DE1922843B2 - Verfahren zur mikrobiologischen oxydation von pentaerythrit zu tris (hydroxymethyl)essigsaeure - Google Patents
Verfahren zur mikrobiologischen oxydation von pentaerythrit zu tris (hydroxymethyl)essigsaeureInfo
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Description
Es ist bekannt, daß die verschiedensten Verbindüngen
auf mikrobiologischem Woge oxydiert werden können. So ist beispielsweise die mikrobiologische
Oxydation primärer Alkohole zu Carbonsäuren in lebenden Organismen allgemein üblich. Es ist daher
auch schon bekannt, zahlreiche, oxydierend wirkende Mikroorganismen auf geeigneten, verschiedene organische
Verbindungen enthaltenden Kulturen oder Nährböden zu züchten, um entweder Oxydationsnebenprodukte oder Zellstoffwechselprodukte zu gewinnen.
Es hat sich j"doch gezeigt, daß derartige Kulturen oder Nährböden mcht immer se^r ergiebig
sind oder nicht angegriffen werden. So ist es beisoielsweise
bekannt, z. B. aus dem Aufsatz von De Ley und Kersters »Oxidation of Aliphatic Glykols by Acetic Acid Bacteria«, veröffentlicht in
der Zeitschrift »Biological Reviews«, Bd. 28, Nr. 2, S. 164 bis 180, und der Arbeit von Kersters und
D e L e y »The Oxidation of Glycols by Acetic Acid Bacteria«, veröffentlicht in der Zeitschrift »Biochim.
Bioplys. Acta «, Bd. 71, S. 311 bis 331 (1963), daß der mehrwertige Alkohol »Pentaerythrit« durch Bakterien
und andere Mikroorganismen, insbesondere durch Essigsäurebakterien, nicht angegriffen wird.
Verschiedene, auf einer Oxydation von Pentaerythrit beruhende chemische Verfahren zur Herstellung
von Tris(hydroxymethyl)essigsäure haben sich als unbefriedigend erwiesen, da sie lediglich zu äußerst
geringen Ausbeuten führen. Im übrigen sind derartige chemische Verfahren nicht leicht durchführbar und/
oder in großtechnischem Maßstab sehr teuer, da hierbei einerseits nitriert werden muß und andererseits
Platinkatalysatoren erforderlich sind. Die Tris(hydroxymethyl)essigsäure stellt jedoch beispielsweise
ein wcilvolles Zwischenprodukt für die Herstellung
substituierter 3-Pyrazolidine, beispielsweise zur Herstellung
der in der belgischen Patentschrift 700008 beschriebenen 3-Pyrazolidone dar, welche ihrerseits
eine besondere Bedeutung als photographische Entwicklerverbindungen haben. Verfahren zur Herstellung
von 3-Pyrazolidonen aus Tris(hydroxymethyl)-essigsäure
sind bekannt und werden beispielsweise in den USA.-Patentschriften 2 772 282, 2 843 598
und 2 743 279 beschrieben.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit
zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure aufzufinden, das bei geringem Kostenaufwand hohe Ausbeuten an
der Säure liefert.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das BakteriuTi »Flavobacterium oxydans« (ATCC
Nr. 21 245) ein hervorragend wirksamer, oxydierend wirkender Mikroorganismus ist und Pentaerythrit
unter aeroben Bedingungen in Tris(hydroxymethyl)-essigsäure zu überführen vermag.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit
zu Tris(hydroxymethyl)essigs;'.ure unter aeroben Bedingungen, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß man die mikrobiologische Oxydation unter Verwendung von Flavobacterium oxydans (ATCC
Nr. 21 245) in einem wäßrigen, Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen
3,0 und 9,5 bei einer Temperatur zwischen 20 und 37CC durchführt.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können übliche, das Wachstum von Bakterien fördernde
Nährmedien oder Nährböden verwendet werden.
Die Tatsache daß sich Pentaerythrit auf mikrobiologischem
Wege zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydieren läßt, war insbesondere deshalb nicht zn
erwarten, weil bisher keinerlei Anzeichen für eine Angreifbarkeit von Pentaerythrit durch oxydierend
wirkende Organismen, speziell Essigsäurebakterien vorlagen. Im Gegenteil war seit längerer Zeit bekannt
daß der Alkohol gegenüber einer biologischen Oxy dation beständig ist. Im übrigen hat es sich gezeigt
daß die verschiedensten, oxydierend wirkenden Mikro Organismen der verschiedensten Gattungen, einschließ
Hch Essigsäurebakterien, ζ. B. Bacillus, Saccharmyces Pseudonionas, Flavobacterium, Nocardia, Rhizopus
Acetobacter, Mycobacterium, Lactobacillus, Penicillium,
Xanthamonas, Chromobacterium, Arthrobacter,
Rhodospirillum und Helicostylum, nicht zur Herstellung von Säure aus Pentaerythrit geeignet
sind. Insbesondere greifen z. B. Flavobacterium aquatile.
