DE2602996A1

DE2602996A1 - Zubereitung und verfahren zur untersuchung der empfindlichkeit von mikroben gegenueber antifolat-antimikrobenmittel sowie verfahren zur herstellung der zubereitungen

Info

Publication number: DE2602996A1
Application number: DE19762602996
Authority: DE
Inventors: Stanley Robert Morris Bushby; Thomas Anthony Krenitsky
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1975-01-27
Filing date: 1976-01-27
Publication date: 1976-07-29
Also published as: FR2303855A1; US4097337A; FI56856B; DK145880C; FI56856C; DK33076A; JPS5198378A; JPS5843079B2; FR2298554B1; ZA76459B; IL48906A; JPS58170478A; IT1053463B; ES444643A1; SE7600819L; DK145880B; NL7600802A; CA1077379A; GB1513461A; IL48906A0

Description

DR-BERG DIFL.-ING. STAPF _ocnOQQR

DIPL.-ING- SCHWABE DR. DR. SANDMAIR 2 D U I 3 y D

PATENTANWÄLTE

8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 860245

Anwaltsakte 26 735 27. JA'-: 1-76

Be/Ro

The Wellcome Foundation Ltd. London / England

"Zubereitung und Verfahren zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Mikroben gegenüber Antifolat-Antimikrobenmittel sowie Verfahren zur Herstellung der Zubereitungen"

Diese Erfindung betrifft Kulturmedien für Mikroben und im besonderen Kulturmedien die zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antifolat-Antimikrobenmitteln wie Sulphamethoxazol (SMX) und/oder Trimethoprim (TMP) geeignet sind.

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Es ist seit Jahren bekannt, daß Kulturmedien häufig zur routinemäßigen Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Sulphonamiden oder Trimethoprim, d.h» Mitteln, die die Bildung von Polaten in diesen Organismen stören, ungeeignet sind. Diese Ungeeignetheit äußert sich als solche durch lange Schwanzendpunkte beim Reihenverdünnungstest und durch einen Teilwuchs in den Inhibierungszonen bei Verwendung des Diffusionsverfahrens. Es wurde von Bushby (Med. J. Aust. Special Supplement (1973) 1:10) und Koch und Burchal (Applied Microbiology (1971) 22:812) aufgezeigt, daß Thymidin ein sehr starkes Umkehrmittel hinsichtlich der Inhibierungsaktivität der Sulphonamide und Trimethoprim ist.

In dem Aufsatz von Harper und Cawston 1945, (J. Path, Bact., 57:59) ist angegeben, daß wenn man lysiertes Pferdeblut zu einem Testmedium mit einer geringen Empfindlichkeit zugibt, dieses dahingehend umgewandelt wird, daß es befriedigend arbeitet. Seit dieser frühen Kenntnis und durch andere Arbeiten angeregt, ist es allgemein üblich, lysiertes Pferdeblut in Untersuchungsmedien zur antibakteriellen Empfindlichkeit einzuführen, um den häufig beobachteten Teilwuchs innerhalb der durch die Sulphonamide gebildeten Inhibierungszonen zu verringern. Neuerdings hat sich dieses Verfahren bei der Untersuchung im Hinblick auf die Wirksamkeit von Trimethoprim in ähnli-

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eher Weise wirksam gezeigt- (Bushby, Postgraduate Med. J. (1969) 45s 10 und Darreil u.a., J. Clin. Path (1968) .21:202)

Harper und Cawston haben festgestellt, daß

a) lysiertes Pferdeblut wirksamer ist als das ganze Blut zum Neutralisieren der Sulphonamid antagonisierenden Substanz(en),

b) Blut von verschiedenen anderen Species inaktiv waren

c) sich die Aktivität des Lysats bei Bebrütungszeiten und Temperaturen (bis zu 30⁰C) erhöht, und

d) das iysat nicht die Umkehrreaktion der Sulphonamidinhibierung durch p-Aminobenzoesäure beeinflußt.

