DE1922843B2

DE1922843B2 - Verfahren zur mikrobiologischen oxydation von pentaerythrit zu tris (hydroxymethyl)essigsaeure

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Publication number: DE1922843B2
Application number: DE19691922843
Authority: DE
Priority date: 1968-05-08
Filing date: 1969-05-05
Publication date: 1973-01-25
Also published as: CH505895A; GB1244909A; DE1922843A1; US3558431A; JPS4818827B1; FR2008079A1; BE732776A

Description

Es ist bekannt, daß die verschiedensten Verbindüngen auf mikrobiologischem Woge oxydiert werden können. So ist beispielsweise die mikrobiologische Oxydation primärer Alkohole zu Carbonsäuren in lebenden Organismen allgemein üblich. Es ist daher auch schon bekannt, zahlreiche, oxydierend wirkende Mikroorganismen auf geeigneten, verschiedene organische Verbindungen enthaltenden Kulturen oder Nährböden zu züchten, um entweder Oxydationsnebenprodukte oder Zellstoffwechselprodukte zu gewinnen. Es hat sich j"doch gezeigt, daß derartige Kulturen oder Nährböden mcht immer se^r ergiebig sind oder nicht angegriffen werden. So ist es beisoielsweise bekannt, z. B. aus dem Aufsatz von De Ley und Kersters »Oxidation of Aliphatic Glykols by Acetic Acid Bacteria«, veröffentlicht in der Zeitschrift »Biological Reviews«, Bd. 28, Nr. 2, S. 164 bis 180, und der Arbeit von Kersters und D e L e y »The Oxidation of Glycols by Acetic Acid Bacteria«, veröffentlicht in der Zeitschrift »Biochim. Bioplys. Acta «, Bd. 71, S. 311 bis 331 (1963), daß der mehrwertige Alkohol »Pentaerythrit« durch Bakterien und andere Mikroorganismen, insbesondere durch Essigsäurebakterien, nicht angegriffen wird.

Verschiedene, auf einer Oxydation von Pentaerythrit beruhende chemische Verfahren zur Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure haben sich als unbefriedigend erwiesen, da sie lediglich zu äußerst geringen Ausbeuten führen. Im übrigen sind derartige chemische Verfahren nicht leicht durchführbar und/ oder in großtechnischem Maßstab sehr teuer, da hierbei einerseits nitriert werden muß und andererseits Platinkatalysatoren erforderlich sind. Die Tris(hydroxymethyl)essigsäure stellt jedoch beispielsweise ein wcilvolles Zwischenprodukt für die Herstellung substituierter 3-Pyrazolidine, beispielsweise zur Herstellung der in der belgischen Patentschrift 700008 beschriebenen 3-Pyrazolidone dar, welche ihrerseits eine besondere Bedeutung als photographische Entwicklerverbindungen haben. Verfahren zur Herstellung von 3-Pyrazolidonen aus Tris(hydroxymethyl)-essigsäure sind bekannt und werden beispielsweise in den USA.-Patentschriften 2 772 282, 2 843 598 und 2 743 279 beschrieben.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure aufzufinden, das bei geringem Kostenaufwand hohe Ausbeuten an der Säure liefert.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das BakteriuTi »Flavobacterium oxydans« (ATCC Nr. 21 245) ein hervorragend wirksamer, oxydierend wirkender Mikroorganismus ist und Pentaerythrit unter aeroben Bedingungen in Tris(hydroxymethyl)-essigsäure zu überführen vermag.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigs;'.ure unter aeroben Bedingungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die mikrobiologische Oxydation unter Verwendung von Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) in einem wäßrigen, Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 3,0 und 9,5 bei einer Temperatur zwischen 20 und 37^CC durchführt.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können übliche, das Wachstum von Bakterien fördernde Nährmedien oder Nährböden verwendet werden.

Die Tatsache daß sich Pentaerythrit auf mikrobiologischem Wege zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydieren läßt, war insbesondere deshalb nicht zn erwarten, weil bisher keinerlei Anzeichen für eine Angreifbarkeit von Pentaerythrit durch oxydierend wirkende Organismen, speziell Essigsäurebakterien vorlagen. Im Gegenteil war seit längerer Zeit bekannt daß der Alkohol gegenüber einer biologischen Oxy dation beständig ist. Im übrigen hat es sich gezeigt daß die verschiedensten, oxydierend wirkenden Mikro Organismen der verschiedensten Gattungen, einschließ Hch Essigsäurebakterien, ζ. B. Bacillus, Saccharmyces Pseudonionas, Flavobacterium, Nocardia, Rhizopus

