DE3020851A1

DE3020851A1 - Verfahren zur herstellung von adenosin-5'-triphosphat durch fermentation

Info

Publication number: DE3020851A1
Application number: DE19803020851
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Hatanaka; Daizo Takeuchi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1979-06-04
Filing date: 1980-06-02
Publication date: 1980-12-11
Also published as: JPS55162996A; SU1144619A3; GB2052504B; DE3020851C2; FR2458588B1; FR2458588A1; JPS6359680B2; GB2052504A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'-Triphosphat durch Fermentation, insbesondere nach einer Fermentationsmethode unter Verwendung von Mikroorganismen mit Assimilationsfähigkeit für Methanol (im folgenden auch Methanol-Assimilationsfähigkeit genannt).

Seit kurzem richtet sich steigendes Interesse auf die Verfügbarkeit von Adenosin-5'-Triphosphat (im folgenden auch ATP genannt) für medizinische Zwecke, als biochemisches Reagens und dergleichen, da diese Substanz eine wichtige Rolle für den Metabolismus von Energie als hochenergiehaltige Phosphatverbindung im lebenden Organismus spielt. Es wurden Studien über die Verwendung eines Pyruvatkinaseenzyms gemacht, das zur Regenerierung von Adenosin-5'-Diphosphat im ATP befähigt ist sowie über das ATP-Regenerationssystem zur wirksamen Auswertung von ATP in einem Bioreaktor unter Verwendung von ATP. Somit ist eine billige Versorgung mit ATP für die Erzeugung von biochemischen Substanzen und Coenzymen, wie Flavinadenindinucleotid,Nicotinamidadenindinucleotid usw. erforderlich.

Es sind mehrere Methoden zur Herstellung von ATP bekannt, wie die direkte Isolierung aus dem tierischen Muskel, die organisch-chemische Synthese, die enzymatische Phosphorylierung von 5'-Adenylsäure und die Fermentation. Bezüglich der zuletzt erwähnten Fermentationsmethode wurden verschiedene Techniken vorgeschlagen, einschließlich einer Methode, bei welcher ein Bakterium, das zu Brevibacterium ammoniagenes gehört, in einem Medium gezüchtet wird, welches Adenin oder ein Derivat davon enthält, um so ATP zu erzeugen und anzusammeln (japanische Patentpublikation 17634/1966), eine Methode, bei welcher ein Microorganismus mit ATP-Produktions-

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fähigkeit in einem Medium gezüchtet wird, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, und ATP aus den Kulturen gesammelt wird (japanische Patentpublikation 28996/1974), sowie eine Methode, bei welcher eine Verbindung mit einer phenolischen Hydroxylgruppe in das Medium zu einem Zeitpunkt gegeben wird, wo die ATP-Ausbeute im Medium das Maximum erreicht hat (japanische Offenlegungsschrift 6490/1978) .

Bei jeder dieser herkömmlichen Methoden unter Anwendung der Fermentationstechnik wird jedoch die Fermentation unter Gegenwart von Adenin oder einem Derivat davon, wie Adenosin, im Züchtungsmedium bewirkt, d.h., daß Adenin oder ein Derivat davon als Substrat verwendet wird, das phosphoryliert wird,wodurch ATP erzeugt und angesammelt wird. Die bekannten Methoden verwenden also teueres Adenin oder Derivate davon als Ausgangsmaterial und können daher kaum als industriell vorteilhafte Methoden bezeichnet werden.

Es wurde nun gefunden, daß zur billigen Herstellung von ATP unter Anwendung der Fermentationstechnik, wobei ATP in hoher Konzentration im Züchtungsmedium angesammelt wird, eine Züchtung angewandt werden kann, wobei ein ATP-erzeugendes Bakterium mit Methanol-Assimilationsfähigkeit in einem Medium gezüchtet wird, das Methanol oder eine chemische Substanz, welche den gleichen metabolischen Weg wie Methanol zeigt, sowie eine gegebene Menge an anorganischen Phosphaten als Substrat enthält, anstatt des teueren Adenins oder dessen Derivaten.