Sie schließen daraus, daß lysiertes Blut einen Faktor enthält, der .Sulphonamid-antagonisten neutralisiert.

Dieser so bezeichnete Harper-Cawston-Faktor ist nur bei Medien wirksam, die einen mäßigen Gehalt an Thymidin, deh«, von etwa 0,1 bis 15/ug/ml enthalten. Unter 0,1 /ug/ml wird die Wirksamkeit der Arzneimittel nicht antagonisiertj es hat daher die Entfernung einer solchen geringen Menge von Thymidin keine Wirkung auf die beobachtete Arzneimittelinhibierung. Bei sehr hohem Thymidingehalt, d,h. mehr als 15/Ug/ml, ist der Harper-Cawston-Faktor nicht ausreichend, die Umkehrung der Aktivität der Sulphonamide und Trimethoprim auszugleichen, möglicherweise weil die · hohe Thymin-

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konzentration, die als Folge der Thymidinspaltung entsteht, das wirksame Thymidin in der Umkehrung ersetzen kann.

Es wird berichtet, daß der Harper-Cawston-Faktor eine Ihymidin-Phosphorylase ist (Bushby in Trimethoprim/Sulfamethoxazol in Bacterial Infections: A Wellcome Foundation Symposium - Ed Bernstein & Salter, Churchill Livingston, Edinburgh & London, 1973₅ Seiten 31 - 38, und Bushby Med. J. Aust. Special Supplement, 1973, 1: 10-18). Es wurde in der letzteren Bezugsstelle ausgeführt, daß "obgleich Thymidin die in vitro-Aktivität von TMP/SMX beeinträchtigt, es gewöhnlich nicht in Tieren in ausreichend hohen Konzentrationen vorhanden ist, um die in vivo-Aktivität zu beeinflussen".

Ein Nachteil der Zuführung von lysierteni Pferdeblut in ein Kulturmedium besteht darin, daß dieses dem Medium eine rötlich-braune Farbe verleiht; je größer die Pferdeblutmenge, umso dunkler die Farbe. Diese Färbung ist unerwünscht, weil sie die Bestimmung des bakteriellen Wuchses nach Bebrüten wesentlich beeinträchtigt. Beispielsweise senkt im Falle von flüssigen Medien die verstärkte Farbe die Transparenz der Medien, wodurch optische Dichtemessungen wesentlich ungenauer werden. Bei festen Medien ist es durch eine Kontrastverringerung des Agars schwieriger, ge-

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nau die Inhibierungszonengrößen zu messen und das Vorhandensein oder Fehlen von Teil-wuchs innerhalb der Inhibierungszonen zu bestimmen. Weiterhin bedeutet die Notwendigkeit der Zugabe von lysiertem Pferdeblut zu bakteriellen Kulturmedien, daß die Kulturmedien tatsächlich unmöglich zu definieren sind, eine etwas unerwünschte Eigenschaft. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von Pferdeblut besteht darin, daß dieses im Handel nur in sehr begrenzten Mengen und von nur sehr wenigen Lieferanten weltweit zur Verfügung steht.

Es wurde neuerdings gefunden, daß man durch die Zugabe von isolierter und gereinigter Enzymthymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs zu einer großen Vielzahl von allgemein verwendeten Wuchsmedien, diese Medien so verbessert, daß sie zu Empfindlichkeitsuntersuchungen von Bakterien gegenüber Antifolat-Arzneimitteln geeignet sind.

Die Erfindung schafft daher in einer Hinsicht eine Zubereitung zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antifolat-Arzneimitteln, die ein bakterielles Wuchsmedium zusammen mit gereinigter Ihymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs enthalten.

Die Zugabe der Enzymthymidin-Phosphorylase verbessert viele Medien hinsichtlich der Empfindlichkeit der Untersuchung von Bakterien gegenüber Antifolat-Arzneimitteln,

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wie SuTphamethoxazol und Trimethoprim, beispielsweise mittels der "Mueller-Hinton Broth und Agar", Oxoid Sensitivity Test Broth und Agar", "Wellcotest Sensitivity Test Agar", "Brain Heart Infusion Broth und Agar" und"Trypton Soja Agar".