Acetobacter, Mycobacterium, Lactobacillus, Penicillium, Xanthamonas, Chromobacterium, Arthrobacter, Rhodospirillum und Helicostylum, nicht zur Herstellung von Säure aus Pentaerythrit geeignet sind. Insbesondere greifen z. B. Flavobacterium aquatile. Flavobacterium suaveolens, Flavobacterium devorans, Nocardia Carolina, Pseudomonas putida und Arthrobacter oxydans Pentaerythrit nicht oxydativ an. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht erstmals unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus auf mikrobiologischem Wege Pentaerythrit zu Tris-(hydroxymethyl)essigsäure zu oxydieren. Das Verfahren der Erfindung hat im Gegensatz zu den bisher bekannten Pentaerythrit-Oxydationsverfahren, bei denen die Tris(hydroxymethyl)essigsäure nur in äußerst geringen Ausbeuten erhalten wird, den Vorteil, daß es leicht durchführbar ist, und zwar auch im großtechnischen Maßstab und zu Ausbeuten an Tris-(hydroxymethyl)essigsäure führt, die mit den bisher bekannten Verfahren nicht erreicht wurden. Ein weiterer Vorteil gegenüber den bekannten Oxydation:.-verfahren besteht darin, daß das beanspruchte Verfahren in einer Stufe zu dem gewünschten Endprodukt führt und daß die Verwendung von teuren Platinkatalysatoren vermieden wird.

I η vorteilhafter Weise arbeitet man derart, daß man den zu oxydierenden Pentaerythrit zuerst in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtspro/.ent pro Liter Kulturmedium in das Gärmedium einträgt, worauf man portionsweise weitere Anteile der zu oxydierenden Verbindung zusetzt, bis deren Konzentration pro Liter Kulturmedium bis zu etwa 10. vorzugsweise etwa 6 Gewichtsprozent beträgt. Auf diese Weise erreicht man besonders hohe Ausbeuten an Tns(hydroxymethyl)essigsäure.

Fine lOgewichtsprozentige Lösung von Pentaerythrit kann bei einer Temperatur von etwa 30 C eine gesättigte Lösung im Nährmedium darstellen.

Als das Wachstum des Bakteriums fördernde Nährmedien und Energiequellen können übliche bekannte kohlenstoffhaltige Verbindungen verwendet werden, z. B. die üblichen bekannten Zucker- und Stärkeprodukte sowie Mischungen derselben, z. B. Essigsäure, Surrose, Glucose, Glycerin, Bernsteinsäure, Äthylenglykol und/oder Zitronensäure. Die Konzentration derselben soll ausreichen, um ein genügendes Wachstum der Mikroorganismen zu gewährleisten.

Zweckmäßig enthält das Fermentations- oder Gärmedium etwa 0,1 bis etwa 0,3 und vorzugsweise 0,2 Gewichtsprozent kohlenstoffhaltige Verbindungen. Im übrigen enthält das im Rahmen des Verfahrens der Erfindung verwendete Gärmedium, abgesehen von den angegebenen Bestandteilen, üblicherweise in Gärmedien verwendete Mineralsalze. Ferner kann das Gärmedium in vorteilhafter Weise übliche Stickstoff-, Phosphor- und/oder Schwefellieferanten sowie Spuren von Eisen-, Mangan- und/oder andere Spuren von Metallionen enthalten. Beispiele für geeignete Verbindungen mit derartigen Ionen sind Ammoniumnitrat, Kaliumdiphosphat, Eisen(II)-sulfat und Magnesiumsulfat. Zweckmäßig werden diese Verbindungen zunächst in Wasser aufgelöst, worauf die erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 7,2 bis etwa 7,6. eingestellt wird.

Gegebenenfalls lassen sich Ausbeute und Produktionsgeschwindigkeit an Tris(hydroxymethyl)essigsäure weiter dadurch steigern, daß man dem Gärmedium zusätzlich pro Liter etwa 0,1 bis etwa 0,3, vorzugsweise etwa 0,2 g, eines das Wachstum des Mikroorganismus stimulierenden Stoffes, beispielsweise einen Hefeextrakt, zusetzt Andere, das Wachstum des Mikroorganismus stimulierende Stoffe sind beispielsweise reine Vitaminmiscbungen, getrocknete und pulverisierte Maismaische sowie flüssige Mais· oder Getreidemaische.

Als Stickstofflieferant können die verschiedensten

ίο Stoffe, beispielsweise getrockneter Hefeextrakt, in einer Konzentration von z. B. etwa 1% verwendet werden. Bei dieser Konzentration liefert der Hefeextrakt auch noch andere Nährstoffe, z. B. Sulfat-, Phosphat- und verschiedene Metallionen.

Zu der angegebenen Gruppe von Nährstoffen gehören ferner beispielsweise Baumwollsaatmehl und Sojabohnenmehl. Weitere geeignete einfache Stickstofflieferanten sind beispielsweise Glutaminsäure, Glutamin, Aspartate, d. h. Salze der der Asparaginsäure, z. B. das Natriumsalz der Asparaginsäure, Harnstoff, Nitrate und Mischungen solcher Stoffe.

beispielsweise Mischungen aus Glutaminsäure und Asparagin.