Hauptziel der Erfindung ist daher ein Verfahren, das zur Erzeugung von ATP in industriellem Umfang auf vorteilhafte Weise durch Fermentation befähigt ist. Weitere Ziele und Vorteile werden aus der folgenden ins Einzelne gehen-

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den Beschreibung ersichtlich.

Der wesentliche Zug der Erfindung liegt in der Auswahl eines Microorganismus, der zur Assiitiilierung von Methanol unter Erzeugung von ATP befähigt ist, und der Züchtung solcher ATP-produzierenden Microben in einem Medium, das als Substrat Methanol enthält oder eine chemische Substanz, welche den gleichen metabolischen Weg wie Methanol zeigt, sowie ein anorganisches Phosphat in einer Menge von 4 bis 35 g/l,berechnet als Phosphorsäurerest PO., wodurch ATP im Medium erzeugt und angesammelt wird.

Der Ausdruck "chemische Substanz, welche den gleichen metabolischen Weg wie Methanol zeigt", wie er hier benutzt wird, bedeutet Substanzen, die über den gleichen metabolischen Weg wie Methanol eingesetzt werden können, wie Methylamin, Formaldehyd, Ameisensäure und Methan.

Im nachfolgenden sind Beispiele von ATP-erzeugenden Bakterien aufgeführt, die Methanol-Assimilierungsfähigkeit haben und in der Erfindung benutzt werden können: Methylomonas probus FERM-P 3193 (entsprechend ATCC 20563) und Methylomonas methylovora ATCC 21369, die zum Genus Methylomonas gehören; Pseudomonas methylotropha NCIB 10 508, Pseudomonas rosea NCIB 10597, Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanolica ATCC 21704 und Pseudomonas methanica ATCC 21439, welche zum Genus Pseudomonasgehören; Methanomonas methanooxidans NRRLB 34 51, der zum Genus Methanomonas gehört; Protaminobacter ruber ATCC 8457 und Protaminobacter candidus ATCC 21372, die zum Genus Protaminobacter gehören; Achromobacter methanolophila ATCC 21275, das zur Genus Achromobacter gehört; Corynebacterium s.p. ATCC 21232, das 7usr. Genus Corynebacterium gehört; Kyphomicrobium variabile NCIB 10517, das zum Genus Hyphomicrobium

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gehört; Microcyclus polyitiorphum NCIB 10516, das zum Genus Microcyclus gehört; Bacillus cereus ATCC 14579, das zum Genus Bacillus gehört.

Als Verfahrensweise zur Erzeugung der brauchbaren Substanzen durch Anwendung der oben genannten Arten von Bakterien sind die folgenden Berichte verfügbar: Growth of Microbes as Protein Source by Cultivation with Methanolbased Media (japanische Offenlegungsschrift 28 988/1977), Production of Flavin Adenine Dinucleotide (J. Ferment. Technol. 55, 630 (1977)), Production of Vitamin B₁₀ (Appl. Microbiol. 30, 477 (1975), Production of Lipid and Polysaccharide. (Proceedings of the Conference of Japan Agricultural Chemical Society, 1978, Symposium Cl, Utilization of Microorganisms, 551 bis 556) und Productionof Amino-Acids (oben erwähnte Proceedings), jedoch wurde noch nicht über die Verwendung dieser Arten von Bakterien zur Herstellung von ATP berichtet.