Flavobacterium suaveolens, Flavobacterium devorans, Nocardia Carolina, Pseudomonas putida und
Arthrobacter oxydans Pentaerythrit nicht oxydativ an. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht erstmals
unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus auf mikrobiologischem Wege Pentaerythrit zu Tris-(hydroxymethyl)essigsäure
zu oxydieren. Das Verfahren der Erfindung hat im Gegensatz zu den bisher
bekannten Pentaerythrit-Oxydationsverfahren, bei denen die Tris(hydroxymethyl)essigsäure nur in äußerst
geringen Ausbeuten erhalten wird, den Vorteil, daß es leicht durchführbar ist, und zwar auch im großtechnischen
Maßstab und zu Ausbeuten an Tris-(hydroxymethyl)essigsäure führt, die mit den bisher
bekannten Verfahren nicht erreicht wurden. Ein weiterer Vorteil gegenüber den bekannten Oxydation:.-verfahren
besteht darin, daß das beanspruchte Verfahren in einer Stufe zu dem gewünschten Endprodukt
führt und daß die Verwendung von teuren Platinkatalysatoren vermieden wird.
I η vorteilhafter Weise arbeitet man derart, daß man
den zu oxydierenden Pentaerythrit zuerst in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtspro/.ent
pro Liter Kulturmedium in das Gärmedium einträgt, worauf man portionsweise weitere Anteile
der zu oxydierenden Verbindung zusetzt, bis deren
Konzentration pro Liter Kulturmedium bis zu etwa 10. vorzugsweise etwa 6 Gewichtsprozent beträgt.
Auf diese Weise erreicht man besonders hohe Ausbeuten an Tns(hydroxymethyl)essigsäure.
Fine lOgewichtsprozentige Lösung von Pentaerythrit kann bei einer Temperatur von etwa 30 C eine
gesättigte Lösung im Nährmedium darstellen.
Als das Wachstum des Bakteriums fördernde Nährmedien und Energiequellen können übliche bekannte
kohlenstoffhaltige Verbindungen verwendet werden, z. B. die üblichen bekannten Zucker- und Stärkeprodukte
sowie Mischungen derselben, z. B. Essigsäure, Surrose, Glucose, Glycerin, Bernsteinsäure,
Äthylenglykol und/oder Zitronensäure. Die Konzentration derselben soll ausreichen, um ein genügendes
Wachstum der Mikroorganismen zu gewährleisten.
Zweckmäßig enthält das Fermentations- oder Gärmedium
etwa 0,1 bis etwa 0,3 und vorzugsweise 0,2 Gewichtsprozent kohlenstoffhaltige Verbindungen.
Im übrigen enthält das im Rahmen des Verfahrens der Erfindung verwendete Gärmedium, abgesehen
von den angegebenen Bestandteilen, üblicherweise in Gärmedien verwendete Mineralsalze. Ferner kann
das Gärmedium in vorteilhafter Weise übliche Stickstoff-, Phosphor- und/oder Schwefellieferanten sowie
Spuren von Eisen-, Mangan- und/oder andere Spuren von Metallionen enthalten. Beispiele für geeignete
Verbindungen mit derartigen Ionen sind Ammoniumnitrat, Kaliumdiphosphat, Eisen(II)-sulfat und Magnesiumsulfat.
Zweckmäßig werden diese Verbindungen zunächst in Wasser aufgelöst, worauf die erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 5,5
bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 7,2 bis etwa 7,6. eingestellt wird.
Gegebenenfalls lassen sich Ausbeute und Produktionsgeschwindigkeit
an Tris(hydroxymethyl)essigsäure weiter dadurch steigern, daß man dem Gärmedium
zusätzlich pro Liter etwa 0,1 bis etwa 0,3, vorzugsweise etwa 0,2 g, eines das Wachstum des
Mikroorganismus stimulierenden Stoffes, beispielsweise einen Hefeextrakt, zusetzt Andere, das Wachstum
des Mikroorganismus stimulierende Stoffe sind beispielsweise reine Vitaminmiscbungen, getrocknete
und pulverisierte Maismaische sowie flüssige Mais· oder Getreidemaische.
Als Stickstofflieferant können die verschiedensten
ίο Stoffe, beispielsweise getrockneter Hefeextrakt, in
einer Konzentration von z. B. etwa 1% verwendet werden. Bei dieser Konzentration liefert der Hefeextrakt
auch noch andere Nährstoffe, z. B. Sulfat-, Phosphat- und verschiedene Metallionen.
Zu der angegebenen Gruppe von Nährstoffen gehören ferner beispielsweise Baumwollsaatmehl und
Sojabohnenmehl. Weitere geeignete einfache Stickstofflieferanten sind beispielsweise Glutaminsäure,
Glutamin, Aspartate, d. h. Salze der der Asparaginsäure, z. B. das Natriumsalz der Asparaginsäure,
Harnstoff, Nitrate und Mischungen solcher Stoffe.
beispielsweise Mischungen aus Glutaminsäure und Asparagin.
Zur Förderung des Wachstums des beim Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismus werden
somit übliche Kohlenhydrate und/oder andere übliche Kohlenstoffenergiequellen verwendet.
Bei dem zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus handelt es
sich um einen neuen Mikroorganismus, von dem Kulturen unter der Nummer ATCC 21 245 bei der
American Type Culture Collection in Washington, D. C, USA, und dem Büro in Rockville, Maryland,
USA, 12 301 Park Lawn Drive, erhältlich sind.
