DE1617586A1 - Verfahren zur Herstellung von 6-Azauraeil-ribotid - Google Patents

Description

IB Sep. 196?

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IiYOVA HAlOCO KOGYO CO., M¹D., Tokyo/Japan

Verfahren zur Herstellung von 6~Azäuracil-ril)otid

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von G-Azauracil-ribotid. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid auf fermentativem Wege, speziell mit dessen billiger Herstellung aufgrund eines Permentierungsverfahrens unter Anwendung von Bakterien.

6-Azauracil-ribotid hat die folgende Struktur:

HO -

P-O OH

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Die Verbindung wird als aktive Form von 6-Azauracil oder 6-Azauridin betrachtet, d.h. gegen Krebs v/irksame Mittel, deren tatsächliche Wirksamkeit im lebenden Körper von V/, Dorrel, Proceedings of the Western Pharmacological Society, Band 4, Seiten 4 bis 9, 1961, beschrieben ist.

Bisher wurden synthetische Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid angewandt. Jedoch sind diese Verfahren keine guten Herstellungsverfahren vom industriellen Standpunkt, da kostspielige und schwierig zugängliche Ausgangsmaterialien eingesetzt werden müssen und niedrige und ungünstige Ausbeuten dabei erhalten v/erden. Es ist auch bekannt, daß 6-Azauracil in 6-Azauracil-ribotid im lebenden Körper umgewandelt wird. Jedoch findet nur eine geringe intra-zelluläre Bildung desselben statt und irgendeine extra-zellulare Bildung bemerkenswerter Mengen, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, wurde niemals erzielt.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid, bei dem die Nachteile und liängel der bisherigen Verfahren überwunden werden. Insbesondere ist eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil- tibotid durch Ferinentierung, das sich in wirksamer

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und_;/e4.nfacher^ Weise ausführen läßt.

Eine^weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren -zur Herstellung von 6-Azauracil-ribötid durch Fermentierung, das vorteilhafterweise im industriellen Maßstab mit billigen Ausgangsmaterialien unter Erzielung hoher Produktausbeuten durchgeführt werden kann.. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bildung eines reinen 6-Azauracil-ribotids♦

Diese und weitere Auf gaben und Vorteile der Vorliegend en/* Erfindung ergeben sieh aus der folgenden Beschreibung.

Im Rahmen von Untersuchungen zur Herstellung von Nucleotiden unter Anwendung von Mikroorganismen wurde festgestellt , daß bemerkenswerte Mengen von 6-Azauracil-ribotid in Permentijerungslösungen gebildet und angesammelt werden, wenn die nachfolgend beschriebenen spezifischen Bakterien bei Zusatz von 6-Azauraeil oder 6-Azauridin zu dem Kulturmedium zu irgendeineiii Zeitpunkt während der Kultivierung kultiviert werden. Diese Tatsache stellt eine bisher vollständig unbekannte Erscheinung dar.

Ganz allgemein ergibt sieh aufgrund der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid durch

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JFermentierung, wobei ein zu den Genera Brevibae terium, Oorynebacterium, Arthrobaeter oder Micrococcus gehörender MikroOrganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmediuiü, das 6 Azauracil oder 6-Azauridin als Zusatzsubstanz enthält, kultiviert \d.rd, wobei 6-Azauracil-ribotid in dem Medium gebildet und angesammelt wird, worauf dann das 6-Azauracil-ribotid aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnen wird.

Erfindungsgemäß wurde also festgestellt, daß 6-Azauracilribotid in großen Mengen durch Fermentierung hergestellt werden kann, wenn 6-Azauracil oder 6-Azauridin zu einem Kulturmedium zugesetzt wird,, worin die Kultivierung von Bakterien, die zu einem Genus Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter oder Micrococcus gehören, durchgeführt wird„ .

Sowohl synthetische Kulturmedien als auch natürliche ITährmedien sind im Rahmen der Erfindung geeignet, soweit sie die wesentlichen Nährstoffe zum Wachstum des angewandten Stammes enthalten» Derartige Nährstoffe sind auf dem Fachgebiet bekannt und hierzu gehören Substanzen, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen u.dgl., die von den eingesetzten Mikroorganismen verwertet werden, wenn sie in entsprechenden Mengen

