DE2537277A1

DE2537277A1 - Verfahren zur industriellen zuechtung von schwefelbakterien, die dabei erhaltenen produkte und sie enthaltende mittel

Info

Publication number: DE2537277A1
Application number: DE19752537277
Authority: DE
Inventors: Vincent Petiard
Original assignee: Synthelabo SA
Current assignee: Synthelabo SA
Priority date: 1974-08-26
Filing date: 1975-08-21
Publication date: 1976-03-18
Also published as: FR2283223B1; FR2283223A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen Züchtung von Schwefelbakterien durch "in vitro"-Vermehrung dieser Organismen. Mit diesem Verfahren erhält man Substanzen, die in der Kosmetikindustrie und der pharmazeutischen Industrie verwendet werden können.

Die Klasse der Thiobacteriales oder Schwefelbakterien umfaßt niedere Organismen, die in die Klasse der Schizomyceten und die Unterklasse der Algobacteriales eingeordnet werden. Diese Klasse

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ist in drei Ordnungen aufgeteilt, darunter die der Leukothiobacteriales oder Beggiatoales, die ihrerseits in zwei Familien, die Achromatiaceae und die Beggiatoaceae unterteilt ist. Die Züchtung von Vertretern dieser zweiten Familie ist nun Gegenstand der Erfindung. Die verschiedenen Merkmale der Beggiatoaceae ermöglichen nicht immer ihre leichte Unterscheidung von den Cyanophyceae oder Blaualgen, abgesehen von ihrem Stoffwechsel, der, obwohl er autotroph ist, im allgemeinen nicht die gleichen Zyklen durchläuft.

Man findet die Schwefelbakterien der Familie der Beggiatoaceae in sämtlichen ökologischen wässrigen Medien, nämlich in Meereswasser und Brackwasser (in Flußmündungen und geschützten Buchten) , in stehendem oder langsam strömendem (beispielsweise in Reisfeldern) Süßwasser, in Thermalquellen (beispielsweise von Aix-les-Bains, Bareges, Cauterets, Luchon, Molitg-les-Bains, Enghien-les-Bains, Langenbrücker, Bagni di Lucca etc.). Sie entwickeln sich unter Bildung von weißlichen oder graugefärbten Massen. Ihre Anordnung auf dem natürlichen Medium hängt von Veränderungen des enthaltenen Schwefelwasserstoffgehaltes ab und kann von einer Jahreszeit zur anderen und im Verlaufe der Jahreszeiten sich ändern.

Das allgemeine morphologische Aussehen der Beggiatoaceae variiert mit den betrachteten Arten. Ihre gemeinsamen Eigenschaften sind die Abwesenheit einer Pigmentierung und eine keine Verästelungen aufweisende Fadenstruktur mit mehr oder weniger eng benachbarten Scheidewänden. Gewisse Fäden können geradlinig sein, während andere spiralförmig geformt und wieder andere zu einer einzigen Hülle vereinigt sein können.

Physiologisch ist das gemeinsame Merkmal der Beggiatoaceae ein autotropher Stoffwechsel, der in den Schwefelzyklus eingreift. Diese Organismen oxidieren Schwefewasserstoff und bewirken

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eine Ansammlung des Schwefels in ihrem Zytoplasma und in gewissen Fällen auch in dem sie umgebenden Medium. Falls in ihrer Umgebung kein Schwefelwasserstoff vorhanden ist, können sie gegebenenfalls den gespeicherten Schwefel verwerten, indem sie ihn zu Schwefelsäure oxidieren. Aus diesen Oxidationen gewinnen sie die zu ihrer Entwicklung notwendige Energie. Es ist zu unterstreichen, daß man in gewissen Fällen heterotrophe Beggiatoaceae-Stämme antreffen kann. So wurde von einigen Autoren die Art Beggiatoa als heterotroph beschrieben. Andererseits haben S.Haier und R.Y.Morita einen an die Heterotrophie angepaßten Beggiatoa-Stamm isoliert und vermehrt. Dieser Stamm ist in der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 15551 hinterlegt und wird auf einem Medium auf der Grundlage von Hefeextrakt und Acetat als organische Nährstoffquelle gehalten.