Die Thymidin-Phosphorylase- wurde vorausgehend von Bakterien, v/ie Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus oder Haemophilus influenza und im besonderen von einem Stamm der Escherichia coli, die Thymin und Methionin zum Wuchs benötigen, gereinigt. Diese zuletzt bezeichnete Reinigung beinhaltet ein extrem langes Verfahren, das Ausfällung, Fraktionierung, mehrere chromatographische Stufen und Dialysen beinhaltet (Schwartz, M., 1971, Eur. J. Biochem. 21ί 191-198). Das nach diesem Verfahren gewonnene Enzympräparat war jedoch nur um das 25-fache reiner als der Rohe Zellextrakt.

Es v/urde neuerdings gefunden, daß bestimmte Bakterienstämme, im besonderen bestimmte Stämme von E. coli, außergewöhnliche Mengen von Thymidin-Phosphorylase unter geeigneten Wuchsbedingungen bilden und daß dieses Enzym dadurch isoliert und gereinigt v/erden kann, daß man den Zellextrakt zu spezifischen Adsorbentien zugibt 'und ihn daraus unter Bildung einer viel höheren Ausbeute eines viel reineren Präparats, als dies bisher erreicht werden

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konnte, eluiert. Darüberhinaus ist dieses neue Isolierungs-/ Reinigungsverfahren anwendbar zur Herstellung des Enzyms im tecnnischen Umfang.

Die Erfindung betrifft in weiterer Hinsicht ein Verfahren zur Herstellung von gereinigter Thymidin-Phosphorylase "bakteriellen Ursprungs, wozu man das rohe Enzym von Bak-r terien ' in ein wäßriges Medium extrahiert, den Extrakt einem Fraktionie rungs verfahr en unterwirft, das Adsorptions-, chromatographische und Dialysenstufen "beinhaltet. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

1) einen Stamm von Bakterien auswählt, der die Eignung hat, hohe Konzentrationen an Thymidin-Phosphorylase unter geeigneten Wuchsbedingungen zu "bilden,*'und

2) daß man den daraus erhaltenen rohen Zellextrakt einem Calciumphosphatgel-Absorptionsmittel, das im wesentlichen äquivalente Mengen an Ca⁺⁺ und PO. 3-» vorzugsweise als erste Stufe der Reinigung, zuführt. Vorzugsweise "bringt man danach das Eluierungsmittel mit DEAE-Oellulose und/oder Cellulose—Epichlorhydrin-Triäthanolamin (ECTEOLA-Cellulose) in Kontakt, wonach man eine Dialyse gegen Wasser oder einen geeigneten Puffer nach Eluieren aus DEAE-Cellulose und vor Adsorption an ECTEOLA-Cellulose, durchführt.

Der Stamm Escherichia coli B-96 (ATCC 13473) ist besonders vorteilhaft für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.

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Salmonella typhimurium LT-2 (ATCC 15277) ist ein Beispiel eines weiteren Bakterienstammes, der große Mengen an Thymidin-Phosphorylase bildet und daher zur Durchführung dieser Erfindung "brauchbar ist. In bestimmten Fällen hat sich, wenn ein thermostabileres Enzym erwünscht ist, das aus B. stearothermophilus isolierte Enzym als wirksam erwiesen/.

Der E. coli-Stamm ATCC 13473 kann in einem ■ Miriimälsalz -Medium mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle und zusätzlichen Purinen kultiviert v/erden. Es können aber auch die Bakterien in einem Hefeextraktmedium kultiviert werden. Ein Rohextrakt des Enzyms kann dann durch Be- ^ schalLung der Bakterienzellen in einem Phosphatpuffer unter nachfolgendem Zentrifugieren zur Entfernung der Zelltrüm- ' mer gewonnen werden.

