DE3020851C2

DE3020851C2 - Adenosin-5'-Triphosphat

Info

Publication number: DE3020851C2
Application number: DE19803020851
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Hatanaka; Daizo Iwaki Fukushima Takeuchi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1979-06-04
Filing date: 1980-06-02
Publication date: 1982-04-15
Also published as: JPS55162996A; GB2052504B; DE3020851A1; JPS6359680B2; FR2458588B1; GB2052504A; FR2458588A1; SU1144619A3

Description

als Mikroorganismus Methylomor.as probus ATCC 20 563, Methylomonas methylovoar ATCC 21 369, Pseudomonas insueta ATCC 21 276, Pseudomonas methanolica ATCC 21 704, Pseudomonas methanica ATCC 21 439, Protaminobacter ruber ATCC 8 457, Protaminobacter candidus ATCC 21 372, Achromobacter methanolophila ATCC 21 275, Corynebacterium s. p. ATCC 21 232 oder Bacillus cereus ATCC14 579 züchtet,

das verwendete Züchtungsmedium als Substrat Methanol oder Methan, Methylamin, Formaldehyd und/oder Ameisensäure und
(NH₄J₂HPO₄, KH₂PO₄ und/oder K₂HPO₄ in einer Menge von 4 bis 35 g/l, berechnet als PO₄, enthält und

die Züchtung bei einem pH von 6,0 bis 8,0, einer Temperatur von 30 bis 40⁰C und einer Belüftungsmenge von 0,5 bis 4,01 Luft pro Liter Züchtungslösung und pro Minute durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'-Triphosphat durch Kultivieren eines Adenosin-5'-Triphosphat erzeugenden Mikroorganismus in einem Züchtungsmedium unter Erzeugung und Ansammlung von Adenosin-5'-Triphosphat im Züchtungsmedium und Gewinnung des Produktes. Bei diesem Verfahren werden u. a. bestimmte Mikroorganismen mit einer Assimilationsfähigkeit für Methanol (im folgenden auch Methanol-Assimilationsfähigkeit genannt), verwendet werden.

In neuerer Zeit hat Adenosin-5'-Triphosphat, nachfolgend auch als ATP bezeichnet, für medizinische Zwecke, als biochemisches Reagens etc. eine große Beachtung gefunden, da diese Substanz eine wichtige Rolle für den Energiestoffwechsel als hochenergetische Phosphatverbindung in dem lebenden Organismus spielt. Es wurden Untersuchungen über den Einsatz eines Pyruvatkinaseenzyms durchgeführt, das zur Regenerierung von Adenosin-5'-Diphosphat im ATP befähigt ist, sowie über das ATP-Regenerationssystem zur wirksamen Auswertung von ATP in einem Bioreaktor unter Einsatz von ATP. Dies bedingt eine kostengünstige Herstellung von ATP für die Erzeugung von biochemischen Substanzen und Coenzymen, wie Flavinadenindinucleotid, Nicotinamidadenindinucleotid etc.

Es sind mehrere Methoden zur Herstellung von ATP bekannt, beispielsweise die direkte Isolierung aus dem tierischen Muskel, eine organische chemische Synthese, die enzymatische Phosphorylierung von 5'-Adenylsäure sowie die Fermentation. Im Zusammenhang mit der zuletzt erwähnten Fermentationsmethode sind verschiedene Arbeitsweisen bekannt geworden, beispielsweise eine Methode, bei welcher ein Bakterium, das zu Brevibacterium ammoniagenes gehört, in einem Medium gezüchtet wird, das Adenin oder ein Derivat davon enthält, um auf diese Weise ATP zu erzeugen und anzureichern (JP-OS 17 634/1966), ferner eine Methode, bei welcher ein Mikroorganismus mit ATP-Erzeugungsvermögen in einem Medium gezüchtet wird, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, wobei ATP aus den Kulturen gesammelt wird (JP-OS 28 996/1974), sowie eine Methode, bei welcher eine Verbindung mit phenoüschen Hydroxylgruppe in das Medium zu einem Zeitpunkt eingebracht wird, bei welchem die ATP-Ausbeute im Medium das Maximum erreicht hat (JP-OS 6 490/1978).