Als Beggiatoaceae-Arten kann man beispielsweise nennen Beggiatoa, Leucothrix, Thioploca, Thiospirillopsis und Thiotrix, die durch ihr morphologisches und zytologisches Aussehen sowie die Art und Weise der Assoziierung ihrer Fäden differenziert werden können. Häufig ist es schwierig, verschiedene Formen einer gleichen Art festzustellen. Gewisse Autoren haben zum Definieren dieser Arten die Abmessungen der Fäden verwendet, nämlich entweder die Länge oder den Durchmesser des Trichoms.

In der Gattung der Beggiatoa wurden die folgenden Arten definiert; Beggiatoa alba, B.arachnoida, B.leptomitiformis, B.minima, B.gigantea und B.mirabilis.

In der Gattung der Thiotrix wurden beispielsweise die folgenden Arten gefunden: Thiotrix nivea, T.tenuis und T.tenuissima.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man in vitro reine Stämme von Schwefelbakterien der Familie der Beggiatoaceae

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unter sterilen Bedingungen züchtet. Ausgehend von Organismen natürlichen Ursprungs werden axenische und reine Beggiatoaceae Stämme isoliert und unter künstlichen Umgebungsbedingungen vermehrt.

A) Die Kulturmedien können sehr unterschiedlich sein und mehr oder weniger an die Nährwässer angenähert sein, die das ökologische Medium der Ausgangsprobe ausmachen, oder können mit diesen identisch sein. Man kann auch bekannte und von einer Vielzahl von Autoren genannte Medien anwenden, wobei erhebliche Variationen hinsichtlich der Menge ihrer verschiedenen enthaltenen Bestandteile möglich sind. Diese Medien können halbfest oder flüssig sein. Sie enthalten not wendigerweise eine Mineralstoffquelle (eine Quelle für mineralische Elemente) und gegebenenfalls eine Quelle für organische Nährstoffe (Elemente).

Beispielsweise verwendet man als Mineralstoffquelle die folgenden Lösungen:

1. Lösung nach Keil (abgekürzt als K bezeichnet)

Bestandteile Konzentration des Mediums

in mg/1

Magnesiumsulfat 5000

Monokaliumcarbonat 5000

Tricalciumphosphat 200

Ammoniumsulfat 100

Kaliumchlorid 100

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Ft MEER-MÜLLER-STEINMEiSTER

2. Lösung nach Langenbrücker (abgekürzt als L bezeichnet)

Bestandteile Konzentration des Mediums

in mg/1

Saures Calciumcarbonat	3400
Saures Magnesiumcarbonat	2700
Calciumsulfat	3100
Magnesiumsulfat	5100
Natriumsulfat	2100
Kaliumsulfat	200
Calciumphosphat	200
Kaliumchlorid	100
Kaliumsulfid	100
Eisensulfid	100
Calciumsulfid	100
3. Lösung T
Bestandteile	Konzentration des Mediums
	in mg/1

Ammoniumsulfat 150

Magnesiumsulfat 100

Dikaliumphosphat 100

Calciumnitrat 100

4. Lösung nach Haier und Morita (abgekürzt als HM bezeichnet) Calciumchlorid 100 mg/1 des Mediums

wobei diese Lösungen mit Leitungswasser gebildet sind, von dem angenommen wird, daß es die mineralischen Spurenelemente enthält, die für die Züchtung der Stämme notwendig sind.

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TEH MtER-MULLER-STEINMEISTER

25	bis	1000	mg/1
25	bis	10OO	mg/1
25	bis	3000	mg/1
25	bis	500	mg/1

In gewissen Fällen versetzt man diese Mineralstofflösungen mit organischen Elementen, die entweder eine direkte Nährstoffwirkung haben oder eine enzymatische Rolle spielen und insbesondere eine Peroxydasewirkung oder eine Katalasewirkung entfalten.

Die verwendeten Verbindungen sind beispielsweise:

Natriumacetat
Pepton (Difco)
Hefeextrakt (Difco)

Schwefelhaltige Aminosäuren
(Cystein, Cystin, Methionin ...)

Katalase 2500 bis 50 0OO enzymatische

Einheiten/1

Die Konzentration der zugeführten organischen Elemente kann und muß häufig im Verlaufe der aufeinanderfolgenden Umpflanzungen (Repikierungen) während der Periode der Reinigung des Stammes zunehmen.