Der Mikroorganismus wurde in Rochester, N.Y.,
USA, nach einem speziellen Kulturverfahren aus dem Boden isoliert. Hierbei wurden 150 g Erde in
250 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung:
NährstofT
Pentaerythrit ..
(NH4J2SO4
(NH4J2SO4
K2HPO4
MgSO4-7H2O
MnSO4 7H2O
FeSO4-7H2O .
FeSO4-7H2O .
NaCl
CaCl-2H2O ..
ZnSO4 7H2O.
Hefeextrakt....
Hefeextrakt....
p. I Wa..»er
20,0
2.0
2.0
0.25
0,27
0,028
0,0006
0.001
0,0006
0,2
2.0
2.0
0.25
0,27
0,028
0,0006
0.001
0,0006
0,2
eingetragen und ohne Bewegung 2 Wochen lang bei einer Temperatur von etwa 300C inkubiert. Hierauf
wurden Teile der erhaltenen Kultur zum Impfen eines frischen, sterilen Kulturmediums verwendet. Dieses
wurde erneut 1 Woche lang bei einer Temperatur von etwa 300C inkubiert. Als zweckmäßig hat es sich
dabei erwiesen, das Kulturmedium während der Inkubation, beispielsweise mit einer Rührgeschwindigkeit
von etwa 400 U/Min., zu rühren.
Bei der Isolierung des Mikroorganismus wurde gefunden, daß dieser aus mindestens zwei Stämmen
mit den im folgenden angegebenen Kultur- und phy-
1
siologischen Eigenschaften besteht Auf Grund dieser Eigenschaften läßt sich der Mikroorganismus identifizieren
und von anderen bekannten Mikroorganisxnen
unterscheiden. Aus den Mikroorganismen lassen sich spontan ähnliche, oxydierend wirke ade Mutanten
entwickeln. Sie lassen sich bei dem als Fiavobacierium
oxydans (ATCC Nr. 21 245) bezeichneten Mikroorganismus leicht nachweisen. Ferner lassen
sich aus den neuen Mikroorganismen auch durch andere bekannte Maßnahmen, beispielsweise tiurcb
Einwirkenlassen verschiedener mutagener Verbindungen, beispielsweise Äthylmethansulfonat, oder
von UV-Strahlen Mutationen erzeugen.
Zwei der Stämme, im folgenden als Pe 25 und Pe 25 sm1 bezeichnet, unterscheiden sich voneinander
lediglich dadurch, daß der erstere, bei dem es sich um einen bevorzugten Stamm handelt, auf
Pentaerythrit als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen und diesen metallisieren kann, während der letztere,
ein anderer besonders vorteilhafter Stamm, eine Kohlenstoffquelle des später beschriebenen Typs
an Stelle des Pentaerythrits benötigt. Die beiden Stämme unterscheiden sich ferner visuell voneinander
dadurch, daß bei einem pH-Wert der Farbton eines Pentaerythrit enthaltenden Nährmediums verschieden
ist sowie durch ihre Koloniengröße.
Der Mikroorganismus »Flavobacterium oxydans« (ATCC Nr. 21 245) besitzt die im folgenden angegebenen
Kultur- und physiologischen Eigenschaften, auf Grund welcher er identifiziert und von anderen
bekannten Mikroorganismen unterschieden werden kann:
Färbeeigenschaften Alter in Stunden
18 Gram(-)
168 Gram ( + ) und (-)
Nicht säurebeständig
Zellmorphologie
nach bis zu 7tägigem Wachstum auf einem Glucose-Hefeextrakt-Medium)
Form Stäbchen, 0,6 bis
0,7 μ χ 0,8 bis 1,0 μ; sehr oft in Paaren
oder kurzen Ketten mit bis zu etwa 8 Mikroorganismen
Bewegungsvermögen .... nicht frei beweglich
Nicht sporenbildend
. Nicht verkapselt
. Nicht verkapselt
Agar-Kolonien (Glucose-Hefeextrakt-Medium)
Alter 72 Stunden
Form rund
Erhöhung konvex
Oberfläche glatt
Rand ganzrandig
Farbstoffbildung zunächst grauweiß,
in 5 Tagen gelb werdend
843 *
Agar-Abstrich (Glucose-Hefeextrakt-Medium)
Alter 72 Stunden
Fonn fadenförmig
(Filiform)
Konsistenz butterartig
Farbbildung zunächst grauweiß,
hierauf nach 5 Tagen
gelb
Nährbrühe
Alter 7Tage
Oberflächen wachstum.. - kernes
Trübung geringfügig
Sediment kompakt
Menge spärlich
Gelatineansatz (Gelatin Stab) (Glucose-Hefeextrakt und 5 % Gelatine)
Alter 14 Tage
Verflüssigung keine
Wachstum reichliches Oberflächenwachstum
KartofTeln-Dextrose-K olonien
Alter 7 Tage
Wachstum keines
Hugh-Leifson-Kohlehydrat-Medium
Alter 14 Tage
Sauerstoffabhängigkeit streng aerob Glucose, geringfügig
sauer keine Gasbildung
Lactose, alkalisch keine Gasbildung
Sucrose, sauer keine Gasbildung
Glycerin, sauer keine Gasbildung
Mannitol, sauer keine Gasbildung
Wirkung auf Milch
Alter 14 Tage
Lackmus alkalisch, keine
Koagulation; keine Reaktion
Ulrich alkalisch unter
Reduktion
Loeffler-Blutserum
Alter 21 Tage
Wachstum keines
Sim-Medium
Alter 14 Tage
Selbständiges
Bewegungsvermögen keines
H2S kein
Indol kein
Kligler-Eisen-Agar
Alter 14 Tage
H2S kein
Dextrose und Lactose werden nicht fermentiert.
