakt in Polymere eingebaut werden, um deren Oxidationsbeständigkeit zu erhöhen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines in der Wärme stabilen Extrakts aus einer Mikro-Algen-Kultur, der eine anti-oxidierende und die Narbenbildung fördernde Wirkung besitzt, indem zunächst die Kultur der oben genannten Mikro-Algen in einem Photo-Bioreaktor unter geeigneter Beleuchtung und kontrollierten Bedingungen, wie Temperatur, pH und Zufuhr von Kohlenstoffdioxid CO2, durchgeführt wird, anschließend eine Übersättigung mit Sauerstoff stattfindet, die Algen dann durch Zentrifugieren aus dem Nährboden entfernt werden und schließlich der genannte Nährboden über einen geeigneten Filter gefiltert wird, um den genannten Extrakt zu trennen, gekennzeichnet dadurch, dass dem Nährboden nach sechs bis zwölf Tagen 100 mg/l Kaliumbikarbonat zugesetzt werden und der Reaktor ein bis drei Tage geschlossen wird, um die Übersättigung mit Sauerstoff zu realisieren.
Verfahren gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass zur Beleuchtung des Photo-Bioreaktors Sonnenenergie verwendet wird.
Verfahren gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Versorgung mit CO2 durch sprudelnde, mit komprimiertem CO2 angereicherte Luft blasen erfolgt.
Verfahren gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass zur Filterung des Nährbodens nach dem Zentrifugieren zum Abtrennen der Algen ein Filter bestehend aus einer Zellulosemembran mit einer Porengröße von 1 bis 1,5 mm verwendet wird.
Extrakt mit anti-oxidierender und die Narbenbildung fördernder Wirkung, hergestellt durch das in den Patentansprüchen 1 bis 4 beschriebene Verfahren, gekennzeichnet dadurch, dass er mindestens 30 U/ml superoxyddismutasenartiger Substanzen (SOD like) und mindestens 1 mg/ml sulfatierte Polysaccharide enthält.
Extrakt mit Anti-Radikal-Eigenschaften, erhalten aus dem Extrakt gemäß Patentanspruch 5 durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittels oder durch Trennung mit Hilfe einer Zellulosemembran, gekennzeichnet dadurch, dass er mindestens 30 U/ml SOD like enthält.
Extrakt mit geweberegenerierender Wirkung, erhalten aus dem Extrakt gemäß Patentanspruch 5 durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittels und durch Trennung mit Hilfe einer Zellulosemembran, gekennzeichnet dadurch, dass er mindestens 1 mg/ml sulfatierte Polysaccharide enthält.
Extrakt gemäß Patentanspruch 6 oder Patentanspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Trennung mit einer Zellulosemembran erfolgt, deren Porengröße zwischen 1000 und 50000 Dalton beträgt.
Extrakt gemäß Patentanspruch 6 oder Patentanspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Ausfällung mit Ethanol erfolgt.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 5 als Anti-Oxidationsmittel bei der Herstellung von Polymeren.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 5 oder Patentanspruch 6 bei der Herstellung von Zusammensetzungen gegen oxidativen Stress für Diätprodukte.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 5 oder Patentanspruch 6 zur Konservierung von Nahrungsmitteln.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 5 bei der Herstellung von Kosmetikprodukten, die zur Verlangsamung der Hautalterung bestimmt sind.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 5 bei der Herstellung von entzündungshemmenden Mitteln, insbesondere in der Rheumatologie.
Verwendung des Extrakts gemäß Patentanspruch 7 bei der Herstellung von Zusammensetzungen, die zur biologischen Bekämpfung von Pflanzenparasiten bestimmt sind.