Bei der Durchführung dieser herkömmlichen Methoden unter Einsatz der Fermentationstechnik wird jedoch die Fermentation in Gegenwart von Adenin oder einem Adeninderivat, wie Adenosin, im Züchtungsmedium durchgeführt, d. h., daß Adenin oder ein Derivat davon als Substrat verwendet wird, welches phosphoryfiert wird, wodurch ATP erzeugt und angereichert wird. Diese bekannten Methoden verwenden daher teures Adenin oder Derivate davon als Ausgangsmaterial, so daß diese Methoden nicht für großtechnische Zwecke geeignet sind.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'-Triphosphat zu schaffen, das aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit für eine großtechnische Durchführung geeignet ist.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die billige Herstellung von ATP unter Anwendung der Fermentationstechnik, wobei ATP in hohen Konzentrationen in dem Züchtungsmedium angereichert wird, wobei man auf eine Züchtungsmethode zurückgreifen kann, bei welcher die angegebenen ATF-erzeugenden Bakterien mit Methanol-Assimilationsfähigkeit in einem Medium gezüchtet werden, das Methanol oder eine bestimmte chemische Substanz, welche den gleichen Stoffwechselweg wie Methanol zeigt sowie eine gegebene Menge an bestimmten anorganischen Phosphaten als Substrat enthält. Bei diesem Verfahren entfällt der Einsatz des teureren Adenins oder von dessen Derivaten.

Methoden, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können; werden in folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Growth of Microbes as Protein Source by Cultivation with Methanolbased Media (japanische Offenlegungsschrift 28 988/1977), Production of Flavin Adenine Dinucleotide (J. Ferment. Technol., 55, 630 [1977]), Production of Vitamin B_]2 (Appl. Microbiol., 30,477 [1975]), Production of Lipid and Polysaccharide (Proceedings of the Conference of Japan Agricultural Chemical Society, 1978, Symposium Cl, Utilization of Microorganisms, 551 bis 556) und Production of Amino-Acids (oben erwähnte Proceedings), jedoch wurde noch nicht über die Verwendung dieser Arten von Bakterien zur Herstellung von ATP berichtet.

Erfindungsgemäß werden Methan, Methylamin, Formaldehyd und/oder Ameisensäure als Kohlenstoffquelle in dem Züchtungsmedium verwenden, wobei jedoch darauf hinzuweisen ist, daß eine zu hohe Konzentration an einer derartigen Substanz im Medium das Wachstum des Bakteriums nachteilig beeinflussen. Gewöhnlich werden diese Substanzen in einer Konzentration in dem Medium von 0,2 bis 4 Vol.-% im Falle von Methanol und

Methylamin und in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Vol.-% K>H PO4

im Falle von Ameisensäure oder Formaldehyd eingesetzt Bei Methan wird eine Konzentration entspre- (NH₄)₂SO₄
chend seiner Löslichkeit eingehalten. MgSO₄ · 7 H2O

Eine solche Kohlenstoffquelle kann insgesamt auf 5 FeSO₄ · 7 H2O

einmal zu Beginn der Züchtung dem Medium zugesetzt CaCb - 2 H2O

werden, jedoch wird ein besseres Ergebnis in der MnSO₄ · 4 H2O

Ausbeute von ATP erhallen, wenn man die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Medium anfänglich gering hält und die Kohlenstoffquelle anteilweise zugibt, wie sie im Medium mit fortschreitender Züchtung verbraucht wird.