Alkalisches Ei-Medium
Alter 14 Tage
Keine proteolytische Aktivität,
Weitere SpezialUntersuchungen
A. Gutes Wachstum innerhalb von 4 Tagen in einem 5% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden
Medium; pH-Wert bleibt bei 7,5; kein Wachstum
in einem 10% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium;
B. gutes Wachstum innerhalb von 7 Tagen in einem Citratmedium; Bildung eines schwachen Häutchens;
C. gutes Wachstum innerhalb \Όη 72 Stunden in
einem 3% Natriumchlorid enthaltenden Glucose-Hefeextrakt; kein Wachstum, wenn der Natriumchloridgehalt
auf 10% erhöht wird;
D. kein Wachstum innerhalb von 14 Tagen in einem Harnsäuremedium;
Methylrot negativ
Voges-Proskauer negativ
Stärke wird nicht hydrolysiert.
Aus Nitrat wird Nitrit erzeugt.
Cellulose wird nicht hydrolysiert.
Aus Nitrat wird Nitrit erzeugt.
Cellulose wird nicht hydrolysiert.
Temperaturabhängigkeit
Alter 72 Stunden
4°C kein Wachstum
25° C schwaches Wachstum
30° C reichliches
Wachstum
37° C kein Wachstum
37° C kein Wachstum
Geeignete Kohlenstofflieferanten
(a) beide Stämme wachsen auf Acetat, Succinat,
Äthylenglykol, D-Ribitol, i-Erythrit, D-Xyiose;
(b) Für das Wachstum von Stamm Pe 25 allein: Pentaerythrit, Dipentaerythrit, 2 - Hydroxymethyl
- 2 - methyl -1,3 - propandiol, 2 - Hydroxymethyl - 2 - äthyl -1,3 - propandiol, 2 - Hydroxymethyl-2-propyl-l,3-propandiol,
2^-Dimethyl-1,3 - propandiol, NeopentylalkohoL Monoacetin,
D-Xylit, D-Arabit, Sorbit
Kein oder schwaches Wachstum auf:
(a) 2 - Desoxy - D - glucose, D - Glucoronolacton,
Dulcitol, 2-{Hydroxymethyl)-2-nitrol- 1,3-propandiol.
2 - (Hydroxymethyl) - 2 - amino -1,3 - propandiol, 2 - (Hydroxymethyl) - 2,2 - diphenyl-1,3-propandiol,
2-Methyl-2-nitro- 1,3-propandiol.
Geeignete Stickstofflieferasten
Wachstum auf NO^", NH4*, Asparagin, Glutamat,
komplexen natürlichen Lieferanten, wie Baumwollsaatmehl,
Hefeeartrakt, Caseinhydrolysat, verschiedenen
Peptonen und Sojabohnenmehl.
Schwacher Stickstofflieferant; Harnstoff.
Zweckmäßig wird das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37° C und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 30° C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig hat es sich ferner erwiesen, das Gärmedium zu rühren, obwohl es auch in anderer geeigneter Weise, beispielsweise in Schüttelflaschen, bewegt werden kann.
Zweckmäßig wird das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37° C und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 30° C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig hat es sich ferner erwiesen, das Gärmedium zu rühren, obwohl es auch in anderer geeigneter Weise, beispielsweise in Schüttelflaschen, bewegt werden kann.
ίο Die Wachstumsgeschwindigkeit des neuen Mikroorganismus
läßt sich in unerwarteter Weise vorteilhaft durch Ändern der Temperatur- und Belüftungsbedingungen
und/oder der Impfstoffmenge und des lmpfstoffzustands
steuern. In nährstoffreichen Nährböden gestattet eine unter der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit
liegende Wachstumsgeschwindigkeit der betreffenden Mikroorganismen eine maximale Induktion
oxydierender Enzyme. Insbesondere läßt sich die Wachstumsgesch windigkeit der Gärmedien unter Rühren
beispielsweise leicht dadurch steuern, daß man die Temperatur von etwa 30 auf etwa 22 bis etwa 24 und
vorzugsweise auf etwa 23° C erniedrigt. Als zweckmäßig
hat es sich erwiesen, das Gärmedium wenig zu belüften, d. h. pro Volumen Gärmedium und Minute
nur etwa 0,10 bis etwa 0,14 und vorzugsweise 0,12 Volumina Luft zu verwenden.
Als vorteilhaft hat es sich ferner erwiesen, einen Impfstoff aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase,
d. h. in der Zeit zwischen dem etwa 40- und 72stündigen Wachstum und vorzugsweise nach
etwa 48stündigem Wachstum, zu verwenden.
