<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure und ihrer Salze durch Fermentation. Die Erfindung besteht im wesentlichen in der Züchtung eines Stammes von Torulopsis utilis in einem Zucker sowie stickstoffhaltige und anorganische Stoffe enthaltenden Kulturmedium, unter solchen Bedingungen, dass sich darin eine grosse Menge l-Glutaminsäure oder deren Salze anreichert, die dann daraus gewonnen werden. Es ist bekannt, dass bei der Züchtung von Mikroorganismen in einem geeigneten Medium verschiedene Aminosäuren entstehen. Die so erzeugte Menge ist jedoch sehr klein und es wurde noch nicht darüber berichtet, dass irgendeine spezielle Aminosäure durch Fermentation in grosser Menge in einem Medium angereichert werden konnte.
Der Grund, dass sich Aminosäuren in einem biologischen System so schwer anreichern lassen, liegt darin, dass die Aminosäuren die Komponenten von Proteinen sind und eine in einem Medium einmal gebildete Aminosäure dazu neigt, leicht wieder Proteine, Polypeptide usw. zurückzubilden oder die Säure wird durch verschiedene biochemische Reaktionen in andere Substanzen übergeführt oder zersetzt. Mit andern Worten, eine Aminosäure kann in einem Kulturmedium nur schwer im monomeren Zustande angereichert werden. Unter dem Ausdruck "monomerer Zustand" wird hier der monomolekulare Zustand als freie Säure oder als Salz verstanden.
Dies ist der Grund, warum ein Fermentationsprozess, also die unmittelbare Ausnützung der biochemischen Aktivität lebender Mikroorganismen, bisher noch nicht für die Biosynthese und Anreicherung von 1-Glutaminsäure vorgeschlagen wurde. Die bekannte Biosynthese wird in einem enzymatischen System durchgeführt, d. h. es wird eine besondere Enzymart aus Mikroorganismen oder aus tierischen oder pflanzlichen Geweben extrahiert und mit geeigneten Substraten in Reaktion gebracht z. B. mit oc-Ketoglutarsäure und Ammoniumverbindungen unter sehr engen Reaktionsbedingungen, wie dies beispielsweise in der deutschen Patentschrift Nr. 931582 und in der USA-Patent- schrift Nr. 2, 749, 274 beschrieben ist, wobei diese Reaktion unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.
Anderseits ist es bekannt, dass gewisse Mikroorganismen K-Ketoglutar- säure aus Kohlehydrat unter aeroben Bedingungen bilden können, wie dies beispielsweise in den
EMI1.1
hydraten zwei verschiedene Verfahrensschritte notwendig, u. zw. ein unter aeroben Bedingungen durchzuführender Verfahrensschritt zur Herstellung von x-Ketoglutarsäure aus Kohlehydraten und ein anaerober Verfahrensschritt zur Herstellung von 1-Glutaminsäure aus K-Keto- glutarsäure. Die direkte Herstellung von 1-
Glutaminsäure aus Kohlehydraten unter Verwendung eines bestimmten Mikroorganismus unter aeroben Fermentationsbedingungen war bisher noch nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, eine bedeutende Menge von 1-Glutaminsäure direkt aus Kohlehydraten zu erzeugen, wenn man einen Mikroorganismus verwendet, welcher die zwei später zu beschreibenden biochemischen Bedingungen erfüllt. Es handelt sich somit beim erfindungsgemässen Verfahren um ein einstufige Verfahren, mittels welchem 1-Glutaminsäure direkt aus Kohlehydraten hergestellt werden kann.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird eine wesentliche Menge 1-Glutaminsäure bei der Kultivierung von gewissen Stämmen von Mikroorganismen der Gattung Torulopsis in einem flüssigen Medium direkt erzeugt.
Dabei werden grosse Mengen l-Glutaminsäure im monomeren Zustand im flüssigen Medium angesammelt.
Nebenreaktionen, die während der Züchtung von Organismen der Gattung Torulopsis in einem flüssigen Medium vor sich gehen, z. B. eine Polymerisation oder Zersetzung von 1Glutaminsäure, werden beim erfindungsgemässen Verfahren weitgehend unterdrückt.