In der Erfindung ist es auch wesentlich, ein bestimmtes anorganisches Phosphat im Medium in einer Konzentration von 4 bis 35 g/l, berechnet als PO₄, zusätzlich zu dieser Kohlenstoffquelle zu haben. Diese Konzentration an anorganischem Phosphat im Medium entspricht einem mehrfachen bis zu einem mehrmals lOfadien der in gewöhnlichen Züchtungsmedien für Bakterien und ist spezifisch für die Erfindung.

Wenn die Konzentration an anorganischem Phosphat, gemessen als PO₄, im Medium unter 4 g/l liegt, wird keine Zunahme in der Erzeugung von ATP erzielt, während beim Oberschreiten von 35 g/l das Wachstum des ATP-erzeugenden Bakteriums gehemmt wird, was die Ausbeute an ATP vermindert. Es sei darauf hingewiesen, daß ein anorganisches Phosphat in hoher Konzentration die Wirkung hat, das Austreten des gebildeten ATP aus dem Bakterienkörper und die Zersetzung durch Phosphatase zu verhindert.

Die in der Erfindung brauchbaren anorganischen Phosphate sind (Nm)₂HPO₄, KH₂PO₄ und K₂HPO₄. Die Zusammensetzung des Mediums in der Erfindung kann zusätzlich zur Kohlenstoffquelle und zum anorganischen Phosphat ein anorganisches Salz, wie ein Kalium-, Magnesium-, Eisen- oder Mangansalz und dergleichen, und in einigen Fällen ein anorganisches Salz eines Metalls, wie Zink, Kobalt, Molybdän und dergleichen enthalten sowie eine Stickstoffquelle, wie Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrat und dergleichen. Es ist auch möglich, ein oberflächenaktives Mittel, einen Entschäumer und andere Zusätze einzusetzen.

Das Folgende ist ein Beispiel der Zusammensetzung eines Mediums, wie es in der Erfindung verwendbar ist:

0,5 bis 2,5 g/l

(0,275 bis 1,37 g/l als PO₄)

0 bis 1,0 g/l

0,5 bis 5,0 g/l

0,05 bis 0,5 g/l

0 bis 0,2 g/l

Kohlenstoffquelle
(NH₄)₂HPO₄

KH₂PO₄

0,05bis2Vol.-%

5bis'45g/l

(3,5 bis 32 g/l als PO₄)

0,5 bis 2,5 g/l

(0,35 bis 1,75 g/l als PO₄)

45 Die Züchtung dieses ATP produzierenden Bakteriums in diesem Medium wird vorzugsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt: pH = 6,0 bis 8,0, Temperatur = 30 bis 40⁰C, und Belüftungsmenge 0,5 bis 4,0 V.V.M. (Vol. Luft [1]/Vol. Züchtungslösung [l/min]), unter Rühren bei 40 bis 600 UpM für eine Zeitspanne von 2 bis 9 Tagen. Zur Einstellung des pH-Wertes des Züchtungsmediums kann ein alkalisches Material, wie Ammoniak, ein saures Material, wie Schwefelsäure, ein Pufferungsmittel, wie Phosphatpuffer, oder es können andere geeignete Substanzen, wie Harnstoff, Calciumcarbonat und dergleichen eingesetzt werden. Bei Verwendung siner alkalischen Substanz wird Ammoniak am meisten bevorzugt, da es auch als Stickstoffquelle dienen kann

Wenn diese Bakterien unter den genannten Züchtungsbedingungen gemäß der Erfindung fermentiert werden, wird ATP im Medium in einer hohen Konzentration von 2 bis 12 g/l angesammelt. Nach Beendigung der Fermentation werden die Microben entfernt und das erzeugte ATP wird abgetrennt und in an sicn bekannter Weise gewonnen. Zum Beispiel wird nach Entfernen des Bakterienkörpers aus dem Züchtungsmedium (aus der Brühe) die überstehende Lösung einer Kombination von fraktionierter Fällung und Konzentrationsfällung mittels Absorption und Elution durch Anwendung von Aktivkohle und eines Anionenaustauscherharzes unterworfen und das erhaltene erzeugte ATP gewonnen.