Aus dem später folgenden Beispiel 6 ergibt sich die logarithmische Wachstumsphase des Mikroorganismus
Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245). Bei dieser Altersstufe von Flavobacterium oxydans erfolgt
die Induktion des Pentaerythritenzyms bis nahe an den maximalen Wert, so daß in der Regel etwa 50 bis
zu etwa weniger als 100%, d. h. meistens bis zu etwa 97%, des Alkohols bei der Inkubation zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure
oxydiert werden. Das Auftreten von Tris(hydroxymethyl)essigsäure wird durch
ein entsprechendes Verschwinden von Pentaerythrit, welcher daneben noch in äußerst geringer Menge
durch Nebenreaktionen verlorengeht, begleitet. Während zunächst ein Anstieg des pH-Wertes des Nährrncdjurns
von etwa 7,0 auf etwa 8.0 zu verzeichnen ist, sinkt dieser hierauf infolge der Bildung von
Tris(hydroxymethyl)essigsäure auf etwa 5,6 ab. Zweckmäßig hält man den pH-Wert des Nährmediums auf
einem Wert von etwa 3,0 bis etwa 9,5, vorzugsweise auf einem Wert von etwa 6,0 bis etwa 8,0.
Die Kultur wächst in der Regel (lediglich) während der ersten 3 Tage der Inkubation und verbleibt hierauf
in einer stationären Wachstumsphase. Während dieser
ss Zeit läuft jedoch die Oxydation weiter. Das auf diese
Weise im Nlhrmedium oder im Nährboden gebildete
Oxydationsprodukt, beispielsweise Trisfhydroxymethyl)essigsäure,
kann mit einer geeigneten Base, beispielsweise Kaliumcarbonat oder Calcrumcaxbonat,
neutralisiert werden.
Gibt man z. B. zu dem im Nährmedium bereits in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 3 Gewich sprozent
vorhandenen Pentaerythrit portionsweise weiteren Pentaerythrit zu, bis dessen Konzentration im
6s Nährmedium insgesamt etwa 10 und vorzugsweise etwa 6 Gewichtsprozent beträgt, so lassen sich Ausbeuten
bis zu 64 g/l (97% der theoretischen Ausbeute) erreichen.
209 584/591
Zur Reindarstellung der Tris(hydroxymethyl)essigsäure,
kann die gesamte Kulturbrühe, einschließlich der Mikroorganismen, zentrifugiert werden, wobei die
Mikroorganismen entfernt werden. Hierauf kann die erhaltene Brühe durch Zugabe von beispielsweise
Kaliumhydroxyd, Calc:umhydroxyd oder Kalk auf
einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert werden. Nach dem Neutralisieren wird die Brühe mit einem Ionenaustauschharz
in Kontakt gebracht. Hierbei wird die Säure zunächst an das Ionenaustauschharz adsorbiert
und hierauf mit einer wäßrigen Säurelösung eluiert. Zum Adsorbieren der Säuren eignen sich übliche
stark basische Anionenaustaascherharze. Zum
Eluieren der adsorbierten Säuren ist Ameisensäure besonders geeignet.
Die Tris(hydroxymethyl)essigsäure läßt sich aus der wäßrigen Lösung, beispielsweise durch Eindampfen
der wäßrigen Lösung bis zur Trockne, isolieren. Die Säure kann gegebenenfalls, beispielsweise durch Umkristallisieren
aus einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Benzol oder Isopropanol, oder einer
Lösungsmittelmischung, beispielsweise einer Mischung aus Äthanol und Benzol, weiter gereinigt werden.
Da die biologische Oxydation von Kohlenstoffverbindungen in der Regel in einzelnen Stufen unter
Bildung von Zwischenprodukten abläuft, wobei als Endprodukt CO2 erhalten wird, kann ein anderes
Gewinnungsverfahren zur Reindarstellung von Vorteil sein, wenn es notwendig ist, das Carbonat zu zersetzen,
aus dem das CO2 gebildet wird, welches durch die Austauschersäule perlt, wenn Ameisensäure zugesetzt
wird.
In diesem Falle wird die vorher zentrifugierte Fermentationsbrühe durch Zugabe einer Säure, beispielsweise
Ameisensäure, auf einen pH-Wert von etwa 4 gebracht und 1 Stunde lang mit Stickstoff gespült
Daraufhin wird der pH-Wert der Gärbrühe durch Zugabe einer Base, beispielsweise Kalium- oder Natriumhydroxyd,
auf etwa 7 eingestellt. Hierauf wird die Gärbrühe erneut zentrifugiert und auf die lonenaustauschersaule
aufgegeben.
Die Menge der in der Gärbrühe gebildeten Tris-(hydroxymethyl)essigsäure,
läßt sich entweder durch vollständige Isolierung der Säure oder aber auf gaschromatographischem
Wege in der später näher beschriebenen Weise ermitteln.
Während der einzelnen Verfahrensstufen können die Temperatur- und Druck bedingungen, abgesehen
von den bereits angegebenen Werten, in üblicher bekannter Weise abgewandelt werden.