In der vorliegenden Erfindung wird diese Art von Bakterien in einem Medium gezüchtet, das Methanol oder eine chemische Substanz, die den gleichen metabolischen Weg wie Methanol zeigt, enthält, sowie ein anorganisches Phosphat in einer Menge von 4 bis 35 g/1, berechnet als PO₄. Methanol oder die erwähnte chemische Substanz werden als Kohlenstoffquelle im Medium verwendet, jedoch sei darauf hingewiesen, daß eine zu hohe Konzentration an einer solchen Substanz im Medium das Wachstum des Bakteriums nachteilig beeinflußt. Bezüglich der Konzentration einer solchen Substanz im Medium sei gewöhnlich ein Bereich von 0,2 bis 4 Vol.-% im Falle von Methanol und Methylamin und ein Bereich von 0,01 bis 0,1 Vol.-% im Falle von Ameisensäure oder Formaldehyd empfohlen. Bei Methan wird eine Konzentration entsprechend seiner Löslichkeit angewandt.

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Eine solche Kohlenstoffquelle kann insgesamt auf einmal zu Beginn der Züchtung dem Medium zugesetzt werden, jedoch wird ein besseres Ergebnis in der Ausbeute von ATP erhalten, wenn man die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Medium anfänglich gering hält und die Kohlenstoffquelle anteilweise zugibt,wie sie im Medium mit fortschreitender Züchtung verbraucht wird.

In der Erfindung ist es auch wesentlich, ein anorganisches Phosphat im Medium in einer Konzentration von 4 bis 35 g/l, berechnet als PO., zusätzlich zu dieser Kohlenstoffquelle zu haben. Diese Konzentration an anorganischem Phosphat im Medium entspricht einem mehrfachen bis zu einem mehrmals 10-fachen der in gewöhnlichen Züchtungsmedien für Bakterien und ist spezifisch für die Erfindung.

Wenn die Konzentration an anorganischem Phosphat, gemessen als PO., im Medium unter 4g/l liegt, wird keine Zunahme in der Erzeugung von ATP erzielt, während beim Überschreiten von 35 g/l das Wachstum des ATP-erzeugenden Bakteriums gehemmt wird, was die Ausbeute an ATP vermindert. Es sei darauf hingewiesen, daß ein anorganisches Phosphat in hoher Konzentration die Wirkung hat, das Austreten des gebildeten ATP aus dem Bakterienkörper und die Zersetzung durch Phosphatase zu verhindern.

Die in der Erfindung brauchbaren anorganischen Phosphate sind von der Art, wie sie gewöhnlich für Fermentationsmedien eingesetzt werden, und dazu gehören beispielsweise -(NH.) „HPO., KH„PO. und K₂HPO.. Die Zusammensetzung des Mediums in der Erfindung kann zusätzlich zur Kohlenstoffquelle und zum anorganischen Phosphat ein anorganisches Salz, wie ein Kalium-, Magnesium-, Eisen- oder Mangansalz und dergleichen, und in einigen Fällen ein anorganisches Salz eines Metalles, wie Zink,Kobalt, Molybdän und derglei-

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chen enthalten, sowie eine Stickstoffquelle, wie Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrat und dergleichen. Es ist auch möglich,ein oberflächenaktives Mittel, einen Entschäumer und andere Zusätze einzusetzen.

Das Folgende ist ein Beispiel der Zusammensetzung eines Mediums, wie es in der Erfindung verwendbar ist:

Kohlenstoffquelle 0,05 bis 2 Vol.-%

(NH.),HPO. 5 bis 45 g/l (3,5 bis 32 g/l

als PO₄)

KH PO. 0,5 bis 2,5 g/l (0,35 bis 1,75 g/l

als PO₄)

K_HPO. 0,5 bis 2,5 g/l (0,275 bis 1,37 g/l

als PO₄)