Gemäß der Erfindung, wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich, wird ATP im Züchtungsmedium in der hohen Konzentration von über 2 g/l angesammelt, ohne daß man Adenin oder ein Derivat davon dem Medium zugeben müßte.

Im fo'.genden sind einige Beispiele für die Erfindung gezeigt, um diese näher zu erläutern.

Die Menge ATP, die in jedem Beispiel im Medium erzeugt wurde, wurde in der nachfolgend gezeigten Weise gemessen, wobei das Prinzip der Umsetzung zwischen ATP und Luciferin-Luciferase, ausgedrückt wie folgt, angewandt wurde:

50

1. Luciferin + Luciferase + ATP >■ Adenyl-Luciferin + Pyrophosphat

2. Adenyl-Luciferin

O₂

Adenyl-Oxylucifeiin

Die Intensität des Lichts im Wellenlängenbereich von 560 bis 580 nm der Fluoreszenz, erzeugt in der Reaktion 2) oben, wurde für eine gegebene Zeitspanne durch Anwendung eines CHEM-GLOW-Photometers J4-7441 (American Instrument Co.) gemessen, und das Integralprodukt wurde mit der Eichkurve einer vorher hergestellten bekannten ATP-Standardlösung verglichen, was die Bestimmung der Menge an in der Kulturlösung gebildetem ATP gestattete.

Beispiel 1

Ein Grundmedium wurde hergestellt, in dem folgende Substanzen aufgelöst wurden: 7,0 g (NH₄J₂HPO₄, 1,0 g KH₂PO₄, 1,0 g K₂HPO₄, 1,0 g MgSO₄ · 7 H₂O und 0,1 g FeSO₄ · 7 H₂O, und zwar in 1 1 Ionenaustauscherwasser. 100 ml dieses Grundmediums wurden in jeweils 300 ml Erlenmeyer-Kolben pipettiert und nach Sterilisierung

wurden weiterhin jeweils 1,6 g Methanol in jeden Kolben gegeben. Jedes der so hergestellten Medien wurde mit Methylomonas probus ATCC 20 563 beimpft, das vorher in einem Agar-Schräg-Medium dieser Zusammensetzung gezüchtet und eirer Schüttelkultur bei 30° C unterzogen war. Am 4. Tag nach dem Beginn der Züchtung waren 2,8 g/l ATP gebildet und hatten sich in der Kulturlösung angesammelt.

Ein Liter dieser Kulturlösung wurde 5 Minuten lang einer Behandlung bei 80⁰C unterzogen und nach Abkühlen zentrifugiert, um den Bakterienkörper abzutrennen. Die überstehende Lösung, mit 3 N-Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt, wurde weiter einer Behandlung mit Aktivkohle unterzogen, um ATP an die Aktivkohle zu adsorbieren. Das an der Aktivkohle adsorbierte ATP wurde mit einer 50%igen Alkohollösung, die 1,4% Ammoniak enthielt, eluiert Dieses Eluat wurde unter vermindertem Druck und bei tiefer Temperatur eingeengt, um überschüssigen Ammoniak zu entfernen, wobei der pH auf 8,0 eingestellt wurde.

Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von stark basischem Anionenaustauschharz Dowex 1-X2 (Cl-) geleitet, das vorher in die Cl-Form überführt worden war, wodurch ATP in der Säule adsorbiert wurde. Das Adsorbat wurde mit Ionenaustauscherwasser gewaschen und mit einer gemischten Lösung von Salzsäure und Natriumchlorid (eine 0,2 M NaCl-Lösung, gebildet durch Auflösen von HCl in einer 0,02 M HCl-Lösung vom pH 1,7) eluiert und die ATP-Fraktion wurde abgetrennt.