Die im flüssigen Medium angereicherte 1Glutaminsäure ist infolge ihres monomeren Zustandes leicht zu gewinnen.
<Desc/Clms Page number 2>
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird ein Stamm von Torulopsis utilis mit be- sonderen, im folgenden angegebenen biochemi- schen Eigenschaften in einem flüssigen Medium inokuliert. Während der Fermentation wird der pH-Wert dieses Mediums auf etwa 6-9 ein- gestellt und auf dieser Höhe gehalten, wodurch eine grosse Menge 1-Glutaminsäure bzw. deren
Salz gebildet wird, welche dann abgetrennt werden.
Es wurde gefunden, dass Stämme von Mikroorganismen, die für das Verfahren gemäss der Erfindung brauchbar sind, zwei spezifisch biochemische Bedingungen erfüllen müssen ; sie müssen nämlich 1. oc-Ketoglutarsäure aus Zucker erzeugen und 2. müssen sie eine starke 1-Glut- aminsäure-Dehydrogenase-Aktivität haben und besonders für die Umkehrreaktion der erwähnten reversiblen enzymatischen Reaktion, das ist die reduktive Aminierung von oc-Ketoglutarsäure stark aktiv sein.
Es wurden Mikroorganismen ausgewählt, die den erwähnten beiden biochemischen Bedingungen entsprechen und es wurde festgestellt, dass Torulopsis utilis sich für die industrielle Anwendung sehr gut eignet.
DieStärkederl-Glutaminsäure-Dehydrogenase- Aktivität, besonders der Aktivität eines Stammes für die reduktive Aminierung von < c-Ketoglutar- säure steht in engem Zusammenhang mit der Fähigkeit dieses Mikroorganismus 1-Glutaminsäure zu erzeugen. Diese biochemischen Eigen- schaften eines Mikroorganismus sind für die Anreicherung von 1-Glutaminsäure besonders wichtig.
Ein Merkmal der Erfindung liegt auch in der Kontrolle des Fermentationsvorganges. Als Kulturmedium kann irgendeine bekannte, für das Wachstum von Mikroorganismen der Gattung Torulopsis geeignete Zusammensetzung verwendet werden. Um einen kräftigen Kohlehydratmetabolismus durch den Mikroorganismus herbeizuführen, können dem Kulturmedium verschiedene stickstoffhaltige Substanzen, anorganische Stoffe oder andere vom Organismus benötigte Stoffe zugesetzt werden. Durch den Kohlehydratmetabolismus neigen organische Säuren im allgemeinen dazu, sich anzureichern und das Medium sauer zu machen. Es wurde
EMI2.1
des Fermentationsablaufes wesentlich beeinflusst wird. Die Erzeugung wird begünstigt, wenn der pH-Wert zwischen 6, 0 und 9, 0 gehalten wird. Der optimale pH-Wert scheint zwischen etwa 7, 0 und 8, 5 zu liegen.
Gemäss der Erfindung wird der pH-Wert durch Zusatz einer ein basisches Stickstoffradikal enthaltenden Verbindung auf 6-9 eingestellt und in dieser Höhe gehalten. So wird die gebildete a-Ketoglutarsäure mit Ammoniumionen vereinigt, die aus den zugesetzten basischen Stickstoffradikalen stammen und es bildet sich 1-Glutaminsäure u. zw. durch die Wirkung der stark reduktiven
Aminierung der im Mikroorganismus enthaltenen 1-Glutaminsäure-Dehydrogenase zufolge der letz- teren und durch die Einhaltung eines optimalen pH-Bereiches werden die verschiedenen stö- renden Nebenreaktionen vermindert, so dass die Reaktion der l-Glutaminsäurebildung die
Nebenreaktionen überwiegt und sich 1-Glut- aminsäure in grossen Mengen anreichert.
Für die Neutralisation des Kulturmediums können verschiedene Wege eingeschlagen werden.
Dem Medium kann die notwendige Menge Ammoniumionen zugeführt werden. Auch die kombinierte Anwendung von Ammoniumsalzen und Alkalien liegt im Rahmen des Verfahrens gemäss der Erfindung.