₄J₂SO₄ 0 bis 1,0 g/l

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 bis 5,0 g/l

FeSO₄ " 7H₂O 0,05 bis 0,5 g/l

CaCl₂ - 2H₂O 0 bis 0,2 g/l

MnSO₄ ■ 4H₂O 0 bis 0,2 g/l

Die Züchtung dieses ATP produzierenden Bakteriums in diesem Medium wird vorzugsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt: pH = 5,8 bis 9,0, vorzugsweise 6,0 bis 8,0, Temperatur = 15 bis 50⁰C, vorzugsweise 30 bis 40⁰C, und Belüftungsmenge 0,5 bis 4,0 V.V.M. (Vol. Luft (1)/Vol. Züchtungslösung' (l/min)), unter Rühren bei 40 bis 600 Upm für eine Zeitspanne von 2 bis 9 Tagen. Zur Einstellung des pH-Wertes des Züchtungsmediums kann ein alkalisches Material, wie Ammoniak, ein saueres Material, wie Schwefelsäure, ein Pufferungsmittel, wie Phosphatpuffer, oder es können andere geeignete Substanzen, wie Harnstoff, Calciumcarbonat und dergleichen eingesetzt werden. Bei Verwendung einer alkalischen Substanz wird Ammoniak am meisten bevorzugt, da es auch als Stickstoffquelle dienen kann.

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Wenn diese Bakerien unter den genannten Züchtungsbedingungen gemäß der Erfindung fermentiert werden, wird ATP im Medium in einer hohen Konzentration von 2 bis 12 g/l angesammelt. Nach Beendigung der Fermentation werden die Microben entfernt und das erzeugte ATP wird abgetrennt und in an sich bekannter Weise gewonnen. Zum Beispiel wird nach Entfernen des Bakterienkörpers aus dem Züchtungsmedium (aus der Brühe) die überstehende Lösung einer Kombination von fraktionierter Fällung und Konzentrationsfällung mittels Absorption und Elution durch Anwendung von Aktivkohle und eines Anionenaustauscherharzes unterworfen und das erhaltene erzeugte ATP gewonnen.

Gemäß der Erfindung, wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich, wird ATP im Züchtungsmedium in der hohen Konzentration von über 2g/l angesammelt, ohne daß man Adenin oder ein Derivat davon dem Medium zugeben müßte.

Im folgenden sind einige Beispiele für die Erfindung gezeigt, um diese näher zu erläutern.

Die Menge ATP, die in jedem Beispiel im Medium erzeugt wurde, wurde in der nachfolgend gezeigten Weise gemessen, wobei das Prinzip der Umsetzung zwischen ATP und Luciferin-Luciferase, ausgedrückt wie folgt,angewandt wurde:

M ^{2 +}

1. Luciferin + Luciferase + ATP —2 ^- Adenyl-Luci-

ferin + Pyrophosphat

°2v

2. Adenyl-Luciferin —=^ Adenyl-Oxyluciferin

Die Intensität des Lichts im Wellenlängenbereich von bis 580 nm der Fluoreszenz, erzeugt in der Reaktion 2)

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oben, wurde für eine gegebene Zeitspanne durch Anwendung eines CHEM-GLOW-Photometers J4-7441 (American Instrument Co.) gemessen, und das Integralprodukt wurde mit der Eichkurve einer vorher hergestellten bekannten ATP-Standardlösung verglichen, was die Bestimmung der Menge an in der Kulturlösung gebildetem ATP gestattete.

Beispiel 1

Ein Grundmedium wurde hergestellt, in dem folgende Substanzen aufgelöst wurden: 7,0 g (NH₄J₂HPO₄, 1,0 g KH PO., 1,0 g K₃HPO₄, 1,0 g MgSO₄ · 7H₂O und 0,1 g FeSO₄ - VH₃O, und zwar in 1 1 Ionenaustauscherwasser. 100 ml dieses Grundmediums wurden in jeweils 300 ml Erlenmeyer-Kolben pipetiert und nach Sterilisierung wurden weiterhin jeweils 1,6 g Methanol in jeden Kolben gegeben. Jedes der so hergestellten Medien wurde mit Methylomonas probus FERM-P 3193 beimpft, das vorher in einem Agar-Schräg-Medium dieser Zusammensetzung gezüchtet und einer Schüttelkultur bei 30⁰C unterzogen war. Am 4. Tag nach dem Beginn der Züchtung waren 2,8 g/l ATP gebildet und hatten sich in der Kulturlösung angesammelt.