B) Die angewandten Züchtungsbedingungen können ebenfalls stark variiert werden:

Im allgemeinen züchtet man die Beggiatoaceae im Dunkeln, da der Stoffwechsel keine durch Pigmente verwertbare Lichtenergie benötigt. Jedoch ist eine Beleuchtung nicht besonders schädlich, was durch die Umgebungsbedingungen von bestimmten natürlichen ökotypen bewiesen wird.

Häufig züchtet man die Organismen bei einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C und noch bevorzugter zwischen 25°C und 35°C.

Im allgemeinen bringt man die Kulturen in eine Luftatmosphäre ein, die mit unterschiedlichen Schwefelwasserstoffgehalten

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versetzt ist, die zwischen 0,1 und 5 Vol.-% und noch bevorzugter zwischen 0,5 und 2,5 Vol.-% variieren. Im Fall von heterotrophen Stämmen oder an die Heterotrophie angepaßten Stämmen ist es nicht mehr unbedingt notwendig, die Kulturen mit Schwefelwasserstoff zu versorgen, obwohl dies nicht schädlich ist und in gewissen Fällen sogar das Wachstum in geringem Umfang verbessert.

Die Züchtung in flüssigem Medium erfolgt mit oder ohne schwache Bewegung des Mediums und der Organismen oder mit oder ohne langsame Zirkulation des Mediums über die an Substrate gebundenen Organismen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Isolierung eines Beggiatoaceae-Stammes der Art Thioploca

Man entnimmt die Organismen aus natürlichen, Beggiatoaceae enthaltenden Ökosystemen unter möglichst strengen aseptischen Bedingungen. Die entnommenen Organismen sind weder steril noch enthalten sie lediglich eine Art von Organismen. Aufgrund der angewandten Vorsichtsmaßnahmen erzielt man jedoch einen geringeren Gehalt an Parasitenelementen als man ohne Anwendung dieser Maßnahmen gewinnen kann. Die entnommenen Proben werden aseptisch in unterschiedlichen Mengen in Kulturröhrchen, die flüssige Nährstoffmedien enthalten, aufgeteilt und dort inokuliert.

Diese Medien bestehen aus den folgenden Lösungen, die gemäß den Angaben in der folgenden Tabelle I vereinigt werden:

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TER MEER-MULLER-STEiNMEISTER

Mineralstofflösung K
Mineralstofflösung T

Organische Nährstofflösung N, die die folgenden Bestandteile enthält:

Natriumacetat

Pepton

Hefeextrakt

100 mg/1 100 mg/1 100 mg/1

Lösung MC von schwefelhaltigen Aminosäuren, die die folgenden Bestandteile enthält:

Methionin
Cystein

100 mg/1 100 mg/1

In der Tabelle I (und im folgenden) weist die Bezeichnung einer Lösung (beispielsweise N) darauf hin, daß sie in der definierten Form verwendet wird, während ein Bruch (beispielsweise N/2) bedeutet, daß eine dem Nenner gleiche Konzentration der Grundlösung angewandt wird.

Tabelle I

Bezeichnung der Medien gemäß ihrer Zusammensetzung

\	Mineralstoff lösung	K	K	T	T
Organische Nährstoff lösung		K		T
N/4		K	K N/4	T	T N/4
N/2		K N/2	T N/2
N		K N	T N
N/4 MC		N/4 MC	N/4 MC
N/2 MC		N/2 MC	N/2 MC
N MC		N MC	N MC

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= R MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

Nach dem gegebenenfalls erforderlichen Einstellen der verschiedenen Medien auf einen pH-Wert von 7,5 werden die Medien in Mengen von jeweils 10 ml in Reagenzgläser eingebracht. Die Reagenzgläser werden mit nicht fest zusammengedrückten, kardierten Baumwollstopfen verschlossen. Anschließend werden sie während 20 Minuten im Autoklaven bei einem Dampfdruck (Wasserdampfdruck) von 0,5 bar sterilisiert.