Die im Medium angereicherte 1-Glutaminsäure bzw. ihre Salze werden in an sich bekannter Weise abgetrennt, z. B. durch ein Ionen austauschendes Harz. Derartige Verfahren bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Zur näheren Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung werden die nachfolgenden Beispiele angeführt.
Versuch 1 : Verschiedene Mikroorganismen wurden hinsichtlich der erwähnten beiden biochemischen Bedingungen untersucht und geeignete davon ausgewählt. Auf die beiden spezifischen biochemischen Erfordernisse wurde wie folgt geprüft : Die Methode zur Feststellung der Fähigkeit, u-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigen Materialien zu produzieren, ist in Fachkreisen wohl bekannt. Es wurde z. B. ein Stamm in einem flüssigen, Zucker und andere Nährstoffe enthaltenden Medium als Schüttelkultur gezüchtet. Die gewonnene Säure wurde durch Papier-Chromatographie geprüft ; nötigenfalls wurde auch eine quantitative Analyse durch Kolorimetrieren nach Friedemann-Hau- gen's durchgeführt. Durch diese Probe wurden jene Mikroorganismen ausgewählt, die imstande
EMI2.2
zu erzeugen.
Dann wurde die 1-Glutaminsäure-Dehydro- genase-Aktivität untersucht, besonders bezüglich der Stärke der reduktiven Aminierung von K-Ketoglutarsäure. Die Probe wurde, wie noch beschrieben wird, durch Ammoniakabsorption in einer Reaktionsmischung durchgeführt, unter Verwendung unverletzter Zellen oder des Mycels.
Die quantitative Prüfung der Ammoniakabsorption wurde nach einer Methode ausgeführt, : die in Microdinusion Analysis and Volumetric Error" (E. J. Conway, London Crosby Lockwood and Son Ltd. 1950) beschrieben ist.
Der zu prüfende Mikroorganismus wurde als Schüttelkultur gezüchtet, z. B. in Glukose bouillon, Kojiextrakt oder Czapek-Lösung. Nach 20-40 Stunden wurden die Zellen oder das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in einer PhosphatPufferlösung mit einem pH-Wert von 8 susten- diert. Die Reaktionsmischung für die Prüfung der erwähnten Enzymaktivität hatte folgende Zusammensetzung.
<Desc/Clms Page number 3>
Tabelle 1 Zusammensetzung der Reaktionsmischung
EMI3.1
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> verwendete <SEP> Menge
<tb> Glukoselösung <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> α-Ketoglutarsäurelösung <SEP> ..................... <SEP> 200 <SEP> mMole <SEP> l <SEP> cm3
<tb> Diammonphosphatlösung <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Zellen <SEP> (oder <SEP> Mycel) <SEP> Suspension <SEP> (nasse <SEP> Zellen
<tb> oder <SEP> Mycel) <SEP> .................................... <SEP> 30-50 <SEP> mg/cm3 <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Phosphat-Pufferlösung <SEP> (pH-8)................... <SEP> 1/15 <SEP> Mole <SEP> 5 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> 9 <SEP> cm3
<tb>
Der pH-Wert wurde auf 8, 0 eingestellt und die Reaktionsmischung auf 10 cm3 aufgefüllt.
Es wurden gleichzeitig zwei Kontrollversuche durchgeführt. Der eine mit einer Glukoselösung und der andere mit der Glukose-α-Ketoglutar- säurelösung der oben angegebenen Reaktions-
Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen. mischung. Diese zweite Kontrollösung ergibt die Grundmenge der Ammoniakabsorption in dieser Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 370 C stehengelassen. Die verbrauchte Ammoniakmenge wurde gemessen, um die erwähnte Enzymaktivität zu bestimmen.
Tabelle 2 Ammoniakabsorption y/cm3 1)
EMI3.2
<tb>
<tb> i <SEP> Reaktions- <SEP> I <SEP> Reaktions- <SEP> I <SEP> StÅarke <SEP> der <SEP>
<tb> Organismus <SEP> mischung <SEP> (a) <SEP> mischung <SEP> (b) <SEP> Strke <SEP> qer
<tb> (Glukose <SEP> enthaltend) <SEP> (keine <SEP> Glukose) <SEP> Enzymwirkung') <SEP>
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 28 <SEP> 5 <SEP>
<tb> 2 <SEP> Bacilles <SEP> natte <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> *
<tb> 3 <SEP> Bacillus <SEP> Megatherium <SEP> .................. <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP> *
<tb> 4 <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> .............. <SEP> 35 <SEP> 5 <SEP> **
<tb> 5 <SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 42 <SEP> 6 <SEP>
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116 <SEP> ............... <SEP> 18 <SEP> 5 <SEP> *
<tb> 7 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128.................