Zur Förderung des Wachstums des beim Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismus werden somit übliche Kohlenhydrate und/oder andere übliche Kohlenstoffenergiequellen verwendet.

Bei dem zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um einen neuen Mikroorganismus, von dem Kulturen unter der Nummer ATCC 21 245 bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, USA, und dem Büro in Rockville, Maryland, USA, 12 301 Park Lawn Drive, erhältlich sind.

Der Mikroorganismus wurde in Rochester, N.Y., USA, nach einem speziellen Kulturverfahren aus dem Boden isoliert. Hierbei wurden 150 g Erde in 250 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung:

NährstofT

Pentaerythrit ..
(NH₄J₂SO₄

K₂HPO₄

MgSO₄-7H₂O

MnSO₄ 7H₂O
FeSO₄-7H₂O .

NaCl

CaCl-2H₂O ..

ZnSO₄ 7H₂O.
Hefeextrakt....

p. I Wa..»er

20,0
2.0
2.0
0.25
0,27
0,028
0,0006
0.001
0,0006
0,2

eingetragen und ohne Bewegung 2 Wochen lang bei einer Temperatur von etwa 30⁰C inkubiert. Hierauf wurden Teile der erhaltenen Kultur zum Impfen eines frischen, sterilen Kulturmediums verwendet. Dieses wurde erneut 1 Woche lang bei einer Temperatur von etwa 30⁰C inkubiert. Als zweckmäßig hat es sich dabei erwiesen, das Kulturmedium während der Inkubation, beispielsweise mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 400 U/Min., zu rühren.

Bei der Isolierung des Mikroorganismus wurde gefunden, daß dieser aus mindestens zwei Stämmen mit den im folgenden angegebenen Kultur- und phy-

1

siologischen Eigenschaften besteht Auf Grund dieser Eigenschaften läßt sich der Mikroorganismus identifizieren und von anderen bekannten Mikroorganisxnen unterscheiden. Aus den Mikroorganismen lassen sich spontan ähnliche, oxydierend wirke ade Mutanten entwickeln. Sie lassen sich bei dem als Fiavobacierium oxydans (ATCC Nr. 21 245) bezeichneten Mikroorganismus leicht nachweisen. Ferner lassen sich aus den neuen Mikroorganismen auch durch andere bekannte Maßnahmen, beispielsweise tiurcb Einwirkenlassen verschiedener mutagener Verbindungen, beispielsweise Äthylmethansulfonat, oder von UV-Strahlen Mutationen erzeugen.

Zwei der Stämme, im folgenden als Pe 25 und Pe 25 sm¹ bezeichnet, unterscheiden sich voneinander lediglich dadurch, daß der erstere, bei dem es sich um einen bevorzugten Stamm handelt, auf Pentaerythrit als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen und diesen metallisieren kann, während der letztere, ein anderer besonders vorteilhafter Stamm, eine Kohlenstoffquelle des später beschriebenen Typs an Stelle des Pentaerythrits benötigt. Die beiden Stämme unterscheiden sich ferner visuell voneinander dadurch, daß bei einem pH-Wert der Farbton eines Pentaerythrit enthaltenden Nährmediums verschieden ist sowie durch ihre Koloniengröße.

Der Mikroorganismus »Flavobacterium oxydans« (ATCC Nr. 21 245) besitzt die im folgenden angegebenen Kultur- und physiologischen Eigenschaften, auf Grund welcher er identifiziert und von anderen bekannten Mikroorganismen unterschieden werden kann:

Färbeeigenschaften Alter in Stunden

18 Gram(-)

168 Gram ( + ) und (-)

Nicht säurebeständig

Zellmorphologie

nach bis zu 7tägigem Wachstum auf einem Glucose-Hefeextrakt-Medium)

Form Stäbchen, 0,6 bis

0,7 μ χ 0,8 bis 1,0 μ; sehr oft in Paaren oder kurzen Ketten mit bis zu etwa 8 Mikroorganismen

Bewegungsvermögen .... nicht frei beweglich

Nicht sporenbildend
. Nicht verkapselt

Agar-Kolonien (Glucose-Hefeextrakt-Medium)

Alter 72 Stunden

Form rund

Erhöhung konvex

Oberfläche glatt

Rand ganzrandig

Farbstoffbildung zunächst grauweiß,

in 5 Tagen gelb werdend

843 *

Agar-Abstrich (Glucose-Hefeextrakt-Medium)

Alter 72 Stunden

Fonn fadenförmig

(Filiform)

Konsistenz butterartig

Farbbildung zunächst grauweiß,

hierauf nach 5 Tagen

gelb

Nährbrühe

Alter 7Tage

Oberflächen wachstum.. - kernes

Trübung geringfügig

Sediment kompakt

Menge spärlich

Gelatineansatz (Gelatin Stab) (Glucose-Hefeextrakt und 5 % Gelatine)