Nach dem Inokulieren werden die Reagenzgläser in Exsiccatoren eingebracht, die eine Atmosphäre enthalten, die aus Luft und H₂S in einem Volumenverhältnis von 97,5:2,5 zusammengesetzt ist. Die Exsiccatoren werden dann in einer vollständigen und permanenten Dunkelheit bei einer Temperatur von 30⁰C gehalten. Nach 21 Inkubierungstagen kann man folgende Beobachtungen machen:

1. Makroskopische Untersuchung.

Einige wenige Reagenzgläser enthalten ein Medium, das durch stark entwickelte Verunreinigungen deutlich getrübt ist. Dieser geringe Grad einer erheblichen Infektion ist offenbar die Folge der scharfen Züchtungsbedingungen, die die Entwicklung der Parasiten einschränken.

In der Mehrzahl der Reagenzgläser, deren Medium klar ist, beobachtet man weißliche Massen, die sich am Boden der Reagenzgläser abgeschieden haben und die das gleiche Aussehen wie das Ausgangsimplantat haben, jedoch in größeren Mengen vorhanden sind.

Gewisse Röhrchen enthalten gelbe Abscheidungen, die offenbar aus Schwefel bestehen, was einen aktiven Stoffwechsel der Kulturen verdeutlicht.

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2. Mikroskopische Untersuchung.

Die Beobachtungen der Kulturen erfolgen an mit dem Nährmedium gebildeten ungefärbten Präparaten mit einer 200-fachen bis 1000-fachen Vergrößerung unter Anwendung der Phasenkontrasttechnik.

An der Mehrzahl der Präparate ist eine fast allgemeine, jedoch eingeschränkte Verunreinigung der Kulturen festzustellen. Diese Verunreinigung ist umso stärker entwickelt, umso reicher das Medium an organischen Nährstoffelementen ist.

In allen Kulturen ist die Anwesenheit von mehreren Beggiatoaceaearten festzustellen, und zwar überwiegend Thioploca, Beggiatoa und Thiothrix, wobei die relativen Mengen der verschiedenen Arten mit den verwendeten Medien und bei ein und demselben Medium mit den Reagenzgläsern variieren. Wahrscheinlich sind diese Unterschiede direkt eine Folge der Verteilung der verschiedenen Arten in dem Ausgangsimplantat.

Häufig kann man mehr oder weniger starke Schwefelansammlungen in dem Zellenzytoplasma und in gewissen Fällen auch in dem Medium beobachten.

Dann wurden die am stärksten entwickelten und die am wenigsten verunreinigten Kulturen, deren zytologisches Aussehen ein zufriedenstellendes Wachstumspotential erwarten läßt (mittlere Ansammlung von Schwefel, Anwesenheit von langen Fäden, Abwesenheit von stark plasmolysierten Zellen, geringe Anwesenheit von Zellbruchstücken etc.) in die gleichen Medien umgepflanzt. Nach Ablauf der ersten 4 oder 5 Wachsturnsζyklen lassen sich die obigen Beobachtungen bestätigen, wobei man für gewisse Reagenzgläser die folgenden zwei Tatsachen feststellen kann:

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TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

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Ein progressives Verschwinden der Verunreinigungen,das durch kräftiges Spülen mit dem sterilen Kulturmedium bei dem Umpflanzen begünstigt wird, und

eine progressive Zunahme der Anwesenheit von Organismen der Art Thioploca, in Bezug auf die anderen Beggiatoaceae-Arten.

Die bevorzugte Umpflanzung der die oben angegebenen Charakteristika aufweisenden Organismen führt zu einem axenischen (passiv resistenten) und reinen Beggiatoaceae-Stamm der Art Thioploca/ der durch sein besonderes zytologisches Aussehen charakterisiert werden kann (insbesondere aufgrund einer Vereinigung von mehreren parallelen Fäden in einer gleichen Hülle, dessen mittlerer Durchmesser etwa 16 bis 20 μπι beträgt), dessen Art jedoch noch nicht definiert worden ist.