Den Rohextrakt mischt man beispielsweise mit einer geringen Menge CaIciumphosphatgel und zentrifugiert dann zur Entfernung unerwünschten Proteins. Die so erhaltene überstehende Schicht kann dann mit einem weiteren Aliquoten CaIciumphosphatgel und dem derart absorbiertem Enzym vermischt werden.Die Enzymaktivität kann aus dem Gel eluiert werden durch aufeinanderfolgende Waschvorgänge mit Phosphatpuffer. Das Enzym kann dann auf DEAE-Cellulose adsorbiert, gewaschen und davon eluiert werden. Nach Dialyse kann das Präparat auf ECTEOLA-Cellulose adsorbiert und da-

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-von eluiert werden.

Das Überwachen der Elutionen hinsichtlich der Enzymaktivität kann in allen Reinigungsstufen zweckmäßigerweise unter Verwendung einer spektrophotometrischen Untersuchung bei einer ausgewählten Wellenlänge erfolgen.

Das so gereinigte Enzym kann zweckmäßigerweise als Suspension in wäßrigem Ammoniumsulfat zur Verfügung gehalten werden.

Das Enzym ist ebenso in einer Anzahl von Vertebratgeweben vorhanden und kann daraus gereinigt werden, wobei jedoch der Gehalt in Säugergeweben im allgemeinen viel geringer ist als in Bakterien. Weiterhin ist die gereinigte Mikroben-Thymidin-Phosphorylase um ein Vielfaches wirksamer als der entsprechende gereinigte Säugerpartner.

Es wurde tatsächlich festgestellt, daß Pferdeblut etwa 40 bis .100 Einheiten Thymidin-Phosphorylaseaktivität, wie hier definiert, pro ml enthält. Das E₀ coli Schallprodukt von Beispiel 1 enthält das 1000-fache dieser Kon-" zentration. Es sind daher die Vorteile eines wirtschaftlichen Verfahrens zur Herstellung des gereinigten Enzyms über Bakterien vielfältig und bedeutend. Nicht nur ist das Enzym leichter verfügbar und die Enzymquelle billiger, sondern es ist auch das Verfahren zur Extraktion und Reini-

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gung viel wirtschaftlicher.

Die in das Medium eingebrachte Thymidin-Phosphorylasekonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 200 Einheiten Enzymaktivität/ml Medium, insbesondere zwischen 5 und 100 Einheiten/ml und am zweckmäßigsten zwischen 7 und 50 Einheiten/ml. Eine Einheit Enzymaktivität des gereinigten Enzyms entspricht der Menge Enzym, die die Bildung eines Nanomols Thymins/Minute aus einer Millimolar-Lösung Thymidin bei 25°C in Gegenwart von 200 mM Kaliumphosphatpuffer bei P_H 7,¹I katalysiert.

Medien, zu denen gereinigte Tyhmidin-Phosphorylase zugegeben wurde, können geeigneterweise verwendet werden zur Untersuchung der Empfindlichkeit der Antifolat-Arzneimittel hinsichtlich einer Yielzahl von Organismen, wie Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Yibrio comma, Erysipelothrix rhusiopathiae, Serratia marcescens, Klebsieila pneumoniae, Kleb, aerogenes, Sal« typhosa, E. coli, Shigella flexneri, Shig. dysenteriae, Enterobacter aerogenes, Entero. cloacae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Pr. mirabiles, Pr. rettgeri, und Pseudomonas aeruginosa. Strep, faecalis, ist eine ausgesprochene Ausnahme, weil bei diesem Organismus Thymin so wirksam ist wie Thymidin zur tatsächlichen Umkehrung der Aktivi-tät der Inhibierung der Folatreduktase, z.B. Trimethoprim.

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.Das gereinigte Enzym kann zu dem gewünschten Medium in irgendeiner Stufe der Herstellung zugegeben werden. Beispielsweise kann es aseptisch als sterile lösung nach der Sterilisierung des Mediums im Autoklaven, und wenn die Temperatur auf etwa 50 - 55°C abgefallen ist, zugegeben werden. Nachdem das Enzym zugegeben ist, sollte das Medium so schnell wie möglich so verarbeitet werden, daß das enzymbehandelte Medium nicht bei 50 - 55⁰C langer als etwa 5 - 10 Minuten gehalten wird, um die Inaktivierung des Enzyms so gering wie möglich zu halten.