Alter 14 Tage

Verflüssigung keine

Wachstum reichliches Oberflächenwachstum

KartofTeln-Dextrose-K olonien

Alter 7 Tage

Wachstum keines

Hugh-Leifson-Kohlehydrat-Medium

Alter 14 Tage

Sauerstoffabhängigkeit streng aerob Glucose, geringfügig

sauer keine Gasbildung

Lactose, alkalisch keine Gasbildung

Sucrose, sauer keine Gasbildung

Glycerin, sauer keine Gasbildung

Mannitol, sauer keine Gasbildung

Wirkung auf Milch

Alter 14 Tage

Lackmus alkalisch, keine

Koagulation; keine Reaktion

Ulrich alkalisch unter

Reduktion

Loeffler-Blutserum

Alter 21 Tage

Wachstum keines

Sim-Medium

Alter 14 Tage

Selbständiges

Bewegungsvermögen keines

H₂S kein

Indol kein

Kligler-Eisen-Agar

Alter 14 Tage

H₂S kein

Dextrose und Lactose werden nicht fermentiert.

Alkalisches Ei-Medium

Alter 14 Tage

Keine proteolytische Aktivität,

Weitere SpezialUntersuchungen

A. Gutes Wachstum innerhalb von 4 Tagen in einem 5% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium; pH-Wert bleibt bei 7,5; kein Wachstum in einem 10% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium;

B. gutes Wachstum innerhalb von 7 Tagen in einem Citratmedium; Bildung eines schwachen Häutchens;

C. gutes Wachstum innerhalb \Όη 72 Stunden in einem 3% Natriumchlorid enthaltenden Glucose-Hefeextrakt; kein Wachstum, wenn der Natriumchloridgehalt auf 10% erhöht wird;

D. kein Wachstum innerhalb von 14 Tagen in einem Harnsäuremedium;

Methylrot negativ

Voges-Proskauer negativ

Stärke wird nicht hydrolysiert.
Aus Nitrat wird Nitrit erzeugt.
Cellulose wird nicht hydrolysiert.

Temperaturabhängigkeit

Alter 72 Stunden

4°C kein Wachstum

25° C schwaches Wachstum

30° C reichliches

Wachstum
37° C kein Wachstum

Geeignete Kohlenstofflieferanten

(a) beide Stämme wachsen auf Acetat, Succinat, Äthylenglykol, D-Ribitol, i-Erythrit, D-Xyiose;

(b) Für das Wachstum von Stamm Pe 25 allein: Pentaerythrit, Dipentaerythrit, 2 - Hydroxymethyl - 2 - methyl -1,3 - propandiol, 2 - Hydroxymethyl - 2 - äthyl -1,3 - propandiol, 2 - Hydroxymethyl-2-propyl-l,3-propandiol, 2^-Dimethyl-1,3 - propandiol, NeopentylalkohoL Monoacetin, D-Xylit, D-Arabit, Sorbit

Kein oder schwaches Wachstum auf:

(a) 2 - Desoxy - D - glucose, D - Glucoronolacton, Dulcitol, 2-{Hydroxymethyl)-2-nitrol- 1,3-propandiol. 2 - (Hydroxymethyl) - 2 - amino -1,3 - propandiol, 2 - (Hydroxymethyl) - 2,2 - diphenyl-1,3-propandiol, 2-Methyl-2-nitro- 1,3-propandiol.

Geeignete Stickstofflieferasten

Wachstum auf NO^", NH₄*, Asparagin, Glutamat, komplexen natürlichen Lieferanten, wie Baumwollsaatmehl, Hefeeartrakt, Caseinhydrolysat, verschiedenen Peptonen und Sojabohnenmehl.

Schwacher Stickstofflieferant; Harnstoff.
Zweckmäßig wird das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37° C und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 30° C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig hat es sich ferner erwiesen, das Gärmedium zu rühren, obwohl es auch in anderer geeigneter Weise, beispielsweise in Schüttelflaschen, bewegt werden kann.

ίο Die Wachstumsgeschwindigkeit des neuen Mikroorganismus läßt sich in unerwarteter Weise vorteilhaft durch Ändern der Temperatur- und Belüftungsbedingungen und/oder der Impfstoffmenge und des lmpfstoffzustands steuern. In nährstoffreichen Nährböden gestattet eine unter der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit liegende Wachstumsgeschwindigkeit der betreffenden Mikroorganismen eine maximale Induktion oxydierender Enzyme. Insbesondere läßt sich die Wachstumsgesch windigkeit der Gärmedien unter Rühren beispielsweise leicht dadurch steuern, daß man die Temperatur von etwa 30 auf etwa 22 bis etwa 24 und vorzugsweise auf etwa 23° C erniedrigt. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, das Gärmedium wenig zu belüften, d. h. pro Volumen Gärmedium und Minute nur etwa 0,10 bis etwa 0,14 und vorzugsweise 0,12 Volumina Luft zu verwenden.