<SEP> 52 <SEP> I <SEP> 12 <SEP> *** <SEP>
<tb> 8 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 165 <SEP> .................... <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> **
<tb> 9 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> 98 <SEP> 16 <SEP> ***** <SEP>
<tb> 10 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> **** <SEP>
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056....... <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> *** <SEP>
<tb> 12 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143....... <SEP> 17 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevisae <SEP> Nr. <SEP> 618.......... <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr.
<SEP> 812 <SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> **** <SEP>
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces <SEP> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> *** <SEP>
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3181.............. <SEP> 26 <SEP> 12 <SEP> * <SEP>
<tb> 17 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3216 <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> *** <SEP>
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423............... <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> *** <SEP>
<tb> 19 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4235....... <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> ** <SEP>
<tb> 20 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4261....... <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> * <SEP>
<tb> 1) <SEP> Die <SEP> absorbierte <SEP> Ammoniakmenge <SEP> wurde <SEP> durch <SEP> die <SEP> Gleichung: <SEP> Ammoniakabsorption <SEP> = <SEP> (Gefundene
<tb> Menge)- <SEP> (Grundmenge) <SEP> berechnet.
<tb>
Die <SEP> Grundmenge <SEP> wird <SEP> erhalten, <SEP> wenn <SEP> -Ketoglutarsäure <SEP> und <SEP> Glukose <SEP> von <SEP> der <SEP> vollständigen <SEP> Reaktionsmischung <SEP> genommen <SEP> werden. <SEP> Die <SEP> individuellen <SEP> Werte <SEP> der <SEP> Grundmenge <SEP> des <SEP> absorbierten <SEP> Ammoniaks <SEP> wurden
<tb> in <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> weggelassen.
<tb>
2) <SEP> * <SEP> bedeutet <SEP> 1-20 <SEP> γAmmoniakabsorption <SEP> in <SEP> der <SEP> Reaktionsmischung <SEP> (a).
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Die aus der Tabelle 2 entnehmbaren Resultate zeigen, dass die Stärke der reduktiven Aminisierung von < x-Ketoglutarsäure von jedem Stamm, selbst innerhalb der gleichen Art, sehr variabel ist. Ausserdem geht daraus hervor, dass zwischen den taxonomischen Positionen und der Stärke der erwähnten Enzymreaktion keine Beziehung besteht. Auf diese Weise kann angenommen werden, dass die Stärke der Enzymreaktion zum spezifischen Charakter eines individuellen Stammes in verschiedenen taxonomischen Gruppen oder Arten gehört.
Ein Vergleich der Ammoniakabsorption in den Reaktionsmischungen (a) und (b) ergibt, dass sie in der Mischung (a) viel höher ist als in der Mischung (b). Dies bedeutet, dass die Glukose die für die Reaktion erforderliche Energie liefern kann.
Daraus ergibt sich, dass die Reaktion fermentierbaren Zucker braucht, um eine hohe Ammoniakabsorption zu erzielen. Die Reaktion wird also in Gegenwart von fermentierbarem Zucker zufriedenstellend verlaufen.
Aus Tabelle 3 ist die durch Mikroorganismen mit stark reduktiver Aminisierungsaktivität gebildete Menge 1-Glutaminsäure zu ersehen ; auch Fälle ohne Glutaminsäurebildung sind daraus zu entnehmen. Die in drei Tage alten Schüttelkulturen angereicherte Menge 1-Glutaminsäure wurde analytisch bestimmt.