Das Verfahren der Erfindung kann in der verschiedensten Weise abgewandelt werden. So kann das
Pentaerythrit beispielsweise dem Nährmedium einverleibt werden, nachdem zunächst die Inkubation
der Mikroorganismen eingeleitet wurde. Andererseits können die Mikroorganismen auch einem das Pentaerythrit
bereits enthaltenden Medium zugesetzt werden. Schließlich können die Mikroorganismen als
Impfstoff, bestehend aus ganzen Zellen, Zellbruchstücken oder Zellextrakten, zugegeben werden, um ein
Bakterienwachstum zu erreichen. Werden Zeilbruchstücke verwendet, so können diese nach den verschiedensten
Verfahren, beispielsweise nach physikalischen oder chemischen Verfahren, z. B. durch Vibrationen,
erzeugt worden sein.
Wird der Mikroorganismus Flavobacterium oxydans auf einem reichhaltigen unspezifischen Medium,
beispielsweise einem Nahrmedium aus Hefeextrakt (1 %) und Glucose (1 %) oder einem der beschriebenen
Säure erzeugenden Medien, d. h. auf einem Medium auf dem auch andere Kulturen wachsen und existieren
können, gezüchtet, so kann er langsam seine Oxydationsfähigkeit verlieren. Zur Gewährleistung einei
ausreichenden Wirksamkeit der Mikroorganismen, d. h. zur Erzielung hoher Ausbeuten an Tris(hydroxymethyl)essigsäure,
können solchen Kulturen Säure produzierende Kolonien selekti j entnommen und aufbewahrt
werden. Diese Kolonien lassen sich 3 bis 5 Tage, nachdem sie auf einen den pH-Wert anzeigenden
und Pentaerythrit enthaltenden Nährboden aufgebracht wurden, leicht durch eine auf eine Säureproduktion
hindeutende Färbung von keinen Säure produzierenden Stämmen, welche naturgemäß auch
zu keiner, auf eine Säureproduktion hindeutenden Färbung führt, unterscheiden. Die abgetrennten Kolonien
können in einer Lösung, die das Wachstum der Bakterien ermöglicht und die Kulturen enthalt, beispieisweise
in einer physiologischen Kochsalzlösung, dispergiert und auf Nährboden, beispielsweise Agarflächen,
ausgestrichen werden. Nach 2tägigem Wachstum bei einer Temperatur von etwa 30" C können die
Kulturen bei verminderten Temperaturen über einige
Monate hinweg oder länger aufbewahrt werden, ohne daß ihre Oxydationsfähigkeit verlorengeht. Nach
einem anderen Aufbewahrungs- und Konservierungsverfahren können die Kulturen z. B. aus einer wäßrigen
Suspension, beispielsweise Magermilch, gefriergetrock-
net werden. Werden diese Kulturen unter Verschluß gehalten, bleiben sie für eine lange Zeit lebensfähig.
Für die Durchführung gaschromatographischer Bestimmungsverfahren lassen sich übliche bekannte
Gaschromatographen mit einem thermischen Leitfähigkeitsdetektor verwenden. DieChromatographiersäule
kann z. B. aus einem etwa 1,8 m langen, rostfreien Stahlrohr mit einem Außendurchmesser von etwa
3,2 mm bestehen. Die Packung der Säule kann z. B. aus kalzinierten Kieselguraggregaten mit einem Gehalt
an 10% Silikonkautschuk bestehen.
Der Heliumfluß beträgt 30 ml/Min. Die Temperatur an der Einspritzöffnung kann z. B. 295" C betragen.
während die Säulentemperatur auf 120 bis 265 C bei einer Temperatursteigerung von 30 C/Min. pro-
grammiert werden kann. Der thermische Leitfähigkeitsdetektor kann z. B. bei einer Temperatur von
3000C unter Verwendung eines Brückenstroms von
150 Milliampere betrieben werden.
Bei der Durchführung des Meßverfahrens wird zunächst 1 ml der Gärbrühe in einer Gefriertrocknungsvorrichtung zur Trockne »eingedampft«. Zu dem erhaltenen Rückstand werden dann 0,3 ml Chlortrimethylsilan, 0,3 ml 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan und 0,3 ml einer Lösung von Octadecan in Pyridin
Bei der Durchführung des Meßverfahrens wird zunächst 1 ml der Gärbrühe in einer Gefriertrocknungsvorrichtung zur Trockne »eingedampft«. Zu dem erhaltenen Rückstand werden dann 0,3 ml Chlortrimethylsilan, 0,3 ml 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan und 0,3 ml einer Lösung von Octadecan in Pyridin
(0,08 g Octadecan mit Pyridin auf 1 ml aufgefüllt) zugegeben. Nach 4stündigem Stehenlassen wird die
Probe gaschromatographisch analysiert. Hierbei werden Einspritzvolumina von 1,4 bis 1,6 Mikroliter verwendet
Die Konzentration an Tris(hydroxymethyl)essigsäure in 1 ml Gärbrühe läßt sich wie folgt bestimmen:
Verschiedene Mengen einer analysenreinen Tris(hydroxymethyl)essigsäure,
nämlich 1 bis 40 mg, werden in ihre Trimethylsflylderivate übergeführt Die ein-
zelnen Proben werden hierauf in der beschriebenen Weise analysiert Wenn das Verhältnis des Peakbezirks
des Trimethylsilylderivats zu dem Peakbezirk von Octadecan gegen die in der ieweilieen Probe
enthaltene Menge Tris(hydroxymethyl)essigsäure in Milligramm aufgetragen wird, erhält man eine Eichgerade.