Beispiel 2

Isolierung eines Beggiatoaceae-Stammes der Art Beggiatoa

Unter den zu Beginn des Beispiels 1 beschriebenen Bedingungen gewinnt man Organismen natürlichen Ursprungs und inokuliert sie in Petrischalen (Durchmesser 55), die halbfeste Nährstoffmedien enthalten. Diese bestehen aus den folgenden Lösungen, die gemäß den Angaben der folgenden Tabelle II vereinigt werden:

Mineralstofflösung HM

Organische Nährstofflösung N_A der folgenden Zusammensetzung:

Natriumacetat 500 mg/1

Hefeextrakt 2000 mg/1

Enzymlösung C

Katalase 20000 Einheiten/1

Gelbildner

Agar-Agar 2000 mg/1

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TER MEtR-MULLER-STEINMEISTER

Tabelle II

Bezeichnung der Medien entsprechend ihrer Zusammensetzung

Mineralstoff- lösung	^v Enzym- >w lösung Organisches. Nährstoff- X_n^ lösung ^v	C	C/2	C/4
HM HM HM	^NA N_A/2 V⁴	HMN₅C H M N_A/2 C H M N_A/4 C	H M N_A C/2 H M N_A/2 C/2 H M N_A/4 C/2	H M N_A C/4 H M N₂/2 C/4 H M N_A/4 C/4

Nach dem gegebenenfalls erforderlichen Einstellen der Nährstoffmedien auf einen pH-Wert von 7,5 werden sie während 20 Minuten bei einem Dampfdruck von 0,5 bar im Autoklaven sterilisiert, bevor man die Katalase-Lösung zusetzt. Die Katalase wird durch Filtrieren über eine Membran (Porendurchmesser 0,2 μΐη) sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen vor dem Verfestigen und Verteilen des im Autoklaven sterilisierten Mediums in die Petrischalen zugesetzt.

Nach dem Inokulieren werden die Petrischalen entweder unter identischen Bedingungen zu den in Beispiel 1 beschriebenen (in einer Schwefelwasserstoff enthaltenden Atmosphäre) oder unter identischen Bedingungen, mit Ausnahme der Anwesenheit von H₂S, behandelt. Nach 21 Züchtungstagen kann man die gleichen Beobachtungen machen, wie sie in Beispiel 1 angegeben sind.

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ER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

- yl -

Mit Hilfe von aufeinanderfolgenden Umpflanzungen kann man einen Beggiatoa-Stamm herausselektionieren. Sein zytologisches Aussehen ist für diese Art charakteristisch (insbesondere gerade Scheidewände aufweisende Fäden mit einem Durchmesser von etwa 15 μΐη) . Die Art ist nicht bereits definiert worden. Andererseits ist festzustellen, daß dieser Stamm nicht strikt autotroph ist. In der Tat kann man ihn einerseits in einer von Schwefelwasserstoff freien Atmosphäre gewinnen und andererseits ohne Schwierigkeit diesen Schwefelwasserstoff aus der Umgebung der Kulturen entfernen, die in seiner Gegenwart erhalten worden sind.

Beispiel 3

Erhaltung und Vermehrung eines reinen Stammes von Beggiatoa sp.

Ein unter ähnlichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben sind, isolierter Stamm wird durch aufeinanderfolgende Umpflanzungen auf ein Nährmedium erhalten, das identisch mit dem ist, aus dem der Organismus isoliert wurde, wobei man in einer ersten Stufe auf einem halbfesten Nährmedium und in einer zweiten Stufe in einem flüssigen Medium arbeitet.

Es wurden verschiedene Untersuchungen hinsichtlich der Optimierung des Wachstums und der Vermehrung durchgeführt, wobei dieser Stamm als Vergleichsstamm diente.

In dieser Weise konnten die für eine schnelle Zunahme der Biomasse günstigsten Züchtungsbedingungen ermittelt werden.

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R MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

1. Bedingungen des Mediums

Eine progressive Erhöhung der organischen Nährstoffe, die zu einer praktisch vollständigen Anpassung des Stammes an die Heterotrophie führt, begünstigt seinen Stoffwechsel und demzufolge seine Vermehrung. Die zusätzliche Zuführung von organischem Material kann mit Hilfe der in der Beschreibung angegebenen Verbindungen und Materialien erfolgen, ohne daß die Hauptnachteile auftreten, die bei der Isolierung zu beobachten sind, insbesondere eine Zunahme des Verunreinigungsgrades.

2. Bedingungen der Atmosphäre

Aufgrund der Anpassung an die Heterotrophie ist die Zuführung von Schwefelwasserstoff nicht unerläßlich, obwohl man das Wachstum stimulieren kann, wenn man der Atmosphäre Schwefelwasserstoffgehalte im Bereich von 1 bis 2 Vol.-% zuführt.