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gegeben sind. Somit seien als Kohlenstoffquellen beispielshalber Kohlehydrate, wie Glukose, Fruktose, MaI-tose, Sacharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen u.dgl. oder andere geeignete Kohlenstoff quellen, wie Glycerin, Mannit» Sorbit, organische Säuren u.dgl. aufgeführt» Diese Stoffen können entwede^einzeln oder im Gemisch von zwei öder mehrverwendetwerden*Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Yerbindungen, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumehlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat u.dgl» oder eine oder mehrere Aminosäuren, gegebenenfalls in Mischkombination,

oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Mai.squellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrölysate, Casaminosäure, lösliche Pischmaterialien, ReisSchalenextrakt, u.dgl. verwendet werden. Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr Substanzen verwendet werden» Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kulturmedium zugegeben werden können, gehören Magnesiumsulfat, liatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat» Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid u.dgl*

Palis spezielle Nährstoffe für das Wachstum^ des speziell

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eingesetzten Bakterienstammes erforderlich sind, müssen diese dem Medium zugegeben werden. Zu derartigen Wachstums promotoren gehören Aminosäuren, wie z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Methionin u.dgl. und/oder Vitamine, beispielsweise Biotin, Thiamin, Cobalamin u.dgl.

Zu einem derartigen wäßrigen Hährmeaium kann das 6-Azauracil oder 6-Azauridin in seiner Gesamtmenge auf einmal oder in Abständen im Verlauf der Feriaentierung beim er- * findungsgemäßen Verfahren zugesetzt werden. Selbstverständlich können auch geeignete Salze von 6-Azauracil oder 6-Azauridin, beispielsweise das Sulfat oder das Hydrochlorid, zu dem Kulturmedium zugegeben werden. Die bevorzugte Menge an 6-Azauracil oder 6-Azauridin oder geeigneten Derivate hiervon, die zu dem Medium zugegeben wird, liegt zwischen 0,5 bis 5 g 3^e Mter des Fermentiermediums .

Die Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen , beispielsweise aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur mit Belüftung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt. Im allgemeinen wird die Kultivierung während etwa 2 bis 8 Tagen fortgeführt, wobei während dieser Zeit bemerkenswerte Mengen an 6-Azauracil-

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ribotid gebildet und in der erhaltenen Ferment!erflüssigkeit angesammelt werden, Hach beendeter Fermentierung kann das 6-Azauraeil-ribotid abgetrennt und aus der Ferment! erflüssiglceit nach, üblichen Methoden, beispielsweise durch Behandlung mit einen Ionenaustauschharz, Adsprption, Ausfällung^ öhromatographie u.dgl», gewonnen werden, " ;-. ". r ,■■-■'"■

Die folgenden Beispiele dienen lediglich zu der Erläuterung der vorliegenden Erfindungj ohne sie zu begrenzen. Die hier angegebenen Prozentsätze sind auf das Gewicht je Liter Wasser bezogen, falls nfchts anderes angegeben ist*

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniageneses A3X3C 6872 wurde als Impfbaoteriuni verwendet_β Es wurde bei 30⁰O während 24 Stunden in einem Kulturmedium aus 2$ aiukose, Λ$ Pepton, Hefeextrakt, 0,3^ KaCl und 30,^agA Biotin kultiviert. Die erhaltene ImpfkuXtur wurde in einer Menge von 10 "Vo lumenprozent zu einem Eermentierkulturmedium der folgen den Zusammensetzung zugegebens

100 g Glukose ν

6 g Harnstoff

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10 g KH₂PO₄
tp g K₂HPO₄
: 10 g MgS0₄*7H₂0
0,1 g CaGl₂»2H₂O
50jng Biotin
10g Hefeextrakt.

Das Feriuentiermedium wurde durch Auflösung der vorstehenden Bestandteile in Wasser und Verdünnung auf 1 liter, Einstellung der pH-Wertes auf 8,0 mit HaOH und Sterilisation in einem Autoklaven bei 1 kg/cm während 10 Minuten hergestellt. Das Medium wurde dann in einzelne Kolben mit einem Inhalt von 250 ml gegossen und zwar jeweils 20 ml in jeden Kolben. Nach dem Überbringen der vorstehend beschriebenen Impfkultur wurde die Perraentierung dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 50 C durchgeführt.