Als vorteilhaft hat es sich ferner erwiesen, einen Impfstoff aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase, d. h. in der Zeit zwischen dem etwa 40- und 72stündigen Wachstum und vorzugsweise nach etwa 48stündigem Wachstum, zu verwenden.

Aus dem später folgenden Beispiel 6 ergibt sich die logarithmische Wachstumsphase des Mikroorganismus Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245). Bei dieser Altersstufe von Flavobacterium oxydans erfolgt die Induktion des Pentaerythritenzyms bis nahe an den maximalen Wert, so daß in der Regel etwa 50 bis zu etwa weniger als 100%, d. h. meistens bis zu etwa 97%, des Alkohols bei der Inkubation zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydiert werden. Das Auftreten von Tris(hydroxymethyl)essigsäure wird durch ein entsprechendes Verschwinden von Pentaerythrit, welcher daneben noch in äußerst geringer Menge durch Nebenreaktionen verlorengeht, begleitet. Während zunächst ein Anstieg des pH-Wertes des Nährrncdjurns von etwa 7,0 auf etwa 8.0 zu verzeichnen ist, sinkt dieser hierauf infolge der Bildung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure auf etwa 5,6 ab. Zweckmäßig hält man den pH-Wert des Nährmediums auf einem Wert von etwa 3,0 bis etwa 9,5, vorzugsweise auf einem Wert von etwa 6,0 bis etwa 8,0.

Die Kultur wächst in der Regel (lediglich) während der ersten 3 Tage der Inkubation und verbleibt hierauf in einer stationären Wachstumsphase. Während dieser

ss Zeit läuft jedoch die Oxydation weiter. Das auf diese Weise im Nlhrmedium oder im Nährboden gebildete Oxydationsprodukt, beispielsweise Trisfhydroxymethyl)essigsäure, kann mit einer geeigneten Base, beispielsweise Kaliumcarbonat oder Calcrumcaxbonat, neutralisiert werden.

Gibt man z. B. zu dem im Nährmedium bereits in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 3 Gewich sprozent vorhandenen Pentaerythrit portionsweise weiteren Pentaerythrit zu, bis dessen Konzentration im

6s Nährmedium insgesamt etwa 10 und vorzugsweise etwa 6 Gewichtsprozent beträgt, so lassen sich Ausbeuten bis zu 64 g/l (97% der theoretischen Ausbeute) erreichen.

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Zur Reindarstellung der Tris(hydroxymethyl)essigsäure, kann die gesamte Kulturbrühe, einschließlich der Mikroorganismen, zentrifugiert werden, wobei die Mikroorganismen entfernt werden. Hierauf kann die erhaltene Brühe durch Zugabe von beispielsweise Kaliumhydroxyd, Calc^:umhydroxyd oder Kalk auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert werden. Nach dem Neutralisieren wird die Brühe mit einem Ionenaustauschharz in Kontakt gebracht. Hierbei wird die Säure zunächst an das Ionenaustauschharz adsorbiert und hierauf mit einer wäßrigen Säurelösung eluiert. Zum Adsorbieren der Säuren eignen sich übliche stark basische Anionenaustaascherharze. Zum Eluieren der adsorbierten Säuren ist Ameisensäure besonders geeignet.

Die Tris(hydroxymethyl)essigsäure läßt sich aus der wäßrigen Lösung, beispielsweise durch Eindampfen der wäßrigen Lösung bis zur Trockne, isolieren. Die Säure kann gegebenenfalls, beispielsweise durch Umkristallisieren aus einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Benzol oder Isopropanol, oder einer Lösungsmittelmischung, beispielsweise einer Mischung aus Äthanol und Benzol, weiter gereinigt werden.

Da die biologische Oxydation von Kohlenstoffverbindungen in der Regel in einzelnen Stufen unter Bildung von Zwischenprodukten abläuft, wobei als Endprodukt CO₂ erhalten wird, kann ein anderes Gewinnungsverfahren zur Reindarstellung von Vorteil sein, wenn es notwendig ist, das Carbonat zu zersetzen, aus dem das CO₂ gebildet wird, welches durch die Austauschersäule perlt, wenn Ameisensäure zugesetzt wird.

In diesem Falle wird die vorher zentrifugierte Fermentationsbrühe durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Ameisensäure, auf einen pH-Wert von etwa 4 gebracht und 1 Stunde lang mit Stickstoff gespült Daraufhin wird der pH-Wert der Gärbrühe durch Zugabe einer Base, beispielsweise Kalium- oder Natriumhydroxyd, auf etwa 7 eingestellt. Hierauf wird die Gärbrühe erneut zentrifugiert und auf die lonenaustauschersaule aufgegeben.

Die Menge der in der Gärbrühe gebildeten Tris-(hydroxymethyl)essigsäure, läßt sich entweder durch vollständige Isolierung der Säure oder aber auf gaschromatographischem Wege in der später näher beschriebenen Weise ermitteln.