Ein Liter dieser Kulturlösung wurde 5 Minuten lang einer Behandlung bei 8O⁰C unterzogen und nach Abkühlen zentrifugiert, um den Bakterienkörper abzutrennen. Die überstehende Lösung, mit 3N Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt, wurde weiter einer Behandlung mit Aktivkohle unterzogen, um ATP an Aktivkohle zu adsorbieren. Das an der Aktivkohle adsorbierte ATP wurde mit einer 50 %igen Alkohollösung, die 1,4 % Ammoniak enthielt, eluiert. Dieses Eluat wurde unter vermindertem Druck und bei tiefer Temperatur eingeengt, um überschüssigen Ammoniak zu entfernen, wobei der pH auf 8,0 eingestellt wurde.

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Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von stark basischem Anionenaustauschharz Dowex (Warenzeichen) 1-X2 (Cl ) geleitet, das vorher in die Cl-Form überführt worden war, wodurch ATP in der Säule adsorbiert wurde. Das Adsorbat wurde mit Ionenaustauscherwasser gewaschen und mit einer gemischten Lösung von Salzsäure und Natriumchlorid (eine 0,2 M NaCl-Lösung, gebildet durch Auflösen von HCl in einer 0,02 M HCl-Lösung vom pH 1,7) eluiert und die ATP-Fraktion wurde abgetrennt.

Dieses Eluat wurde mit Natriumhydroxid neutralisiert, durch eine Säule geschickt, die mit Aktivkohle gepackt war, und mit 15 %igem Ammoniakwasser eluiert. Das erhaltene Eluat wurde unter Erhitzen zum Austreiben vom Ammoniak eingeengt. Durch Zugabe von Methanol zu dieser Konzentratlösung wurden 2,2 g an Kristallen des Natriumsalzes von ATP erhalten.

Beispiel 2

20 1 eines Mediums, das durch Auflösen von 7,0 g (NH.)_HPO, 1,0 g KH₂PO₄, 1,0 gK₂HPO₄, 2 g MgSO₄ · 7H₂O und 0,2 g FeSO₄ · 7H₂O und 0,2 ml des Entschäumungsmittels KS-66 in 1 1 Ionenaustauscherwasser hergestellt war, wurden in ein Fermentationsgefäß von 30 1 Fassungsvermögen gegeben und bei 120⁰C unter einem Druck von 1,2 kg/cm² 30 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurde dieses Medium mit 200 ml Methanol versetzt und mit 2 % einer Impfkultur (Methylomonas probus FERM-P 3193) be impft, die mit dem gleichen Medium wie oben gezüchtet war, wobei sich eine Belüftung mit einer Menge von 10 1/20 1 (Flüssigkeitsmenge) pro Minute (0,5 WM) unter Rühren bei 500 Upm bei 35⁰C anschloß. Die Belüftungsmenge wurde auf 20 1/20 l/min (1,0 WM) mit fortschreitendem V7achstum des Bakteriums

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erhöht und die Züchtung für eine Gesamtzeit von 96 Stunden durchgeführt. Der pH des Mediums wurde automatisch auf 6,0 bis 7,2 mit Ammoniakwasser während der Züchtung eingesteuert, während der Methanolverbrauch durch Gaschromatographie gemessen wurde und Methanol automatisch so nachgefüllt wurde, daß seine Konzentration im Bereich zwischen 0,3 bis 2,0 % blieb. 96 Stunden nach Beginn der Züchtung waren 5,3 g/l ATP erzeugt und in der Kulturlösung gesammelt. Das ATP in der Kulturlösung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen.

Beispiel 3

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben,durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH.)„HPO. im Medium auf 20 g/l erhöht wurde. Es wurden 12 g/l ATP 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt und in der Kulturlösung angesammelt. Das ATP wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen.