Dieses Eluat wurde mit Natriumhydroxid neutralisiert, durch eine Säule geschickt, die mit Aktivkohle gepackt war, und mit 15%igem Ammoniakwasser eluiert. Das erhaltene Eluat wurde unter Erhitzen zum Austreiben vom Ammoniak eingeengt. Durch Zugabe von Methanol zu dieser Konzentratlösung wurden 2,2 g an Kristallen des Natriumsalzes von ATP erhalten.

Beispiel 2

20 1 eines Mediums, das durch Auflösen von 7,0 g (NH₄J₂HPO, 1,0 g KH₂PO₄, 1,0 g K₂HPO₄, 2 g MgSO₄ ■ 7 H₂O und 0,2 g FeSO₄ · 7 H₂O und 0,2 ml des Entschäumungsmittels KS-66 in 1 1 Ionenaustauscherwasser hergestellt war, wurden in ein Fermentationsgefäß von 30 1 Fassungsvermögen gegeben und bei 12O⁰C unter einem Druck von 1,2 kg/cm² 30 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurde dieses Medium mit 200 ml Methanol versetzt und mit 2% einer Impfkultur (Methylomonas probus ATCC 20 563) beimpft, die mit dem gleichen Medium wie oben gezüchtet war, wobei sich eine Belüftung mit einer Menge von 101/201 (Flüssigkeitsmenge) pro Minute (0,5 VVM) unter Rühren bei 500 UpM bei 35⁰C anschloß. Die Belüftungsmenge wurde auf 20 1/20 l/min (1,0 VVM; mit fortschreitendem Wachstum des Bakteriums erhöht und die Züchtung für eine Gesamtzeit von 96 Stunden durchgeführt. Der pH des Mediums wurde automatisch auf 6,0 bis 7,2 mit Ammoniakwasser während der Züchtung eingesteuert, während der Methanolverbrauch durch Gaschromatographie gemessen wurde und Methanol automatisch so nachgefüllt wurde, daß seine Konzentration im Bereich zwischen 0,3 bis 2,0% blieb. 96 Stunden nach Beginn der Züchtung waren

50

55 5,3 g/l ATP erzeugt und in der Kulturlösung gesammeiL Das ATP in der Kulturlösung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen.

Beispiel 3

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH₄J₂HPO₄ im Medium auf 20 g/l erhöht wurde. Es wurden 12 g/l ATP 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt und in der Kulturlösung angesammelt Das ATP wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen.

Beispiel 4

Die Züchtung von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch 30 g/l (NH₄J₂HPO₄ im Medium verwendet wurden. Es wurden 7 g/l ATP in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt und angesammelt. ATP wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen.

Vergleichsbeispiel 1

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH₄J₂HPO₄ im Medium auf 3 g/l vermindert wurde. Es wurden nur 0,2 g/l ATP in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung in der Kulturlosung erzeugt.

Vergleichsbeispiel 2

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH₄J₂HPO₄ auf 50 g/l erhöht wurde. Es wurden nur 1,0 g/l ATP in der Züchtungslösung in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt.

Beispiel 5

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt, wobei die in der folgenden Tabelle gezeigten Stämme verwendet wurden. Die erhaltenen ATP-Ausbeuten sind ebenfalls in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle

Stamm	ATCC	21369	ATP-
	ATCC	21276	Aus-
	ATCC	21704	beute
	ATCC	21439	g/l
Methylomonas methylovora	ATCC	8457	3,5
Pseudomonas insueta	ATCC	?1372	3,1
Pseudomonas methanolica	ATCC	21232	3,6
Pseudomonas methanica	ATCC	14579	3,2
Protaminobacter ruber	ATCC	21275	2,7
Protaminobacter candidus			2,5
Corynebacterium s. p.		2,3
Bacillus cereus		2,2
Achromobacter		2,4
methanolophila

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'-Triphosphat durch Kultivieren eines Adenosin-5'-Triphosphat erzeugenden Mikroorganismus in einem Züchtungsniedium unter Erzeugung und Ansammlung von Adenosin-5'-Triphosphat im Züchtungsmedium und Gewinnung des Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß man