DE3018767C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Herstellung
von Penicillin N aus dem Tripeptid δ-(L-α-aminoadipyl)-
L-cysteinyl-D-valin (LLD) unter Verwendung eines
zellfreien Pilzkultur-Extraktes als Katalysator.
Ein solches Verfahren ist aus dem Aufsatz von Fawcett et
al "Synthesis of δ-(α-aminoadipyl)-cysteinvaline and
its role in Penicillin Biosynthesis" in der Zeitschrift
"Biochem. J." vol. 157 (1976), Seite 651, und aus der
Vortragszusammenfassung "Aspects of Cephalosporin and
Penicillin Biosynthesis" in dem von K. D. McDonald herausgegebenen
Buch "Second Internat. Symp. Genetics of Industrial
Microorganisms" (Academic Press, London, 1976)
bekannt. Weiterhin ist in der US-Anmeldung Ser. No.
880 036 vom 17. März 1978 eine zellfreie Synthese von
Cephalosporinen vorgeschlagen worden.
Die bekannten Verfahren sind jedoch nur für die Biosynthese
von Penicillin N geeignet und können für die
Herstellung von Isopenicillin N nicht angewendet werden.
Das Isopenicillin N ist ein wasserlösliches Antibiotikum
in Form eines β-Lactams und hat die Struktur:
Die Struktur des Isopenicillins N ist dabei identisch
mit derjenigen des Penicillins N, nur weist die Aminoadipyl-
Seitenkette beim Isopenicillin N L-Konfiguration
und beim Penicillin N D-Konfiguration auf. Die beiden
Antibiotika unterscheiden sich in ihrer Wirkung darin,
daß das Penicillin N nur gegen gramnegative und das
Isopenicillin N nur gegen grampositive Bakterienstämme
wirksam ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bekannte
Verfahren der eingangs genannten Art zum Herstellen von
Penicillin N derart abzuwandeln, daß es für die Herstellung
von Isopenicillin N und dessen Derivaten geeignet
wird.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die folgenden
Verfahrensschritte gelöst:
- (1) als Ausgangsmaterial wird das Tripeptid LLD oder
ein Derivat der Struktur
verwendet, worin die Radikale R, R₁ und R₂ gleich
oder verschieden und aus einer Gruppe gewählt sind,
die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl
umfaßt, und das Radikal R₃ zu einer Gruppe gehört,
die-(CH₂)₃-CH(NH₂)-, -(CH₂)₃-CHBr-, -(CH₂)₃-CH(N₃)-,
-CH(NH₂)-(CH₂)₂-CH(NH₂)-, -(CH₂)₂-CH(NH₂)-,
-(CH₂)₄-CH(NH₂)-, -CH₂-S-CH₂-CH(NH₂)-,
-CH₂-S-C(CH₃)₂-CH(NH₂)-, -CH(CH₃)-S-CH₂-CH(NH₂)-
und -(CH₂)₄-enthält, - (2) in einem zellfreien oder nur permeabilisierte Zellen enthaltenden Extrakt der Pilzkultur Cephalosporium acremonium werden vorbestimmte, erst in einem späteren Teil der Biosynthese wirksam werdende Enzyme, die eine Umwandlung über die Isopenicillin- Stufe hinaus bewirken würden, inaktiviert, indem der Pilzkultur-Extrakt eine vorbestimmte Zeitspanne lang eingefroren wird,
- (3) das Ausgangsmaterial und der insoweit inaktivierte Pilzkultur-Extrakt werden zusammen mit Adenosin- Triphosphat (ATP) als Energielieferant in einem Reaktionsgefäß vermischt und
- (4) die Reaktionsbestandteile werden bis zur Bildung eines Isopenicillin-N-Derivats der Struktur in dem Reaktionsgefäß belassen.
Nach diesem Verfahren gelingt die Biosynthese von Isopenicillin N
selbst, sowie von einer großen Anzahl seiner
Derivate - mit Ausnahme von Penicillin N - einfach,
rasch und mit relativ hoher Ausbeute. Der Wirkungsmechanismus
ist dabei grob gesagt so, daß sich das
Tripeptid LLD unter Steuerung des Katalysators in Ringform anordnet. Diese Ringbildung erfolgt auch, wenn anstelle
des LLD die erwähnten synthetischen β-substituierten
Derivate von L-Cystein und D-Valin und analogen
Verbindungen der α-Amino-Adipinsäure verwendet werden,
wodurch ganz neuartige Isopenicillin-Derivate entstehen.
Bei diesen analogen Verbindungen zur α-Amino-
Adipinsäure handelt es sich im wesentlichen um folgenden:
sämtliche in L-Konfiguration.
Besonders einfach läuft das Verfahren ab, wenn die Radikale
R, R₁ und R₂ Wasserstoff sind.
Nach einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist das
Radikal R Wasserstoff, eines der Radikale R₁ und R₂
Methyl und das andere Radikal aus der Gruppe gewählt,
die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl
umfaßt. Wenn dabei beide Radikale R₁ und R₂ die Methylgruppe
sind, ergibt sich das Isopenicillin N selbst.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird
das als Energielieferant dienende ATP durch ein Regeneriersystem
erneuert, das einen Phosphatlieferanten
und ein Phosphotransferase-Enzym enthält, wobei vorteilhafterweise
der Phosphatlieferant Phosphoenolpyruvat
und das Phosphotransferase-Enzym Pyruvatkinase ist. Die
Reaktion läuft übrigens auch ohne Zugabe von ATP ab,
doch ist dann die Ausbeute zu gering.
Der zellfreie oder permeabilisierte Zellen enthaltende
Pilzkultur-Extrakt kann auf mannigfaltige Weise erzeugt
werden, beispielsweise durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid,
Benzol, Toluol, Triton X-100 usw., welche
die Zellwände permeabel machen. Vorteilhafterweise wird
er jedoch durch Behandeln der Pilzkultur Cephalosporium
acremonium mit Zellwände lysierenden Enzymen erzeugt,
wobei zweckmäßigerweise die lysierenden Enzyme Endo-β-
(1→3)-Glukanase, Endo-β-(1→4)-Glukanase und Zymolyase
enthalten. Die enzymatisch aktiven Fraktionen des Extraktes
können dabei auch isoliert werden, wodurch ihre Aktivität
erhöht und die Ausbeute an Antibiotika gesteigert
werden kann.
Gemäß anderen Ausgestaltungen der Erfindung nach dem
Hauptanspruch werden die Reaktionsbestandteile zur Beschleunigung
der Sauerstoffübertragung in dem Reaktionsgefäß
geschüttelt und mit Mannitol sowie Spuren von
Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat versetzt und auf einen
pH-Wert von ungefährt 7,2 gepuffert. Schließlich kann zum
Inaktivieren der unerwünschten Enzyme der Pilzkultur-
Extrakt vor dem Schritt (3) eine vorbestimmte Zeitspanne
lang eingefroren und dann wieder aufgetaut werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen
ausführlicher erläutert, wobei sich weitere Vorteile,
Merkmale und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben.
Cephalosporium acremonium ist ein gut bekannter Mikroorganismus
und in verschiedenen Kulturen bei der "American Type
Culture Collection" erhältlich, beispielsweise unter dem Namen
ATCC 20 339, ATCC
14 553 und ATCC 36 255.
Das Verfahren nach der Erfindung kann auch
mit sogenannten nicht produzierenden Mutanten von ATCC
36 255 ausgeführt werden.
Diese Mutanten werden sehr frühzeitig blockiert,
vermutlich bei der Bildung von LLD, und erzeugen daher
in dem eigentlichen Kulturmedium keine Antibiotika. Jedoch
können aus ihnen hergestellte Extrakte LLD in ein
Antibiotikum überführen, so daß bei der Zugabe von LLD
oder seiner Derivate Antibiotika erzeugt werden.
Gemäß einer bevorzugten Methode zum Herstellen des zellfreien
Extraktes wird eine Protoplasmapille aus ganzen
Zellen eines 40 bis 70 Stunden alten Myzels beispielsweise
mit einem Präparat aus dem lythischen Enzym
Cytophaga L 1 und Zymolyase-5000 behandelt. Anschließend
wird die Suspension des Protoplasma zentrifugiert und
vorsichtig homogenisiert. Eine zweite Zentrifugierung
ermöglicht dann die Abtrennung der darüberstehenden
Extraktflüssigkeit, die dann - nach Inaktivierung spät
wirkender Enzyme - zur Erzeugung von Isopenicillin verwendet
werden kann. Wenn eines der erwähnten Ausgangsmaterialien
mit diesem zellfreien Extrakt und mit ATP
vermischt wird, entsteht dann eine Lösung, die reich an
Isopenicillin-Derivaten ist.
Dabei hat sich gezeigt, daß ständige Belüftung durch
Schütteln und die Zufuhr von ATP, insbesondere mit
einem zusätzlichen Regeneriersystem für das ATP, die Ausbeute
an Isopenicillin erheblich steigert. Das ATP-
Regeneriersystem besteht zweckmäßigerweise aus einem
Phosphatlieferant und einem Phosphotransferase-Enzym.
Der bevorzugte Phosphatlieferant ist dabei Phosphoenolpyruvat
und sein zugehöriges Phosphotransferase-Enzym
Pyruvatkinase.
Es können jedoch auch andere Regeneriersysteme aus Lieferant
und Enzym verwendet werden. Zu diesen gehören
beispielsweise Creatinkinase, Azetatkinase, Carbamatkinase,
Phosphoramidatkinase, Argininkinase-3-Phosphoglyceratkinase
und Aspartatkinase und die zugehörigen
Phosphatlieferanten Creatinphosphat, Azetylphosphat,
Carbamylphosphat, Phosporamidat, Argininphosphat,
L-3-Diphosphoglycerat und Aspartylphosphat. Da der
Extrakt bereits etwa ATP enthält, werden geringe Mengen
Antibiotika auch ohne Zusatz von ATP erzeugt.
Die tatsächliche Anwesenheit von Isopenicillin kann
mit Hilfe von Mutanten der Bakterienkulturen Escheria
coli (im folgenden mit Ess bezeichnet) oder Pseudomonas
aeruginose (Pss) nachgewiesen werden (s. Agr. Biol. Chem.
vol. 38 (9), (1974), 1761 bis 1752), die speziell gegenüber
Antibiotika in Form von β-Lactam äußerst empfindlich
sind. Brauchbar für diesen Zweck ist auch
Penicillinase, ein Enzym,
das die antibiotischen Eigenschaften sowohl von Isopenicillin N
als auch von Penicillin N zerstört.
Es hat sich nun gezeigt, daß das nach dem erfinderischen
Verfahren hergestellte Produkt antibiotische Eigenschaften
gegenüber Ess und Pss aufweist und daher tatsächlich
einen β-Lactam-Bestandteil besitzt. Weiterhin wurde seine
antibiotische Wirkung erwartungsgemäß durch Penicillinase
zerstört. Es steht somit fest, daß ein β-Lactam-Antibiotikum
mit 5-gliedrigem Thiazolidinring vorliegt. Daß das
erhaltene Produkt Isopenicillin und nicht Penicillin ist,
wurde durch Vergleich der antibakteriellen Eigenschaften
des Syntheseproduktes mit denjenigen bekannter Proben
von Penicillin N und Isopenicillin N gegenüber grampositiven
und gramnegativen Bakterien nachgewiesen.
Um Isopenicillin N gegenüber Penicillin N zu differenzieren,
wurde die antibiotische Wirkung in vitro gegenüber
zwei gramnegativen Bakterienstämmen (Salmonella typhimurium
ATCC 13 311 und Pss) und
gegenüber zwei grampositiven Bakterienstämmen (Staphylococcus
aureus ATCC 25 923 und Microconus lutens ATCC 9341)
verglichen. Es ergab sich tatsächlich, daß Isopenicillin
N gegenüber grampositiven Stämmen wirksamer ist als
gegenüber gramnegativen, während Penicillin N gegenüber
gramnegativen Stämmen wirksamer ist als gegenüber grampositiven
Bakterien. Da das Syntheseprodukt der zellfreien
Umwandlung von LLD deutlich aktiver gegenüber
grampositiven Stämmen ist als gegenüber gramnegativen,
handelt es sich also tatsächlich um Isopenicillin N.
Der zellfreie Extrakt enthält somit bestimmte Enzyme,
die aus den genannten Ausgangsmaterialien Isopenicilline
erzeugen können.
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden
Beispiele, auf welche jedoch die Erfindung keineswegs
beschränkt ist.
Zunächst wurde eine Keimflüssigkeit hergestellt, die
pro Liter 30 g Maisaufschwemmung, 10 g Glucose, 30 g
Stärke und 5 g Calciumcarbonat enthielt. 40 ml dieser
Flüssigkeit wurden auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt
und in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Dann wurde
aus einer 1 ml-Pipette ein Tropfen Methyloleat hinzugefügt
und der Kolben in einem Autoklaven sterilisiert.