3. Temperaturbedingungen

Eine Temperatur von etwa 30⁰C ist für die Vermehrung des Stammes am günstigsten.

4. Beleuchtungsbedingungen

Für ein gutes Wachstum ist eine Beleuchtung überhaupt nicht notwendig. Diese Eigenschaft ist aufgrund der überhaupt nicht vorhandenen Pigmentierung dieser Art vorhersehbar.

Unter den oben angegebenen Bedingungen kann man in der exponentiellen Phase Wachstumsgeschwindigkeiten beobachten, die einer Verdopplung des Frischgewichtes der Biomasse in Zeiträumen zwischen 2 und 5 Tagen entspricht.

Beispiel 4

Züchtung eines Stammes von Beggiatoa sp. in einer Fermentiereinrichtung (Fermenter)

Der nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise isolierte und gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 3 erhaltene Stamm

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von Beggiatoa sp. wird in einer Fermentiereinrichtung mit einem Nutzvolumen von 12 1 (Magnaferm, New-Brunswick) gezüchtet.

Man wendet die folgenden experimentellen Bedingungen an:

1. Man verwendet das flüssige Nährstoffmedium der Bezeichnung HMN, C/2 (das frei von Agar-Agar ist) (vgl. Tabelle II), das vor der Zugabe von Katalase im Autoklaven während 25 Minuten bei einem Dampfdruck von 0,5 bar sterilisiert worden ist.

Die Katalase wird nach dem Sterilisieren durch Membranfiltration gleichzeitig mit dem Inokulum in das Medium eingeführt.

2. Die Inokulation erfolgt ausgehend von einer Kultur in einem Erlenmeyer-Kolben, der durch Zuführung von steriler Luft unter Überdruck gehalten wird.

3. Fermentierparameter:
pH-Wert =7,5

Belüftung =100 bis 300 ml Luft pro Liter Medium und pro Minute

Temperatur = 30⁰C

Rührbewegung = 50 bis 100 U/Miri

Vollständige und permanente Dunkelheit, ausgenommen während des Bedienens der Vorrichtung

Fermentierdauer: 21 Tage

Wenn man mit dem Stamm von Beggiatoa sp. derart inokuliert, daß man eine Anfangsdichte von 5 g/l erhält, so gewinnt man gegen Ende der Züchtung eine Dichte der Biomasse von etwa 150 g/l. Dieses Wachstum entspricht einer Verdopplungsdauer während der exponentiellen Phase von etwa 3 1/2 Tagen.

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TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

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Beispiel 5

Gebundene Züchtung eines Stammes von Thioploca sp.

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gewinnt man einen Stamm von Thioploca sp. Nach dem Optimieren der Wachstumsbedingungen und dem Erhalt dieses Stammes züchtet man ihn wie folgt:

1. Die Organismen verbinden sich fest mit rauhen Trägern (beispielsweise Holz), die regelmäßig im Inneren eines zylindrischen Züchtungsbehälters angeordnet sind.

2. Nachdem man es während 20 Minuten unter einem Dampfdruck von 0,5 bar im Autoklaven sterilisiert hat, führt man das Nährstoff medium KN (vgl. Tabelle I), das an organischen Nährstoffen angereichert ist, in die Vorrichtung ein, die ihrerseits zuvor während 30 Minuten bei einem Dampfdruck von 1 bar im Autoklaven sterilisiert worden ist. Nach dem Inokulieren wird das Medium während 2 bis 4 Stunden nicht bewegt, um ein Anhaften der Organismen an dem Substrat zu ermöglichen.

3. Anschließend führt man das Medium kontinuierlich im Kreislauf über die Oberfläche, wobei man eine Geschwindigkeit von etwa 1 l/h pro Bindungsfläche von etwa 120 cm² anwendet. Während man dieses Medium ständig im Kreislauf führt, beschickt man es intermittierend mit Schwefelwasserstoff, um einen konstanten Schwefelwasserstoffgehalt von 1 bis 2 Vol.-% aufrechtzuerhalten. Weiterhin beschickt man es mit Sauerstoff, indem man konstant sterile Luft in einer Menge von 100 bis 300 ml/l/Min zirkulieren läßt.