Während der einzelnen Verfahrensstufen können die Temperatur- und Druck bedingungen, abgesehen von den bereits angegebenen Werten, in üblicher bekannter Weise abgewandelt werden.

Das Verfahren der Erfindung kann in der verschiedensten Weise abgewandelt werden. So kann das Pentaerythrit beispielsweise dem Nährmedium einverleibt werden, nachdem zunächst die Inkubation der Mikroorganismen eingeleitet wurde. Andererseits können die Mikroorganismen auch einem das Pentaerythrit bereits enthaltenden Medium zugesetzt werden. Schließlich können die Mikroorganismen als Impfstoff, bestehend aus ganzen Zellen, Zellbruchstücken oder Zellextrakten, zugegeben werden, um ein Bakterienwachstum zu erreichen. Werden Zeilbruchstücke verwendet, so können diese nach den verschiedensten Verfahren, beispielsweise nach physikalischen oder chemischen Verfahren, z. B. durch Vibrationen, erzeugt worden sein.

Wird der Mikroorganismus Flavobacterium oxydans auf einem reichhaltigen unspezifischen Medium, beispielsweise einem Nahrmedium aus Hefeextrakt (1 %) und Glucose (1 %) oder einem der beschriebenen Säure erzeugenden Medien, d. h. auf einem Medium auf dem auch andere Kulturen wachsen und existieren können, gezüchtet, so kann er langsam seine Oxydationsfähigkeit verlieren. Zur Gewährleistung einei ausreichenden Wirksamkeit der Mikroorganismen, d. h. zur Erzielung hoher Ausbeuten an Tris(hydroxymethyl)essigsäure, können solchen Kulturen Säure produzierende Kolonien selekti j entnommen und aufbewahrt werden. Diese Kolonien lassen sich 3 bis 5 Tage, nachdem sie auf einen den pH-Wert anzeigenden und Pentaerythrit enthaltenden Nährboden aufgebracht wurden, leicht durch eine auf eine Säureproduktion hindeutende Färbung von keinen Säure produzierenden Stämmen, welche naturgemäß auch zu keiner, auf eine Säureproduktion hindeutenden Färbung führt, unterscheiden. Die abgetrennten Kolonien können in einer Lösung, die das Wachstum der Bakterien ermöglicht und die Kulturen enthalt, beispieisweise in einer physiologischen Kochsalzlösung, dispergiert und auf Nährboden, beispielsweise Agarflächen, ausgestrichen werden. Nach 2tägigem Wachstum bei einer Temperatur von etwa 30" C können die Kulturen bei verminderten Temperaturen über einige

Monate hinweg oder länger aufbewahrt werden, ohne daß ihre Oxydationsfähigkeit verlorengeht. Nach einem anderen Aufbewahrungs- und Konservierungsverfahren können die Kulturen z. B. aus einer wäßrigen Suspension, beispielsweise Magermilch, gefriergetrock-

net werden. Werden diese Kulturen unter Verschluß gehalten, bleiben sie für eine lange Zeit lebensfähig.

Für die Durchführung gaschromatographischer Bestimmungsverfahren lassen sich übliche bekannte Gaschromatographen mit einem thermischen Leitfähigkeitsdetektor verwenden. DieChromatographiersäule kann z. B. aus einem etwa 1,8 m langen, rostfreien Stahlrohr mit einem Außendurchmesser von etwa 3,2 mm bestehen. Die Packung der Säule kann z. B. aus kalzinierten Kieselguraggregaten mit einem Gehalt an 10% Silikonkautschuk bestehen.

Der Heliumfluß beträgt 30 ml/Min. Die Temperatur an der Einspritzöffnung kann z. B. 295" C betragen. während die Säulentemperatur auf 120 bis 265 C bei einer Temperatursteigerung von 30 C/Min. pro-

grammiert werden kann. Der thermische Leitfähigkeitsdetektor kann z. B. bei einer Temperatur von 300⁰C unter Verwendung eines Brückenstroms von 150 Milliampere betrieben werden.
Bei der Durchführung des Meßverfahrens wird zunächst 1 ml der Gärbrühe in einer Gefriertrocknungsvorrichtung zur Trockne »eingedampft«. Zu dem erhaltenen Rückstand werden dann 0,3 ml Chlortrimethylsilan, 0,3 ml 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan und 0,3 ml einer Lösung von Octadecan in Pyridin

(0,08 g Octadecan mit Pyridin auf 1 ml aufgefüllt) zugegeben. Nach 4stündigem Stehenlassen wird die Probe gaschromatographisch analysiert. Hierbei werden Einspritzvolumina von 1,4 bis 1,6 Mikroliter verwendet

Die Konzentration an Tris(hydroxymethyl)essigsäure in 1 ml Gärbrühe läßt sich wie folgt bestimmen: Verschiedene Mengen einer analysenreinen Tris(hydroxymethyl)essigsäure, nämlich 1 bis 40 mg, werden in ihre Trimethylsflylderivate übergeführt Die ein-

zelnen Proben werden hierauf in der beschriebenen Weise analysiert Wenn das Verhältnis des Peakbezirks des Trimethylsilylderivats zu dem Peakbezirk von Octadecan gegen die in der ieweilieen Probe

enthaltene Menge Tris(hydroxymethyl)essigsäure in Milligramm aufgetragen wird, erhält man eine Eichgerade.