Nach Abkühlung wurde der Kolben mit 1 ml der Aufschwemmung
von C. Acremonium geimpft, die durch Abernten des
Myzels einer geneigten Kultur mit 5 ml sterilen Wassers
erhalten wurde. Der geimpfte Kolben wurde dann 72 Stunden
lang in einer mit 250 Umdrehungen pro Minute auf einer
Bahn mit 50 mm Durchmesser rotierenden Schüttelvorrichtung
bebrütet. Diese Bouillon diente dann zum Impfen
der weiter unten angegebenen eigentlichen Kulturflüssigkeit.
In den Beispielen wurde eine Mutante M-0198 des C.
acremonium-Stammes CW-19 verwendet, die kein Penicillin N
und kein Cephalosporium C durch Fermentation bilden
kann. Die Mutante
M-0198 ist ohne Einschränkung unter der Bezeichnung
Cephalosporium acremonium NRRL-11 418 bei dem Northern
Regional Research Center des US-Dept. of Agriculture,
Peoria, IL 61 604, erhältlich. Die Erfindung ist jedoch
nicht auf diese spezielle Mutante von C. acremonium
beschränkt.
Die Hauptkulturen wurden bei 25°C in
einer mit 250 Umdrehungen pro Minute rotierenden
Schüttelvorrichtung in 250 ml-Kolben mit 40 ml-Proben
folgender Zusammensetzung bebrütet:
36,0 gSukrose,
27,0 gGlukose,
7,5 gAmmoniumsulfat,
1,5 gOleinsäure,
7,5 gSalzlösung Nr. 1,
135,0 gSalzlösung Nr. 2,
3,0 gL-Methionin,
1,0 gWasser.
Der pH-Wert wurde auf 7,3 bis 7,5 eingestellt. Die
Salzlösung Nr. 2 bestand aus 20 g/l Ammonium-eisen(II)-
sulfat · 6 H₂O (Mohrsches Salz) und die Salzlösung Nr. 1
aus
208,0 gK₂HPO₄,
204,0 gKH₂PO₄,
22,7 gNa₂SO₄ · 10 H₂O,
4,8 gMgSO₄ · 7 H₂O,
1,0 gCaCl₂ · 2 H₂O,
0,4 gZnSO₄ · 7 H₂O,
0,4 gMnSO₄ · H₂O,
0,1 gCuSO₄ · 5 H₂O.
Das nach 40 bis 70 Stunden Fermentation aus 6 Kolben
eingebrachte Myzel wurde gefiltert und zweimal mit
40 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das feuchte Myzel
wurde wieder in 40 ml einer 0,05 M Zitrat-Phosphat-
Pufferlösung nach McIlvaine (pH 7,2) unter Zusatz von
0,01 M Dithiothreitol suspendiert und eine Stunde lang
bei 28°C und 150 Umdrehungen pro Minute bebrütet. Nach
erneutem Filtern und Waschen wurde das Myzel wieder in
40 ml der zuvor genannten Pufferlösung suspendiert, diesmal
jedoch unter Zusatz von 1,0 M Natriumchlorid, 0,02 M
Magnesiumsulfat, 160 mg eines lysierenden Präparates des
lytischen Enzyms Cythophaga L 1 und 160 mg Zymolyase-5000
aus Arthrobacter. luteus.
Das Enzym Cytophaga L 1 ist ein Handelsprodukt.
Seine Herstellung ist in der GB-PS
10 48 887 beschrieben. Das Präparat wurde ursprünglich
von einer Mikroorganismen Kultur isoliert, die zunächst
mit L 1 bezeichnet und dann als NCIB 9497 bei der
National Collection of Industrial Bacterial in Aberdeen,
Schottland, hinterlegt worden ist. Das lytische Enzym
L 1 besitzt die Wirkung von Endo-β-(1→3)- und Endo-β-
(1→4)-Glukanase (Biochemical J., Vol. 135 (1973),
Seite 11).
Die Zymolyase-5000 ist ebenfalls ein Handelsprodukt.