Beispiel 4

Die Züchtung von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch 30 g/l (NH.)„HPO. im Medium verwendet wurden. Es wurden 7 g/l ATP in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt und angesammelt. ATP wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen.

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Vergleichsbeispiel 1

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH.)„HPO. im Medium auf 3 g/l vermindert wurde. Es wurden nur 0,2 g/l ATP in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung in der Kulturlösung erzeugt.

Vergleichsbeispiel 2

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge an (NH.J₃HPO₄ auf 50 g/l erhöht wurde. Es wurden nur 1,0 g/l ATP in der Züchtungslösung in 96 Stunden nach Beginn der Züchtung erzeugt.

Beispiel 5

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt, wobei die in der folgenden Tabelle gezeigten Stämme verwendet wurden. Die erhaltenen ATP-Ausbeuten sind ebenfalls in der folgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle

Stamm

Methylomonas methylovora Pseudomonas methylotropha Pseudomonas rosea Pseudomonas insueta Pseudomonas methanolica Pseudomonas methanica Protaminobacter ruber Protaminobacter candidus Corynebacterium s.p. Bacillus cereus Microcyclus polymorphum Hyphomicrobium variabile Achromobacter methanolophila

	21369	ATP-Ausbeute g/i
ATCC	10508	3,5
NCIB	10597	4,5
NCIB	21276	2,8
ATCC	21704	3,1
ATCC	21439	3,6
ATCC	8457	3,2
ATCC	21372	2,7
ATCC	21232	2,5
ATCC	14579	2,3
ATCC	10516	2,2
NCIB	10517	2,1
NCIB	21275	2,2
ATCC	2,4

.JT

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Claims

MlILLKH-IiOHIO · I)KI7IMiI. · f- CIH)K · II KHTEL PAT K N ΪΛ N WA LTE O Π O Π Q C Ι DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALTVON 1927-1975) DH. PAUL OHJ! EL. DIPL.-CHEM. DH ALI RhD SCHON. DIPL-CHEM. WhRNLR HLHIKL. DIPL.-PHYS. K 1477z2. Juni 1980 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 9-1 Koridome-cho 1-chome, Nihonbashi, Chuo-ku, Tokyo, Japan Verfahrer zur Herstellung von Adenosin-5'-Triphosphat durch Fermentation Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'--Triphosphat durch Kultivierung eines Adenosin-5'-Triphosphat-erzeugenden Bakteriums in einem Züchtungsmedium unter Erzeugung und Ansammlung von Adenosin-5'-Triphosphat im Züchtungsmedium und Gewinnung des Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß als Adenosin-5'-Triphosphaterzeugendes Bakterium ein Bakterium mit Assimilationsfähigkeit für Methanol verwendet wird, das zu einer der folgenden Genus von Bakterien gehört: Genus Methylomonas, Pseudomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Achromobacter, Corynebacterium, Hyphomicrobium, Microcyclus

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B MÜNCHt.N 86. SIF-BLRTSTR. 4 · POB BCO720 · KADEL: MUEbOPAT · TEL. (089) 474005 · TELECOPIER XKROX 400 · TELEX 5-24285

0FH6INAL INSPECTED

und Bacillus, und das Züchtungsmedium als Substrat Methanol oder eine chemische Substanz enthält, die den gleichen metabolischen Weg zeigt wie Methanol, sowie ein anorganisches Phosphat in einer Menge von 4 bis 35 g/l, berechnet als Phosphorsäurerest PO..

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chemische Substanz mit dem gleichen metabolischen Weg wie Methanol Methan, Methylamin, Formaldehyd und/oder Ameisensäure verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Phosphat (NHJ₂HPO₄, KH-PO.
und/oder K„HPO. verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einem pH von
6,0 bis 8,0, einer Temperatur von 30 bis 40⁰C und
einer Belüftungsmenge von 0,5 bis 4,0 Vol. Luft

(1) pro Vol. Züchtungslösung (1) pro Minute
durchgeführt wird,

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