Wird nun eine Probe der Gärbrühe in der beschriebenen Weise analysiert, so entspricht die Milligrammmenge
Tris(hydroxymethyl)essigsäure in der Testprobe auf der Eichgeraden dem Verhältnis des Peakbezirks
des Trimethylsilylderivats zum Peakbezirk des Octadecans.
Das Infrarotppektrum der durch mikrobiologische Oxydation hergestellten Tris(hydroxymethyi)essigsäure
sowie das Massenspektrum ihres Trimethylsilylderivats sind mit den mit einer Prlbe der durch
Platin katalysierte Oxydation von Pentaerythrit hergestellten Säure aufgenommenen Spektren identisch.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen.
In einer Reihe von 125 ml fassenden und mit jeweils einem rostfreien Stahlverschluß nach Morton ausgestatteten
Erlenmeyerkolben wurden Gärungen durchgerührt. Die einzelnen Kolben enthielten jeweils
25 ml eines wäßrigen Nährmediums mit Essigsäure, 2 g/l eines Kohlenstofflieferanten, 10 g/l Hefeextrakt
und 20 g/l Pentaerythrit. Die einzelnen Nährmedien wurden durch Zugabe von Kaliumhydroxyd auf einen
pH-Wert von 7 neutralisiert und hierauf in einem Autoklav 15 Minuten lang bei einem Dampfdruck
von 2,05 kg/cm2 sterilisiert. Die in den einzelnen Kolben enthaltenen 25 ml Nährmedium wurden mittels
einer öse mit jeweils etwa 0,75 mg (Trockengewicht) einer vorher 2 Tage lang auf einem schrägen
Nährboden bei einer Temperatur von etwa 300C
gezüchteten Kultur angeimpft. Hierauf wurden die einzelnen Kolben bei einer Temperatur von 30 ± TC
mit 400 U/Min auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bewegt. Von Zeit zu Zeit wurden aus der
Gärbrühe Proben"entnommen und untersucht, wobei die in der folgenden Tabelle angegebenen Ergebnisse
erhalten wurden.
Kolben Nr.
10
11
12
2tägiger
5.38
6,80
6,25
2,65
5,70
6,03
5,25
7,35
3,13
5,90
3,50
2,40
6,25
2,65
5,70
6,03
5,25
7,35
3,13
5,90
3,50
2,40
!de'.e Säuremenpe in | g/l nach |
7tägiger | |
4tägiger | |
Fermentation | 10,27 |
15,65 | |
11,42 | |
10,60 | |
11,08 | |
11,15 | |
11,07 | |
14,85 | |
12,05 | |
10,85 | |
11,28 | |
IUl | |
10.00 | |
12,50 | |
10,30 | |
8,41 | |
10,32 | |
10,20 | |
10.77 | |
10,48 | |
9,72 | |
10,00 | |
10,00 | |
9,80 |
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß während
der Inkubationsdauer an den in der folgenden Tabelle mit + bezeichneten Tagen schrittweise 250 mg Pentaerythrit
und 200 mg Calciumcarbonat zugesetzt wurden.
Es konnte eine erhöhte Ausbeute an Tris(hydroxymethyl)essigsäure im Vergleich zu den Ergebnissen
des Beispiels 1 nach 7tägiger Fermentation festgestellt werden.
'5 | O | Gebildete Menge an | |
Zeit in Tagen | 3 + | Tris(hydroxymethyl)essigsäure | |
4+ | in g/l | ||
20 5 + | 0 | ||
6 + | 13,2 | ||
7 | 19,1 | ||
11 | 22,3 | ||
35,5 | |||
45,0 | |||
64,0 |
Bei der Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure in einem kleinen Gärgefäß unter Rühren und
automatischer Neutralisation mit Kaliumcarbonatiösung konnte eine Produktionssteigerung bis zu
97% der theoretischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure erreicht werden.
Die Gärung wurde in einem zylindrischen, aus Glas bestehenden Gärgefäß mit einer Kapazität von 650 ml,
einem Durchmesser von 7 cm und einer Höhe von 14 cm durchgeführt. Das Rühren erfolgte mit einem
5 cm langen, magnetischen Rührstäbchen, welches mit einer Geschwindigkeit von 1200 U/Min umlief. Die
Belüftungsgeschwindigkeit betrug 80 ml/Min. (0,12 vvm)*) bei einer Temperatur von 300C. Die
Schaumbildung wurde dadurch gesteuert, daß jeweils, wenn der Schaum einen Schaumfühler erreichte, automatisch
ein übliches (unter der Handelsbezeichnung Antifoam C der Firma Dow Corning, Midland Michigan,
vertriebenes) Heizmittel zugegeben wurde. Das Nährmedium entsprach dem Nährmedium des Beispiels
1. Das Beimpfen des Nährmediums erfolgte in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise.
An den durch ' in der folgenden Tabelle gekennzeichneten
Tagen wurden 10 g festes Pentaerythrit zugegeben. Ab dem zweiten Tag erfolgte eine automatische
Steuerung des pH-Wertes auf 7,0 ± 0,3 unter Zulauf einer l-m-K2CO3-Lösung.