Sie ist ein Enzympräparat einer Submerskultur
von Arthrobacter luteus und löst die
Zellwände lebender Pilzkulturen auf. In der bezogenen
Form kann die Zymolyase-5000 neben dem lytischen Enzym
noch β-1,3-Glukanase (EC 3.2.1.39), Mannanase, Protease
und Säure-Phosphatase enthalten (Arch. Biochem. and
Biophys., Vol. 153 (1972), Seite 403).
Die Suspension wurde 3 Stunden lang bei 28°C unter
Schütteln bei 120 Umdrehungen pro Minute bebrütet und
dann 10 Minuten mit 800 g zentrifugiert. Die sich ergebende
Protoplasmapille wurde zweimal mit 20 ml Tris′
scher Pufferlösung (pH 7,2, 0,05 M) unter Zusatz von
1,0 M Sucrose, 0,01 M Magnesiumsulfat und 0,01 M Kaliumchlorid
gewaschen. Nach weiterem Zentrifugieren wurde
die Pille vorsichtig bei 4°C in einem Teflonbehälter
homogenisiert, mit 6 ml Tris′scher Pufferlösung, 0,65 M
Manitol, 0,01 M Magnesiumsulfat und 0,01 M Kaliumchlorid
zersetzt und abschließend 10 Minuten lang mit 1000 g
zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann
gefroren und wieder aufgetaut. Sie bildet den zellfreien
Extrakt für das Verfahren nach der Erfindung.
5 Mikromol ATP, 10 Mikromol Phosphoenolpyruvat und
100 Mikrogramm Pyruvatkinase wurden drei Stunden lang
bei 25°C und einem pH-Wert von 7,2 zusammen mit 100 Mikrogramm
LLD und 1,0 ml des vorbeschriebenen Extraktes aus
dem Mutanten M-0198 bebrütet. Das Reaktionsgemisch zeigte
eine äquivalente antibiotische Aktivität von 2,3 Mikrogramm
pro ml, bezogen auf das β-Lactam-Antibiotikum
Cephalosporin C als Normal, d. h. also 2,3 Einheiten
pro ml. Dabei entspricht eine Einheit antibiotischer
Aktivität einer keimfreien Zone gleicher Größe, wie
sie 1 mg des Cepholosporin C zeigt.
Das Produkt zeigte keine antibiotischen Zonen, wenn
der Probe Penicillinase zugefügt wurde, was darauf
hinweist, daß ein Antibiotikum vom Penicillin- oder
Isopenicillin-Typus hergestellt worden ist.
Die Versuchsbedingungen waren wie in Beispiel 1, nur
wurden unterschiedliche LLD-Konzentrationen verwendet
und jeweils nach 0, 1/4, 1/2, 3/4, 1, 2, 3 und 5 Stunden
Proben entnommen. Dabei ergaben sich ohne Zugabe von
LLD keine antibiotischen Zonen und bei 50, 100 und 200
Mikrogramm LLD pro ml maximale antibiotische Zonen von
0,7 bzw. 1,2 bzw. 1,6 Einheiten pro ml. Die antibiotische
Aktivität steigt also mit der Konzentration des Substrates an.
Der zellfreie Extrakt von Beispiel 2 wurde jeweils zwei
Tage lang gefroren und dann aufgetaut. Unter den gleichen
Bedingungen wie in Beispiel 2 ergaben sich ohne LLD-
Zugabe keine antibiotische Zone und für 0, 50, 100, 200,
400 und 800 Mikrogramm pro ml LLD jeweils 1, 1,5, 2,0,
2,2 bzw. 2,2 Einheiten pro ml maximale antibiotische
Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß die antibiotische
Aktivität beim Eingefrieren stabil geblieben ist.
Der zellfreie Extrakt vom Beispiel 2 wurde zehn Tage
lang eingefroren, aufgetaut und dann jeweils mit und
ohne Schütteln und mit und ohne ATP-Regeneriersystem
untersucht. Ohne LLD-Zugabe zeigt sich wieder keine
Aktivität und bei 200 Mikrogramm LLD pro ml folgendes
Verhalten:
Mit Energieerzeugungssystem und ohne Schütteln sowie Schütteln bei 120 und 140 Umdrehungen pro Minute ergab sich eine maximale antibiotische Aktivität von 1,7 bzw. 2,5 bzw. 2,5 Einheiten pro ml und mit Schütteln bei 240 Umdrehungen pro Minute stieg die Aktivität von 2 Einheiten pro ml ohne Regeneriersystem auf 2,5 Einheiten pro ml mit Regeneriersystem an. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Schütteln und die Anwendung des Energieregeneriersystems ein deutliches Ansteigen der Aktivität zur Folge haben.