Die vorliegende Erfindung schafft in weiterer Hinsicht ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antifolat-Arzneimitteln geeignet ist, wobei diese das Gemisch eines gereinigten Präparats von Thymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs mit einem bakteriellen Wuchsmedium umfaßt.

Ein besonderer Torteil der so hergestellten Zubereitung besteht darin, daß sie leicht gefärbt und transparent ist, wodurch die genaue Bewertung des bakteriellen Wuchses bei der Bestimmung der bakteriellen Empfindlichkeit gegenüber Antifolat-Arzneimitteln erleichtert wird.

In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung

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ein stabilisiertes Ihymidin-Phosphorylasepräparat, das Ammoniumsulfat enthält. Die Formulierung mit erhöhter Stabilität kann eine Suspension des Enzyms in einer Ammoniumsulfatlösung sein«.

Es ist nach dem Stand der Technik bekannt, daß Ihymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs bei -20 C stabil ist, daß sich aber bei 4 C die Aktivität in einer bedeutenden Geschwindigkeit senkt. Es wurde nunmehr festgestellt, daß Formulierungen des gereinigten Enzyms mit bedeutender Stabilität gegenüber Zerfall hergestellt werden können, wenn man dem Präparat Ammoniumsulfat zugibt, vorausgesetzt, daß der Proteingehalt des Präparats wenigstens 5 mg Protein/ml beträgt. Der Proteingehalt muß nicht notwendigerweise insgesamt aus dem Enzym bestehen. Konzentrierte lösungen des Enzyms (5 mg Protein/ml oder mehr) in Phosphatpuffer, der 10 $ Ammoniumsulfat enthält, können beispielsweise längere Zeit mit geringem oder ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Es können auf diese Weise stabile Suspensionen von Thymidin-Phosphorylase in wäßrigem Ammoniumsulfat hergestellt werden»

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken_e

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Beispiel 1 Th;ymidin-Phosphorylase-Reinigung

E. CoIi B-96 (ATCC 13473) züchtet man in belüfteten Gefäßen bei 34°C in einem Medium mit minimalem Salzgehalt, das Fa₂HPO₄(18,9 g/l), KH₂PO₄ (6,3 g/l), MgSO₄ · (0,2 g/l), (1TH₄)₂SO₄ (2,0 g/l), Adenosin (0,5 g/D und Casaminosäuren (8,0 g/l) enthält. Man gewinnt die Zellen durch Zentrifugieren wenn die optische Dichte der Kultur bei 600 mn (ohne Verdünnung) 2,0 erreicht. Die nachfolgenden Arbeitsverfahren führt man bei 3°C durch, es sei denn, daß dies anders angegeben wird. Man suspendiert die Zellpaste (25 g) in dem zweifachen ihres Gewichts in 5 mM Kaliumphosphatpuffer,. p_H 8,0 (Puffer A). Die Zellsuspension unterwirft man der Schallbehandlung in 5 ml Aliquoten, jeweils zweimal 12 Sekunden mit 50 Sekunden Kühlintervall. Man verwendet einen Branson Modell 5125 Sonic Oscillator als Kraftquelle für jeweils 6 Proben. Die erhaltenen Produkte gibt man zusammen und zentrifugiert 20 Minuten bei 48.000 χ g. Zu der überstehenden Schicht (Stufe I - siehe Tabelle I nachfolgend) gibt man langsam 25 ml Calciumphosphatgelsuspension (3I mg trockener Feststoff pro ml , bei 3 C 5 Monate gealtert). Die erhaltene Suspension rührt man 10 Minuten und zentrifugiert dann bei 12.000 χ g 5 Minuten. Die überstehende Schicht mischt man mit weiteren 100 ml Calciumphosphatgelsuspension und rührt das Gemisch 10 Minuten und zentrifugiert bei 9.700 χ g 15 Minuten. Den erhal-

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tenen Gelkuehen wäscht man mit Puffer A (100 ml) zur er-.neuten Suspendierung und zentrifugiert bei 9.700 χ g 15 Minuten.