Wird nun eine Probe der Gärbrühe in der beschriebenen Weise analysiert, so entspricht die Milligrammmenge Tris(hydroxymethyl)essigsäure in der Testprobe auf der Eichgeraden dem Verhältnis des Peakbezirks des Trimethylsilylderivats zum Peakbezirk des Octadecans.

Das Infrarotppektrum der durch mikrobiologische Oxydation hergestellten Tris(hydroxymethyi)essigsäure sowie das Massenspektrum ihres Trimethylsilylderivats sind mit den mit einer Prlbe der durch Platin katalysierte Oxydation von Pentaerythrit hergestellten Säure aufgenommenen Spektren identisch.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

In einer Reihe von 125 ml fassenden und mit jeweils einem rostfreien Stahlverschluß nach Morton ausgestatteten Erlenmeyerkolben wurden Gärungen durchgerührt. Die einzelnen Kolben enthielten jeweils 25 ml eines wäßrigen Nährmediums mit Essigsäure, 2 g/l eines Kohlenstofflieferanten, 10 g/l Hefeextrakt und 20 g/l Pentaerythrit. Die einzelnen Nährmedien wurden durch Zugabe von Kaliumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert und hierauf in einem Autoklav 15 Minuten lang bei einem Dampfdruck von 2,05 kg/cm² sterilisiert. Die in den einzelnen Kolben enthaltenen 25 ml Nährmedium wurden mittels einer öse mit jeweils etwa 0,75 mg (Trockengewicht) einer vorher 2 Tage lang auf einem schrägen Nährboden bei einer Temperatur von etwa 30⁰C gezüchteten Kultur angeimpft. Hierauf wurden die einzelnen Kolben bei einer Temperatur von 30 ± TC mit 400 U/Min auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bewegt. Von Zeit zu Zeit wurden aus der Gärbrühe Proben"entnommen und untersucht, wobei die in der folgenden Tabelle angegebenen Ergebnisse erhalten wurden.

Kolben Nr.

10

11

12

2tägiger

5.38

6,80
6,25
2,65
5,70
6,03
5,25
7,35
3,13
5,90
3,50
2,40

!de'.e Säuremenpe in	g/l nach
	7tägiger
4tägiger
Fermentation	10,27
	15,65
	11,42
	10,60
	11,08
	11,15
	11,07
	14,85
	12,05
	10,85
	11,28
	IUl

10.00
12,50
10,30
8,41
10,32
10,20
10.77
10,48
9,72
10,00
10,00
9,80

Beispiel 2

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß während der Inkubationsdauer an den in der folgenden Tabelle mit ⁺ bezeichneten Tagen schrittweise 250 mg Pentaerythrit und 200 mg Calciumcarbonat zugesetzt wurden. Es konnte eine erhöhte Ausbeute an Tris(hydroxymethyl)essigsäure im Vergleich zu den Ergebnissen des Beispiels 1 nach 7tägiger Fermentation festgestellt werden.

	'5	O	Gebildete Menge an
Zeit in Tagen	3 ⁺	Tris(hydroxymethyl)essigsäure
4⁺	in g/l
20 5 +	0
6 ⁺	13,2
7	19,1
11	22,3
35,5
45,0
64,0

Beispiel 3

Bei der Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure in einem kleinen Gärgefäß unter Rühren und automatischer Neutralisation mit Kaliumcarbonatiösung konnte eine Produktionssteigerung bis zu 97% der theoretischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure erreicht werden.

Die Gärung wurde in einem zylindrischen, aus Glas bestehenden Gärgefäß mit einer Kapazität von 650 ml, einem Durchmesser von 7 cm und einer Höhe von 14 cm durchgeführt. Das Rühren erfolgte mit einem 5 cm langen, magnetischen Rührstäbchen, welches mit einer Geschwindigkeit von 1200 U/Min umlief. Die Belüftungsgeschwindigkeit betrug 80 ml/Min. (0,12 vvm)*) bei einer Temperatur von 30⁰C. Die Schaumbildung wurde dadurch gesteuert, daß jeweils, wenn der Schaum einen Schaumfühler erreichte, automatisch ein übliches (unter der Handelsbezeichnung Antifoam C der Firma Dow Corning, Midland Michigan, vertriebenes) Heizmittel zugegeben wurde. Das Nährmedium entsprach dem Nährmedium des Beispiels 1. Das Beimpfen des Nährmediums erfolgte in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise.