Nach einer Kultivierzeit von 72 Stunden wurde 6-Azauracil zu der Kulturlösung in solcher Menge zugegeben, daß seine Konzentration in-d.er-Fermentier lösung 2 mg/ml betrug· Die Kultivierung wurde während weiterer 24 Stunden fortgesetzt, wobei während dieser Zeit das 6-Azauracil-ribotid gebildet und in, der Kulturflüssigkeit angesammelt wurde. Das 6-Azauracil—ribotid hatte sich in der erhaltenen Permentierflüssigkeit in einer Konzentration von 4,1 mg/ml angesammelt. Es wurde durch Adsorption auf einem stark basi-

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sehen Polystyrol-Anionenaustausehharz, 3}owex Hr. 1 (imeisensäuretyp) gewonnen und anschließend mit einer wäßrigen iösung von Animoniumforiaiat eluiert»

Beispiel 2 ' ; ; _;

Die Kultivierungwurde unter den gleichen Bedingtingen und in dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 durchgö- ' führt, jedoch 6-Azauridin zu dem Medium anstelle von 6-Azauracil zugesetzt. Die Menge des in dem Kulturmedium gebildeten 6-Azauracll-ribotid betrug 3|7 mg/ml.

Beispiel 3 " -

Die Kultivierungwurde in der gleichen Ifeise wie in Beispiel 1 durchgeführt., jedoch Obrynebacteriuia sp» ffr. 3485 ATCO 21 084 als Impfbacterium anstelle von Brevibacterium ammonia^enesis verwendet. Die Menge des in der erhaltenen Kulturflüssiglcei t gebildeten 6-Azaurecil-ribotid betrug: 3,51 mg/ml.

Beispiel 4 " ■ "'".".

Die Kultivierung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch Ar'throbacer sp. Hr. 3486 AIiCC 21 085 als Impf bacterium anstelle; von Brevibac terium ammoniagenessa verwendet. Die Menge des

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in der Kulturlösung gebildeten 6-Äzauracil-ribotid betrug 4,2 mg/ml.

Beispiel 5

Die Kultivierung wurde in der gleichen ¥eise und in dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch Micrococcua sodonensis ATCC 15 932 als Impfbacterium, anstelle von Brevibacterium ammoniageneses verwendet. Die Üienge an dem Xja. der Kulturflüssigkeit nach Beendigung der Ferraentierung gebildeten 6-Azauracil-ribotid betrug 2,3 mg/ml.

Die Erfindung, wurde im vorstehenden anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, wobei selbstverständlich ist, daß auch andere Stämme der vorstehend aufgeführten Genera eingesetzt werden können, die diese Eigenschaft der Bildung- von 6-Azauracil-ribotid besitzen.

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Claims (2)

...ν r ν - Patentansprüche ·.-

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid durch Fermentierung,, dadurch gekennzeichnetY daß ein zu den Genera Brevibaeterium, Corynebacterium, Arthro-"bacter oder MAerococcus gehörender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen ÜTährmedium, das als Zusatz 6-Azauracil oder 6-Azauridin enthält, unter Bildung und Ansammlung des 6-Azauracil-ribotids in dem Medium kultiviert und dann aus der erhaltenen Eulturflüssigkeit das 6-Azauracil-riliotid gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ₉ daß die Yerbindung zu dem Medium in der Gesamtmenge auf einmal während des Kultivier ens zugegeben wird.

5. Verfahren nach Anspruch T₉ dadurch gekennzeichnet ₉ daß die Verbindung zu dem Medium in Abständen während der Kultivierung zugegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung zu dem Medium vor Beginn der Kultivierung zugegeben wird.

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5. Verfahren nach Anspruch. 1 "bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung zu dem Medium in einer Menge von 0,5 bis 5 g je Liter des Ferment! ermediums zugege"ben wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 4O⁰O und bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9»5 durchgeführt wird·

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Brevlbacterium ammoniagenesis ATCC 6872, Corynebacterium sp. Nr. 3485 ATCC 21084, Arthrobacter sp. Kr. 3486 ATCC 21 085, oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 verwendet werden.

8. Verfahren zur Herstellung von 6-Azauracil-ribotid durch Fermentierung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammoViiagene-SBJ3 ATCC 6872, Corynebacterium sp. Hr. 3485 ATCC 21084, Arthrobacter sp. Nr. 3486 ATCC 21085» nder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, die als Zusatzsubstanz 6-Azauracil oder 6-Azauridin enthält, bei einer Temperatur zwischen etwa 20 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis

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9,5unter Bildung und Ansammlung des G-AzauracIl-rilaotids in dem Medium kultiviert und dann das 6-Azauracilribotid aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnen : wird» " " " - '".- - . ν ^v , .

9· Verfahren nach Anspruck 8, dadurch, gekennzeichnet, daß die ZusatzverMndung dem Medium während der Kjilti-rierung in. einer Menge von 0,5 ώ 5g je Liter des Permentiermediums augesetzt wird·