Die Enzymaktivität eluiert man aus dem G-elkuchen durch zwei aufeinanderfolgende Waschvorgänge j den ersten mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, ρ_Η 8,0 (100 ml) und den zweiten mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer, p_H 8,0 (100 ml). Die beiden Waschlaugen kombiniert man (Stufe II).

Das weitere Terfahren führt man bei 25°C durch. Die kombinierten Waschlaugen gibt man in eine DEAE-Cellulosekolonne mit einem Durchmesser von 1,8 cm bei 6 cm Höhe, die man vorausgehend mit 20 mM Kaliumphosphat, Ρττ 6,4 (Puffer B) equilibriert. Die gefüllte Kolonne wäscht man mit Puffer B (100 ml) und eluiert dann das Enzym mit einem linearen Gradienten-Phosphatpuffer. Diesen Gradienten stellt man dadurch her, daß man unter gründlichem Mischen 200 mM Kaliumphosphatpuffer, p_H 6,4 (200 ml) einem Mischgefäß, das vorausgehend mit Puffer B (200 ml) gefüllt wurde, in einer solchen Geschwindigkeit zugibt, daß ein konstantes Volumen in dem Mischgefäß beibehalten wird. Die Fraktionen, die die höchste Enzymaktivität enthalten, werden zusammengeschüttet (Stufe III) und unter Verwendung einer Cellulose -DialysierrÖhrenvorrichtung (6,3 mm Durchmesser) gegen Wasser (2 1) 1 Stunde dialysiert. Man wiederholt die Dialyse und gibt dann das Dialysat in eine ECTEOLA-Cellu-

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lose-Kolonne (1,8 χ 5 cm), die vorausgehend mit Puffer A equilibriert wurde. Man wäscht die gefüllte Kolonne mit Puffer A (100 ml). Man eluiert dann das Enzym mit einem linearen Gradienten-Eluierungsmittel, das wie oben hergestellt wurde, wozu man ein Mischgefäß verwendet, das man . anfangs mit Puffer A (200 ml)gefüllt, in das man 200 mM Kaliumphosphatpuffer, p_H 8,0 (200 ml) mittels Schwerkraft in dem Maße einsyphoniert, wie die Kolonnenlösung fortschreitet. Man gießt die Fraktionen, die die Enzymaktivität aufweisen, zusammen (Stufe IV) und gibt ausreichend Ammoniumsulfat unter Bildung einer Suspension des Enzyms in 80$iger Ammoniumsulfatlösung zu. Dieses Gesamtverfahren führt zu einer 100-fachen Erhöhung der spezifischen Aktivität im Hinblick auf das Protein und zur tatsächlich vollständigen Entfernung der Nukleinsäuren.

Die Thymidin-Phosphorylase-Aktivität bestimmt man spektrofotometrisch durch Messen der Abnahme des Absorptionsvermögens bei 290 nm, die die Phosphorolyse von Thymidin zu Thymin anzeigt. Bei .290 nm und p_H 7,4 hat Thymidin einen höheren Extinktionskoeffizienten als Thymin (Δ£2-48OpT^Cm"¹) Das Untersuchungsgemisch enthält 200 mM Kaliumphosphatpuffer, Ptt 7,4 und 1 mM Thymidin in einem Gesamtvolumen von 2,5 ml· Eine Einheit Enzymaktivität ist die Menge, die die Bildung eines Nanoinols Thymin pro Minute aus Thymi-

din bei 25°C katalysiert.

