DE1792724C3

DE1792724C3 - Verwendung eines Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamidadenin-dinucleotid

Info

Publication number: DE1792724C3
Application number: DE1792724A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-07-29
Filing date: 1967-07-28
Publication date: 1974-03-14
Also published as: DE1642710C3; US3705081A; FR1552856A; DE1642710A1; DE1792724B2; DE1792724A1; GB1165809A; DE1642710B2

Description

Die Erfindung besteht in der Verwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem wäßrigen Pantothensäure, /i-Alanin oder Coenzym A enthaltendem Nährmedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid.

Es ist bereits bekannt, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem Pantothensäure, /J-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Nährmediurn bei üblichen Bedingungen zu züchten (siehe z. B. die französischen Patentschriften 1 395 940 und 1 439 879). Bisher wurde diese Fermentation zur Herstellung von 5'-Xanthylsäure bzw. von 5'-Purinnucleotiden auf biotechnischem Wege angewendet. Die Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus einem solchen Fermentationsmedium ist bisher nicht vorgeschlagen worden.

Ein Verfahren zur Herstellung von Codehydrase I mit hoher Reinheit aus Hefe wird in der schweizerischen Patentschrift 408 841 vorgeschlagen. Dieses Verfahren trägt den Charakter eines Reinigungsverfahrens und ist dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige, Codehydrase I enthaltende Lösung, die durch Extraktion von Hefe erhalten wurde, durch ein schwach-basisches Anionenaustauscherharz in der Salzfoirm geschickt, wodurch eine farblose, Codehydrase I enthaltende Lösung erhalten wird, daß die Lösung zu einem pH von 2 bis 3 angesäuert, die entstehende Lösung durch ein stark saures Kationenaustauscherharz mit Sulfonsäuregruppen als aktiven Gruppen in der Wasserstofform geschickt, die Harzschicht mit einem sauren Puffer mit einem pH von 2 bis 3 gewaschen und die adsorbierte Codehydrase I mit einem schwach-sauren oder neutralen Puffer mit einem pH von 4 bis 7 eluiert und die Codehydrase I aus dem Hluat gewonnen wird.

Nach diesem Verfahren wird ein weißes Pulver mit einer Reinheit von 80 bis 90% erhalten.

Nicotinamid-adenin-dinucleotid findet sich in Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien usw. Ein Verfahren zur Gewinnung dieser Substanzen durch Extraktion von Hefezellen und Reinigung derselben ist bekannt. Nicotinamid-adenin-dinucleotid spielt bei biochemischen Reaktionen eine wichtige Rolle.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß, wenn Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem Pantothensäure, ^-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Fermentationsmedium aerob bei üblichen Bedingungen gezüchtet wird, Nicotinamid-adenindinucleotid in der Fermentationsflüssigkeit erhalten wird, so daß die Verwendung eines solchen Fermentationsmediums zur Gewinnung von extrazellulärem Nicotinamid-adenin-dinucleotid geeignet ist.

Das Fermentationsmedium besteht entweder aus einem synthetischen oder einem natürlichen Nährmedium, das die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des Brevibacterium arnmoniagenes ATCC 6 872 enthält.

Ein solches Fermentationsmedium enthält gewöhnlich eine Kohlenstoffquelle, wie Kohlehydrate, sowie andere einschlägig bekannte Nährstoffe, z. B. eine Stickstoffquelie, anorganische Verbindungen und ähnliche, die von dem verwendeten Mikroorganismus nutzbar gemacht werden.

Die Kohlehydrate, die verwendet werden können, sind z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melasse u.dgl. Kleine Mengen anderer geeigneter Kohlenstoffquellen, wie GIy-

cerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren. Kohlenwasserstoffe usw., können bei der Fermentation zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Mischungen von zwei oder mehreren verwendet wer-

den, und jede geringe Menge von anderen Kohlenstoffquellen kann auch einzeln oder in Mischungen von zwei oder mehreren vorhanden sein.

Die anorganischen Verbindungen, die im Fermentationsinediuni gemäß der vorliegenden Erfindung

as verwendet werden können, sind anorganische Phosphate, z. B. Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat usw. und andere anorganische Stoffe, wie Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid usw.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw. oder eine oder mehr als eine Aminosäure im Gemisch miteinander, oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Ciiseinhydrolysate, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt

usw. Diese Substanzen können auch verwendet werden, entweder einzeln oder in Verbindung von zwei oder mehreren. Brevibacterium ammoniagens ATCC 6872 benötigt Biotin zum Wachstum.