In die Kolben Nr, 2 (nach 2 Tagen) und Nr. 8
(nach 4 Tagen) wurden jeweils 200 mg Calciumcarbonat eingefüllt
Zeit in Tagen |
Gebildete Menge an
Trisihydroxymethyrjessigsäure in g/l |
0 2* 5+ 7 |
0 "8,8 34,7 54,3 |
*) = 0.12 Volumina Luft/Volumina Medium/Minute.
Der Einfluß einer Steuerung der Belüftungsgeschwindigkeit auf die Anhäufung von Tris(hydroxymethyl]pssigsäure
in Gärgefäßen, beispielsweise in einen Rührer aufweisenden Gärgefäßen, ergibt sich
aus folgenden Daten: (Die Züchtung der Kultur erfolgte 48 Stunden lang in einer dem Beispiel 3 entsprechenden
Weise.)
Belüftungsgesch windigkeit
Volumina Luft/Volumen Nährmedium/Min.
Volumina Luft/Volumen Nährmedium/Min.
0,06
0,12
0,25
0,12
0,25
Gebildete Menge an
Tris(hydroxymethyl)essigsäure
in g/l
2,2
8,8
Spur
In entsprechender Weise wie im Beispiel 3 ergibt sich der Einfluß der ursprünglichen Konzentration an
Pentaerythrit auf die Anhäufung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure während des Gärvorgangs aus der
folgenden Tabelle:
Pentaerythrit. % | Tris(hydroxymethyl)essigsäure, g/l |
0,5 | 4,6 |
1,0 | 8,0 |
2,0 | 16,0 |
4,0 | 17,0 |
6,0 | 17,3 |
8,0 | 18,2 |
10,0 | 4,0 |
Nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurden aus bei einer Temperatur von 30° C inkubierten
Kulturen zu bestimmten Zeiten Proben entnommen, in denen die entsprechenden Mengen Pentaerythrit
und Tris(hydroxymethyl)essigsäure bestimmt wurden. Ferner wurde das Bakterientrockengewicht, d. h. das
Wachstum der Mikroorganismen, bestimmt, indem
to das Absorptionsvermögen bei 650 ηΐμ gemessen und
der hierbei erhaltene Wert mit dem Trockengewicht gegenüber der Absorption verglichen wurde.
Zeit 5 in Std. |
Gebildete Menge Pentaerythrit in mg/ml |
pH | Wachstum mg/ml |
Gebildete Menge an Tris(hydroxy- methyl)essigsäure in mg/ml |
O | 20,0 | 7,0 | 0,0 | 0,0 |
°4
20 |
20,0 | 7,5 | 0,1 | 0,0 |
40 | 18,3 | 8,0 | 1,7 | 3,2 |
48 | 17,8 | 7,9 | 2,5 | 4,0 |
60 | 12,8 | 7,2 | 4,4 | 8,0 |
72 | 10,2 | 6,8 | 4,6 | 10,0 |
25 80 | 9,4 | 6,2 | 4,6 | 11,2 |
96 | 8,6 | 5,8 | 4,6 | 12,2 |
120 | 7,8 | 5,4 | 4,5 | 13,0 |
Die vorhergehenden Beispiele veranschaulichen die Ergebnisse, die mit einem vorzugsweise verwendeten
Nährmedium, d. h. einem Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium, erhalten wurden. Wie bereits erwähnt,
läßt sich jedoch eine entsprechende biologische Oxy-
dation erreichen, wenn der Pentaerythrit durch andere oxydierbare Kohlenstoffverbindungen ersetzt wird.
An Stelle von Pentaerythrit können somit beispielsweise mit gleichem Erfolg Alkohole, wie Neopentylalkohol.
Sorbit, Mannit und Aldehyde, wie Xylose,
Ribose u. dgl., verwendet werden.
Claims (8)
1. Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation
von Pentaerythrit zu Tris(bydroxymethyl)essigsäure
unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, da3 man die mikrobiologische
Oxydation unter Verwendung von Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) in einem
wäßrigen, Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 3,0 und 9,5 und einer
Temperatur zwischen 20 und 37° C durchführt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Oxydation bei einer Temperatur zwischen 22 und 24° C durchführt
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium
verwendet, das mindestens eine das Wachstum von Flavobacterium oxydans (ATCC
Nr. 21 245) fördernde Kohlenstoffverbindung enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als das Wachstum des Bakteriums
fördernde Kohlenstoffverbindung Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Glycerin,
Glucose, Äthylenglykol und/oder Saccharose verwendet.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges
Nährmedium verwendet, das pro Liter Nährmedium etwa 5 bis etwa 100 g Pentaerythrit
enthält.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium
den Pentaerythrit zuerst in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtsprozent
und danach portionsweise in einer solchen Menge zugibt, daß seine Konzentration, bezogen
auf 1 1 Nährmedium, bis zu etwa 10 Gewichtsprozent beträgt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation
bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,10 bis etwa 0,14 Volumina Luft pio Volumen
Nährmedium pro Minute durchführt.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Oxydation
Bakterien verwendet, die sich innerhalb ihrer 40- bis 72stündigen Wachstumsphase befinden.
so
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