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Die Tabelle I faßt die Ergebnisse der in diesem Beispiel beschriebenen Reinigung zusammen. Dieses Verfahren wurde 60-mal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Tabelle I:

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Tabelle I

Reinigung von Ihymidin-Phosphorylase aus Escherichia coli B-96

Verfahren

Stufe Vol. Aktivität-Ur. (ml) Einheiten

ml

Überstehende Schicht der I Schallbehandlung

Eluat aus Calciumphosphatgel II

DEAE-Cellulose-Eluant III

ECTEOLA-Cellulose-Eluant IV

Gesamt- Protein einheiten mg/ml

65,5 106.000 6.943.000

206 27.600 4.685.600

52 80.500 4.186.000

66 50.700 3.346.200

Aktivität-Einheiten
mg Protein

2.650

■Ausbeute Reinigung um das

-fache

100

O	,99	27	.880	82	11
O	,61	132	.000	60	50
O	,19	266	_O800	48	101

CD O NJ CD CD CD

00 I

Beispiel 2 - Festes Medium

Man stellt Mueller-Hinton (Mfco) Agar in normaler Weise .her und unterwirft es einer Autoklavebehandlung. Fach dem das Medium aus dem Autoklaven entfernt und auf 50 - 55 C abgekühlt ist, gibt man eine sterile Lösung von gereinigter Thymidin-Phosphorylase, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, die ausreichend Enzym enthält, daß man eine Endkonzentration von 40 Einheiten gereinigtes Enzym pro ml Medium erhält, aseptisch zu. Man mischt das Medium gründlich, gießt es in sterile Petri-Schalen und läßt es auf Raumtemperatur abkühlen.

Beispiel 3 - Untersuchung der Empfindlichkeit Man stellt Mueller-Hinton-Agar (Wilson) und Brain-Heart-Infusion- Agar (Difco) in normaler Weise her und unterwirft sie der -Ä-utoklavenbehandlung (3 Ansätze von jedem). Nach Entfernen aus dem Autoklaven gießt man einen Ansatz von jedem Medium in sterile Petrischalen. Die anderen beiden Ansätze von jedem Medium läßt man auf 55 C abkühlen. Zu einem Ansatz von jedem Medium gibt man dann ausreichend lysiertes Pferdeblut, um eine Endkonzentration von 5 i° zu bilden und zu dem Endansatz von jedem Medium gibt man soviel sterile Lösung von Thymidin-Phosphorylase, daß man eine Endkonzentration von 40 Einheiten/ml erhält. Man mischt jeden Ansatz gründlich und gießt ihn in sterile Petri-Schalen. Mach Abkühlen auf Zimmertemperatur impft

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man jede Agar-Platte mit 2 ml verdünnter (1O~⁴) Brühkultur, die man über Nacht stehengelassen hat (Mueller-Hinton-Brühe) von E. coli. Man entfernt die überflüssige Flüssigkeit und läßt die Platten abtrocknen. Man gibt dann Filterpapierscheiben, die 1,25 mg TMP, 1,25 mg TMP + 23,75 mg SMX und 23,75 mg SMX enthalten, auf die Oberfläche der Platten, die man dann bei 37°C 16 Stunden bebrütet, wodurch man einen nicht vollständig zusammenfließenden Wuchs erhält. Man bestimmt die Inhibierungszonen und drückt sie als Entfernung von der Kante der Scheibe zu der Kante des Wuchses der nicht inhibierten Kolonien aus. Tabelle II faßt die Ergebnisse zusammen.

Tabelle II; Empfindlichkeitsuntersuchung

Größe der Zonen in mm

Medium Umkehrungs- TMP SMX TMP 1,25/Ug + mittel 1,25/ug 23,75/ug SMX 23,75/Ug

Thymidin

Phosphorylase 22(25) 17(20) 26(31)

40 Einheiten/ml

Brain-Heart lysiertes

Infusion Pferdeblut H(22) 12(20) 21(29)

Agar(Difeo) 5 i°

Nil (22) (23) (3D

Thymidin

Phosphorylase 24(27) 24(26) 32(36)

40 Einheiten/ml

Mueller-Hinton lysiertes

Agar Pferdeblut 25(28) 24(26) 31(35)

(Wilson) 5 1o

Nil (25) (26) (35)

( ) Beinhaltet Zonen von Teilinhibierung.