An den durch ' in der folgenden Tabelle gekennzeichneten Tagen wurden 10 g festes Pentaerythrit zugegeben. Ab dem zweiten Tag erfolgte eine automatische Steuerung des pH-Wertes auf 7,0 ± 0,3 unter Zulauf einer l-m-K₂CO₃-Lösung.

In die Kolben Nr, 2 (nach 2 Tagen) und Nr. 8 (nach 4 Tagen) wurden jeweils 200 mg Calciumcarbonat eingefüllt

Zeit in Tagen	Gebildete Menge an Trisihydroxymethyrjessigsäure in g/l
0 2* 5⁺ 7	0 "8,8 34,7 54,3

*) = 0.12 Volumina Luft/Volumina Medium/Minute.

Beispiel 4

Der Einfluß einer Steuerung der Belüftungsgeschwindigkeit auf die Anhäufung von Tris(hydroxymethyl]pssigsäure in Gärgefäßen, beispielsweise in einen Rührer aufweisenden Gärgefäßen, ergibt sich aus folgenden Daten: (Die Züchtung der Kultur erfolgte 48 Stunden lang in einer dem Beispiel 3 entsprechenden Weise.)

Belüftungsgesch windigkeit
Volumina Luft/Volumen Nährmedium/Min.

0,06
0,12
0,25

Gebildete Menge an

Tris(hydroxymethyl)essigsäure

in g/l

2,2

8,8

Spur

Beispiel 5

In entsprechender Weise wie im Beispiel 3 ergibt sich der Einfluß der ursprünglichen Konzentration an Pentaerythrit auf die Anhäufung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure während des Gärvorgangs aus der folgenden Tabelle:

Pentaerythrit. %	Tris(hydroxymethyl)essigsäure, g/l
0,5	4,6
1,0	8,0
2,0	16,0
4,0	17,0
6,0	17,3
8,0	18,2
10,0	4,0

Beispiel 6

Nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurden aus bei einer Temperatur von 30° C inkubierten Kulturen zu bestimmten Zeiten Proben entnommen, in denen die entsprechenden Mengen Pentaerythrit und Tris(hydroxymethyl)essigsäure bestimmt wurden. Ferner wurde das Bakterientrockengewicht, d. h. das Wachstum der Mikroorganismen, bestimmt, indem

to das Absorptionsvermögen bei 650 ηΐμ gemessen und der hierbei erhaltene Wert mit dem Trockengewicht gegenüber der Absorption verglichen wurde.

Zeit ⁵ in Std.	Gebildete Menge Pentaerythrit in mg/ml	pH	Wachstum mg/ml	Gebildete Menge an Tris(hydroxy- methyl)essigsäure in mg/ml
O	20,0	7,0	0,0	0,0
°4 20	20,0	7,5	0,1	0,0
40	18,3	8,0	1,7	3,2
48	17,8	7,9	2,5	4,0
60	12,8	7,2	4,4	8,0
72	10,2	6,8	4,6	10,0
²⁵ 80	9,4	6,2	4,6	11,2
96	8,6	5,8	4,6	12,2
120	7,8	5,4	4,5	13,0

Die vorhergehenden Beispiele veranschaulichen die Ergebnisse, die mit einem vorzugsweise verwendeten Nährmedium, d. h. einem Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium, erhalten wurden. Wie bereits erwähnt, läßt sich jedoch eine entsprechende biologische Oxy-

dation erreichen, wenn der Pentaerythrit durch andere oxydierbare Kohlenstoffverbindungen ersetzt wird. An Stelle von Pentaerythrit können somit beispielsweise mit gleichem Erfolg Alkohole, wie Neopentylalkohol. Sorbit, Mannit und Aldehyde, wie Xylose,

Ribose u. dgl., verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(bydroxymethyl)essigsäure unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, da3 man die mikrobiologische Oxydation unter Verwendung von Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) in einem wäßrigen, Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 3,0 und 9,5 und einer Temperatur zwischen 20 und 37° C durchführt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation bei einer Temperatur zwischen 22 und 24° C durchführt

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das mindestens eine das Wachstum von Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) fördernde Kohlenstoffverbindung enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als das Wachstum des Bakteriums fördernde Kohlenstoffverbindung Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Glycerin, Glucose, Äthylenglykol und/oder Saccharose verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Nährmedium verwendet, das pro Liter Nährmedium etwa 5 bis etwa 100 g Pentaerythrit enthält.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium den Pentaerythrit zuerst in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtsprozent und danach portionsweise in einer solchen Menge zugibt, daß seine Konzentration, bezogen auf 1 1 Nährmedium, bis zu etwa 10 Gewichtsprozent beträgt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,10 bis etwa 0,14 Volumina Luft pio Volumen Nährmedium pro Minute durchführt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Oxydation Bakterien verwendet, die sich innerhalb ihrer 40- bis 72stündigen Wachstumsphase befinden.

so