4. Es werden die folgenden Züchtungsbedxngungen eingehalten: pH-Wert = 7,5

Temperatur = 30⁰C

Vollständige und permanente Dunkelheit, ausgenommen während der Handhabung der Vorrichtung

Vermehrungsdauer: 21 Tage.

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ER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

Nach Ablauf der Züchtungsdauer beobachtet man auf der Oberfläche einen praktisch kontinuierlichen,weißlichen Teppich, der aus Thioploca-Fäden besteht. In dieser Weise erhält man eine Biomasse, die etwa dem 5- bis 10-fachen des Implantats entspricht.

Die Beispiele 4 und 5 betreffen halbtechnische Untersuchungen, die nicht erkennen lassen, daß die verwendete Vorrichtung für die gezüchtete Art spezifisch ist. Sie zeigen lediglich, daß es unter gewissen Bedingungen, an die ein Stamm sich nach dem Erhalt und der Vermehrung angepaßt hat, möglich ist, durch in vitro-Züchtung von Beggiatoaceae erhebliche Biomassen aus diesen Organismen zu gewinnen. Die Gewinnung anderer Stämme der gleichen Art ermöglicht die Anwendung anderer Vorrichtungen.

Weiterhin scheinen nach der Isolierung und der Erhaltung die relativen Unterschiede der verwendeten Nährstoffmedien keinen direkten Einfluß auf die Ergebnisse zu haben, ausgenommen, wie es bereits in Beispiel 1 beschrieben wurde, die Verunreinigungsgrade. Es scheint so zu sein, daß die Gewinnung eines Stammes von Beggiatoaceae durch in vitro-Züchtung mehr von dem Anpassungspotential der Ausgangsprobe abhängt als von den eigentlichen Kulturbedingungen, vorausgesetzt, daß diese mit der Biologie und dem Stoffwechsel dieser Organismen verträglich sind.

Die Wiederholung von wichtigen und aufeinanderfolgenden Untersuchungen mit Proben unterschiedlichen Ursprungs, die in unterschiedlichen Stadien entnommen worden sind, ist daher eine wesentliche Bedingung für den Erfolg der Isolierung.

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TEH MtER-MULLER-STEINMEISTER

Eine langsame und progressive Veränderung der Züchtungsbedingungen, die zur Ermittlung der optimalen Parameter angewandt wird (vgl. Beispiel 3), führt ebenfalls zu einer Entwicklung des Stammes bis zu einer richtigen Anpassung an die in vitro-Kultur. Die Gewöhnung der Beggiatoa-Stämme an die Autotrophie ist ein typisches Beispiel dafür.

Nach der Gewinnung und der Auswahl eines angepaßten Stammes stellt die überführung in das Stadium der halbtechnischen Untersuchungen, wie sie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben sind, keine großen Schwierigkeiten insofern dar, als es sich nur um eine Extrapolierung der Bedingungen der Erhaltungszüchtung handelt.

Die durch die oben beschriebenen Züchtungsverfahren oder den Varianten davon erhaltenen Biomassen werden entweder

stabilisiert, beispielsweise durch Gefriertrocknen oder durch Sterilisieren (beispielsweise auf chemischem Wege), oder

in einzelne Zellbestandteile der Zelle, wie die Membran das Zytoplasma, etc. (insbesondere differentielles Zentrifugieren) aufgetrennt,

oder mit spezifischen, alkoholischen oder wässrigen Lipidlösungsmitteln extrahiert, wodurch es möglich wird, die Bestandteile der Zellen, insbesondere die Proteine und die Aminosäuren, insbesondere die schwefelhaltigen Aminosäuren, und die Mucopolysaccharide etc. zu gewinnen. Diese ,Extraktionen können nach einer chemischen oder enzymatischen Lyse der Biomassen durchgeführt werden.

Anhand von Laboratoriumsuntersuchungen an Tieren konnte zunächst festgestellt werden, daß die gewonnenen Substanzen in den oben erwähnten verschiedenartigen Formen (Biomasse, Zellbestandteile, Extrakte) die Haut und die Schleimhäute nicht reizen (Unter-

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suchungen auf der rasierten Haut der Ratte und des Meerschweinchens und der Hornhaut des Kaninchens) und nicht allergisch wirken (Untersuchung am Meerschweinchen). Sie besitzen jedoch eine lokale antiinflainmatorische Wirkung (nachgewiesen anhand des durch Ultraviolettstrahlung an der Ratte verursachten Erythems) und eine vernarbende Wirkung (an künstlichen Verletzungen der Ratte gezeigt).