Mit Energieerzeugungssystem und ohne Schütteln sowie Schütteln bei 120 und 140 Umdrehungen pro Minute ergab sich eine maximale antibiotische Aktivität von 1,7 bzw. 2,5 bzw. 2,5 Einheiten pro ml und mit Schütteln bei 240 Umdrehungen pro Minute stieg die Aktivität von 2 Einheiten pro ml ohne Regeneriersystem auf 2,5 Einheiten pro ml mit Regeneriersystem an. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Schütteln und die Anwendung des Energieregeneriersystems ein deutliches Ansteigen der Aktivität zur Folge haben.
Der zellfreie Extrakt von Beispiel 2 wurde 15 Tage lang
eingefroren, aufgetaut und dann mit unterschiedlichen
Konzentrationen verwendet sowie auch gekocht. Ohne LLD-
Zugabe ergab sich keine antibiotische Zone und bei 200
Mikrogramm LLD pro ml folgendes Verhalten:
Bei 0 und 0,2 ml Extrakt zeigten sich keine antibiotischen Zonen und bei 0,4, 0,6 und 0,8 ml Extrakt 1,1 bzw. 1,4 bzw. 1,7 Einheiten antibiotischer Aktivität. Bei Zugabe von 0,8 ml Extrakt, der 5 Minuten lang gekocht wurde, war keine antibiotische Aktivität mehr festzustellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität mit steigender Konzentration des Extraktes ansteigt und durch Kochen zerstört wird.
Bei 0 und 0,2 ml Extrakt zeigten sich keine antibiotischen Zonen und bei 0,4, 0,6 und 0,8 ml Extrakt 1,1 bzw. 1,4 bzw. 1,7 Einheiten antibiotischer Aktivität. Bei Zugabe von 0,8 ml Extrakt, der 5 Minuten lang gekocht wurde, war keine antibiotische Aktivität mehr festzustellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität mit steigender Konzentration des Extraktes ansteigt und durch Kochen zerstört wird.
Zellfreie Extrakte von C. acremonium M-0198 wurden wie
in Beispiel 1 erzeugt, nur wurden die Kulturen unterschiedlich
lange wachsen gelassen. Es wurden 200 Mikrogramm
LLD pro ml hinzugefügt und das Brüten dauerte
eine Stunde. Es zeigte sich folgendes Verhalten:
Bei einem Alter der Kultur von 44, 56 und 68 Stunden betrug die antibiotische Aktivität 5,3 bzw. 1,8 bzw. 2,2 Einheiten pro ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß 44 Stunden alte Kulturen mehr aktiven Wirkstoff aufweisen als ältere Kulturen.
Bei einem Alter der Kultur von 44, 56 und 68 Stunden betrug die antibiotische Aktivität 5,3 bzw. 1,8 bzw. 2,2 Einheiten pro ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß 44 Stunden alte Kulturen mehr aktiven Wirkstoff aufweisen als ältere Kulturen.
Ein zellfreier Extrakt von C. acremonium M-0198 wurde
wie in Beispiel 1 hergestellt und einmal mit 200 Mikrogramm
LLD pro ml und zum anderen mit 100, 200, 400 und
800 Mikrogramm pro ml des Tripeptids δ-(L-α-aminoadipyl)-
L-cysteinyl-L-valin (LLL) versetzt. Während sich bei dem
LLD eine antibiotische Aktivität von 1,5 Einheiten pro
ml zeigte, ergab sich bei allen LLL-Proben keine antibiotische
Wirkung. Diese Ergebnisse zeigen, daß LLL nicht
in ein Antibiotikum umgewandelt wird.