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Man verbessert den Mueller-Hinton-Agar zur Untersuchung der Empfindlichkeit auf etwa den gleichen Grad durch Zugabe von bakterieller Ihymidin-Phosphorylase, wie durch Zugabe von lysiertem Pferdeblut. Das Enzym verbessert wesentlich die Brain-Heart-Infusion gegenüber lysiertem Pferdeblut. Weiterhin können die tatsächlich farblosen, nach dem Verfahren dieser Erfindung gebildeten Platten viel leichter und schneller abgelesen werden, als die gefärbten Pferdeblutplatten.

Patentansprüche:

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Claims

- 21 Patentansprüche :

(J\ Zubereitung zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antifolatmittein, gekennzeichnet durch den Gehalt eines bakteriellen Wuchsmediums zusammen mit gereinigter Ihymidin-Phosphoryläse bakteriellen Ursprungs.
2. Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration der Thymidin-Phosphorylase in dem Wuchsmedium 2 bis 200 Einheiten Enzymaktivität/ml Medium beträgt.
3. Zubereitung gemä.ß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration 5 bis 100 Einheiten/ml beträgt.
4. Zubereitung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration 7 bis 50 Einheiten/ml beträgt.
5. Zubereitung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Thymidin-Phosphorylase aus einem Escherichia-coli-Stamm erhalten ist.
6. Zubereitung gemäß Anspruch 5, dadurch ge-

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kennzeichnet, daß der Stamm von E. coli B-96 (ATCC 13473) ist.
7. Zubereitung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das "bakterielle Wuchsmedium Mueller-Hinton-Broth, Mueller-Hinton-Agar, Oxoid Sensitivity Test Broth, Oxoid Sensitivity Test Agar, Wellcotest Sensitivity Test Agar, Brain Heart Infusion Broth, Brain Heart Infusion Agar oder Trypton Soja Agar ist.
8. Verfahren zur Herstellung von gereinigter Thymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet , daß man das rohe Enzym aus einer Kultur von Escherichia coli in ein wäßriges Medium extrahiert und den Zellextrakt einem JPraktionierungsverfahren unterwirft, das als erste Stufe die Adsorption auf CaIciumphosphatgel, das im wesentlichen äquivalente Mengen Calcium, und Phosphationen enthält, beinhaltet, und danach Chromatographie- und Dialysenstufen folgen läßt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als E. coli-Stamm E. coli B-96 (ATCC 13473) verwendet.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9, d a -

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durch gekennzeichnet , daß man das Eluant aus der Calciumphosphatgeladsorptionsstufe mit DEAE-Cellulose und/oder ECTEOLA-Cellulose in Kontakt bringt _β
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man nach Eluieren von DEAE-Cellulose und vor Adsorption auf ECIEOIA-Cellulose den Zellextrakt dialysiert.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyse gegen Wasser oder eine ' geeigneten Puffer durchführt .
13. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gereinigtes Präparat von Ihymidin-Phosphorylase bakteriellen Ursprungs mit einem Bakterienwuchsmedium mischt.
14. Stabilisiertes Thymidin-Phosphorylasepräparat, gekennzeichnet als konzentrierte Lösung des Enzyms, das wenigstens 5 mg Protein/ml enthält, in Phosphatpuffer, der Ammoniumsulfat enthält.
15. Präparat gemäß Anspruch 14, dadurch g e -

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k e η η ζ e ich.net , daß die Konzentration des Ammoniumsulfats etwa 10 $ beträgt«,
16. Yerfahren zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antifolat-Antimikrobenniitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 mit den Bakterien impft, die Bakterien sich vervielfältigen läßt, Filterpapierscheiben, die Antifolatmittel enthalten, auf die Oberseite des Bakterienwuchsmediums legt und die Kultur weiter bebrütet.

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