Andererseits erkennt man die Wirkung des Schwefels und der dieses Metalloid enthaltenden Verbindungen gegen Akne und Seborrhöe. Schließlich kann man eine günstige Wirkung auf die Hauthydratation beobachten.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch kosmetische und pharmazeutische Präparate, die die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen aktiven Substanzen in ihren unterschiedlichen Formen in üblichen, für die topische Anwendung geeigneten Bindemitteln, Trägermaterialien und Hilfsstoffen enthalten, wie in Salbengrundlagen, Cremes, Milchpräparaten, Suspensionen oder Lösungen. Beispielsweise kann man Salben, Cremes oder Milchpräparate auf der Grundlage von Wasser-in-Öl-Emulsionen oder Öl-in-Wasser-Emulsionen (Feuchtigkeitscremes, Nährcremes, Reinigungscremes, Tagescremes etc., Toilettmilchpräparate oder Abschminkmilchpräparate etc.) und Lösungen oder Suspensionen (beispielsweise Kapillarlotionen) nennen.

Der Wirkstoffgehalt variiert zwischen 0,5 und 25 Gew.-% des Wirkstoffs, bezogen auf die Gesamtmenge des Produktes, wobei ein Gehalt zwischen 1 und 15 Gew.-% und insbesondere zwischen 2 bis 5 Gew.-% besonders bevorzugt ist.

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Claims

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Case (ET)9254/51

Patentansprüche

Verfahren zur industriellen Züchtung von Schwefelbakterien der Familie der Beggiatoaceae durch "in vitro"-Vermehrung, dadurch gekennzeichnet, daß man axenische und reine Beggiatoaceae-Stämme isoliert und unter sterilen und künstlichen ümgebungsbedxngungen vermehrt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein halbfestes Kulturmedium anwendet .
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges Kulturmedium verwendet .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium und die darin enthaltenen Organismen schwach bewegt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Fermentiereinrichtung arbeitet.
6. Verfahren nach Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, daß man das flüssige Medium im Kreislauf über die an Substrate gebundenen Organismen führt.

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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium das lediglich sterilisierte natürliche Nährmedium verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennz eichnet, daß das Nährmedium vollständig oder zum Teil künstlich hergestellt ist und notwendigerweise eine Quelle für mineralische Elemente und gegebenenfalls eine Quelle für organische Elemente (organische Nährstoffe) enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mineralstoffquelle überwiegend Salze von Calcium und/oder Magnesium und/oder Natrium und/oder Kalium und/oder Ammonium und/oder Eisen enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 8,dadurch gekennzeichnet, daß die organische Nährstoffquelle überwiegend ein Acetat und/oder Pepton und/oder einen Hefeextrakt und/oder schwefelhaltige Aminosäuren und/oder ein Enzym mit Peroxydase- oder Katalase-Wirkung enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennz eichnet, daß man die Organismen im Dunkeln züchtet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennz eichnet, daß man die Organismen unterschwacher Beleuchtung züchtet.

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13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennz eichnet, daß man die Organismen bei einer Temperatur zwischen 2O°C und 4O°C züchtet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur zwischen 25⁰C und 35⁰C arbeitet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennz eichnet, daß man das Wachstum durch Zugabe von Schwefelwasserstoff zu der Umgebungsatmosphäre begünstigt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Schwefelwasserstoffgehalt zwischen 0,1 und 5 Vol.-% anwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Schwefelwasserstoffgehalt zwischen 0,5 und 2,5 Vol.-% anwendet.
18. Verfahrensprodukte,erhältlich gemäß einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 17.
19. Produkte nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Biomasse, in Form von Zellbestandteilen oder in Form von Zellextrakten vorliegen.
20. Kosmetische und pharmazeutische Präparate, dadurch

g e R e η η ζ e ic h η e t, daß sie aus einer gemäß einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 17 erhältlichen Substanz als Wirkstoff und kosmetisch bzw. pharmazeutisch inerten Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen bestehen.

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21. Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer für die topische Auftragung geeigneten Form vorliegen.

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