Ein zellfreier Extrakt aus C. acremonium M-0198 wurde
wie in Beispiel 1, jedoch mit einer Wachstumszeit von
48 Stunden hergestellt und sodann eine Stunde lang unter
Zusatz von 200 Mikrogramm LLD pro ml sowie ATP und
dessen Regeneriersystem bebrütet. Die antibiotische Wirkung
betrug dann 5,5 Einheiten pro ml. Das Reaktionsprodukt
wurde dann in vitro mit authentischem Penicillin
N und Isopenicillin N an je 2 g positiven und 2 g negativen
Kulturen verglichen. Die Aktivität der authentischen
Antibiotika war dabei gemäß der chemischen Analyse des
β-Lactam-Ringes, der Hydroxylaminprobe, auf 5 Mikrogramm
pro 5 ml eingestellt. Bei Anwesenheit von 10 Mikrogramm
Penicillin N bzw. Isopenicillin N pro ml zeigten sich bei
den grampositiven Kulturen Staphylococcus aureus ATCC
25 923 und Sarcina lutea ATCC 9314 antibiotische Zonen
nur bei Isopenicillin N und beim Reaktionsprodukt, nicht
dagegen beim Penicillin N; und bei den gramnegativen Kulturen
Salmonella typhimurium ATCC 13 311 und Pseudomonas
aeruginosa Pss ergaben sich antibiotische Zonen nur beim
Penicillin N, nicht dagegen beim Isopenicillin N und beim
Reaktionsprodukt. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei den
verwendeten Konzentrationen das Reaktionsprodukt in seiner
antibiotischen Aktivität nicht dem Penicillin N
nachschlägt, sondern ganz deutlich dem Isopenicillin N.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Penicillin N aus dem
Tripetid δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin (LLD)
unter Verwendung eines zellfreien Pilzkultur-Extrakts
als Katalysator, gekennzeichnet
für die Herstellung von Isopenicillin N durch folgende
Abwandlung:
- (1) als Ausgangsmaterial wird das Tripeptid LLD oder
ein Derivat der Struktur
verwendet, worin die Radikale R, R₁ und R₂ gleich
oder verschieden und aus einer Gruppe gewählt sind,
die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl
umfaßt, und das Radikal R₃ zu einer Gruppe gehört,
die-(CH₂)₃-CH(NH₂)-, -(CH₂)₃-CHBr-, -(CH₂)₃-CH(N₃)-,
-CH(NH₂)-(CH₂)₂-CH(NH₂)-, -(CH₂)₂-CH(NH₂)-,
-(CH₂)₄-CH(NH₂)-, -CH₂-S-CH₂-CH(NH₂)-,
-CH₂-S-C-(CH₃)₂-CH(NH₂)-, -CH(CH₃)-S-CH₂-CH(NH₂)-
und -(CH₂)₄-enthält, - (2) in einem zellfreien oder nur permeabilisierte Zellen enthaltenden Extrakt der Pilzkultur Cephalosporium acremonium werden vorbestimmte, erst in einem späteren Teil der Biosynthese wirksam werdende Enzyme, die eine Umwandlung über die Isopenicillin-Stufe hinaus bewirken würden, inaktiviert, indem der Pilzkultur-Extrakt eine vorbestimmte Zeitspanne lang eingefroren wird,
- (3) das Ausgangsmaterial und der insoweit inaktivierte Pilzkultur-Extrakt werden zusammen mit Adenosin- Triphosphat (ATP) als Energielieferant in einem Reaktionsgefäß vermischt und
- (4) die Reaktionsbestandteile werden bis zur Bildung eines Isopenicillin-N-Derivats der Struktur in dem Reaktionsgefäß belassen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Radikale R, R₁ und R₂ Wasserstoff sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Radikal R Wasserstoff, eines der Radikale R₁
und R₂ Methyl und das andere Radikal aus der Gruppe
gewählt ist, die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl
und Isopropyl umfaßt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das als Energielieferant dienende
ATP durch ein Regeneriersystem erneuert wird, das
einen Phosphatlieferanten und ein Pfosphotransferase-
Enzym enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Phosphatlieferant Phosphoenolpyruvat und das
Phosphotransferase-Enzym Pyruvatkinase ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß der zellfreie oder nur permeabilisierte
Zellen enthaltende Pilzkultur-Extrakt durch
Behandeln der Pilzkultur Cephalosporium acremonium
mit Zellwände lysierenden Enzymen erzeugt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die lysierenden Enzyme Endo-β-(1→3)-Glukanase,
Endo-β-(1→4)-Glykanase und Zymolyase enthalten.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reaktionsbestandteile zur
Beschleunigung der Sauerstoffübertragung in dem Reaktionsgefäß
geschüttelt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reaktionsbestandteile mit
Mannitol sowie Spuren von Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat
versetzt und auf einen pH-Wert von ungefähr
7,2 gepuffert werden.
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