Pantothensäure, /S-Alanin oder Coenzym A können dem Medium als solche oder in Form geeigneter Salze derselben zugesetzt oder in Form natürlich vorkommender Substanzen, welche diese Verbindungen enthalten, zugeführt werden. Vorteilhafterweise wird Pantothensäure dem Fermentationsmedium in einer Menge von ungefähr 0,1 bis 20 mg/1 zugesetzt; /J-Alanin in einer Menge von etwa 0,3 bis 30 mg/1 und Coenzym A in einer Menge von etwa 1 bis 50 mg/1. Wenn die Verbindungen kombiniert verwendet werden, ist die Menge jeder zugesetzten Verbindung proportional kleiner und hängt von der jeweiligen Kombination ab.

Medien der vorgenannten Art sind in den französischen Patentschriften 1439 879 und 1395940 bereits beschrieben.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur, durch Rühren einer submersen Kultur bei einer InkubatJonstemperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem bevorzugten pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt.

Tn den genannten französischen Patentschriften sind auch solche Fermentationsbedingungen bereits beschrieben.
Man findet bemerkenswert große Mengen von

Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Fcrmentalionsllüssigkeit angereichert.

Andere Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen können verwendet werden, aber mit geringerer Ausbeute.

Nach Abschluß der Fermentation kann das Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus der Fermentations-Hüssigkeit auf übliche Weise abgetrennt werden, wie z. B. durch Behandlung mit lonenaustauscherharz, durch Fällung mit Metallsalzen, Extraktionsmethoden, herkömmliche Adsorptionsmethoden, Chromatographie u. dgl.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern. Die Angaben beziehen sich, wenn nichts anderes vermerkt ist, auf Gewichtsprozent.

Beispiel

Brevibacteriuim ammoniagenes ATCC 6 872 wird als Einsaatbakterium verwendet. Es wurde hierzu bei 30° C 24 Stunden lang in einem Medium, das 2»/» Glucose, 1.% Pepton, I⁰Z₀ Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid und 30 mcg/1 Biotin enthält, gezüchtet.

Das verwendete Fermeiitationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

100 g Glucose,
6 g Harnstoff,
10 g K₂HPO₁,
10 g ICH₄PO₄,
10 g MgSO₄-7 Η,,Ο,
2 g Fleischextrakt,

30 meg Biotin pro Liter des Fermentationsmediums.

1 ml einer 12«/oigen Harnstofflösung wird getrennt sterilisiert und zu 19 ml des Fermentationsmediums, welches vorher in einem Autoklav bei 1 kg/cm* 10 Minuten larag sterilisiert wurde, hinzugesetzt.

Das Einsaatmedium wird dem Fermentationsmedium in einer Menge von etwa 10 Volumprozent desselben eingeimpft. Die Mischung der Medien wird dann in Anteilen von 20 ml in einzelne 250 ml fassende konische Kolben gegossen. Dem Fermentationsmedium werden verschiedene Mengen von Calciumpantothenat, /i-Alanin oder Coenzym A oder Mischungen daraus zugesetzt. Nach Sterilisation unter Druck wird die Fermentation durchgeführt unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden werden dem Medium Adenin und Nicotinamid zugesetzt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen. Nach einer weiteren Fermentaticnszeit von 48 Stunden wird in der Fermentationsflüssigkeit Nicotinamid-adenin-di-

JO nuclcotid erzeugt. Das Nicotinamid-adenin-dinucleotid wird dann — nach Entfernung der Zellen — aus der Fermentationsflüssigkeit durch eine Ionen-Austausclibehandlung gewonnen. Die folgende Tabelle zeigt, welche Mengen von Nicotinamid-adenin-dinucleotid erzeugt werden, wenn verschiedene Mengen an Calciumpantothenat, /ί-Alanin oder Coenzym A dem Medium zugesetzt werden. Diese Ergebnisse werden mit dem Fall verglichen, daß kein Zusatz dieser Verbindungen zum Fermentationsmedium vorliegt.

Wie man leicht aus der Tabelle ersehen kann, ergibt sich eine wesentliche Mengenzunahme des erzeugten Nicotinamid-adenin-dinucleotids, wenn Calciumpantothenat, /^-Alanin oder Coenzym A dem FermentationsmediuTi zugesetzt worden sind.

Tabelle

Zusatz zum Menge an produziertem Nicotin-

Grundmedium amid-adenin-dimicleotid (mgm!)

Kein Zusatz 0,4

Calciumpantothenat

100μg/l 2,9

2 mg/1 3,1

12 mg/1 4,3

20 mg/1 2,8

/Ϊ-Alanin

380μg/l 3,1

7,5 mg/1 3,8

30,0 mg/1 2,4

Coenzym A

lmg/1 2,1

10m«/l 3,5

30 mg/1 3,5

50 mg/1 2,1

Claims

Patentanspruch:

Vorwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem wäßrigen Pantothensäure, /i-A!anin oder Coenzym A enthaltenden Nährmedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamidadenin-dinucleotid.