Tabelle 3
EMI4.1
<tb>
<tb> Erzeugung <SEP> von <SEP> 1-Glutaminsäure
<tb> Stärkder <SEP> enzymatischen <SEP> (mg/100 <SEP> cm1)
<tb> Organismus <SEP> Aminisierung
<tb> Medium <SEP> AI) <SEP> Medium <SEP> B <SEP> 2) <SEP>
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ** <SEP> 420 <SEP>
<tb> 2 <SEP> Bacillus <SEP> natto <SEP> .......................... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> -
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116................. <SEP> * <SEP> 60 <SEP> - <SEP>
<tb> 4 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128................. <SEP> *** <SEP> 410 <SEP> - <SEP>
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> ***** <SEP> ego- <SEP>
<tb> 6 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> **** <SEP> 420- <SEP>
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056.......
<SEP> *** <SEP> 360- <SEP>
<tb> 8 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143... <SEP> "" <SEP> * <SEP> 40 <SEP> - <SEP>
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812................... <SEP> *** <SEP> 670 <SEP> -
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3181 <SEP> ............... <SEP> * <SEP> - <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216 <SEP> ............... <SEP> *** <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> ................ <SEP> *** <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicllium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4216 <SEP> * <SEP> - <SEP> 60 <SEP>
<tb> 1) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> A <SEP> enthält:
<SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Pepton <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> Harnstoff <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> K2HPO <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g, <SEP> MgSO4. <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 0,1 <SEP> g;
<tb> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> aufgefüllt.
<tb>
2) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> B <SEP> enthält <SEP> : <SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Maisquellwasser <SEP> 10 <SEP> g, <SEP> Ammoniumsulfat <SEP> 15 <SEP> g, <SEP> K2HPOf <SEP> 1,0 <SEP> g;
<tb> MgSO4-7 <SEP> H2O <SEP> 0,1 <SEP> g; <SEP> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> aufgefüllt. <SEP> Während <SEP> der <SEP> Züchtung <SEP> wurden <SEP> Ammoniak
<tb> und <SEP> Natriumhydroxyd <SEP> zugesetzt, <SEP> so <SEP> dass <SEP> der <SEP> pa-Wert <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> zwischen <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> und <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> lag.
<tb>
Nach den in der Tabelle 3 wiedergegebenen Resultaten besteht augenscheinlich ein Zusammenhang zwischen der Stärke des enzymatischen Aminisierungsvermögen der intakten Zellen oder des Mycels und der tatsächlichen ÖlGlutaminsäureanreicherung bei der Schüttelkultur-Fermentation. Nach diesen Ergebnissen ist es klar, dass die beiden spezifischen, biochemischen Aktivitäten eines Mikroorganismus mit der Erzeugung und Anreicherung der 1Glutaminsäure in unmittelbarem Zusammenhang stehen.
Versuch 2 : Die pH-Wert-Kontrolle in einem Fermentationsmedium.
Es wurde das in Tabelle 3 angegebene Nährmedium verwendet. Für die Einstellung des pH-Wertes des Mediums während der Fermentation auf 6. 5-8, 5 können solche Substanzen verwendet werden, welche basischen Stickstoff enthalten und Ammoniumionen liefern, so dass der pH-Wert nach der alkalischen Seite verschoben wird. Solche Substanzen sind z. B.
NHs, NH4OH, (NH2)2CO, (NH4)2CO3 usw.
Auch verschiedene Ammoniumsalze, wie
EMI4.2
und damit in der Begünstigung der enzymatischen Reaktion für die Anreicherung von 1-Glutamat.
Entsprechende Resultate sind aus Tabelle 4 zu entnehmen.
<Desc/Clms Page number 5>
Tabelle 4
EMI5.1
<tb>
<tb> PH <SEP> auf <SEP> 6, <SEP> 5-8, <SEP> 5 <SEP> gehalten <SEP>
<tb> Ohne <SEP> PR
<tb> Kontrolle <SEP> %Ausbeute
<tb> Medium <SEP> t) <SEP> Organismus <SEP> I-Glutamin- <SEP> 1-Glutamin- <SEP> Konsumierte <SEP> bez. <SEP> aufsäuremenge <SEP> säuremenge <SEP> Glukose <SEP> konsumierte
<tb> (mg, <SEP> 100 <SEP> cm') <SEP> (mg/IOOcm') <SEP> (g/100cm') <SEP> Glukose
<tb> A <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2,4 <SEP> 17,5
<tb> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534 <SEP> .... <SEP> 240 <SEP> 980 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 30, <SEP> 6
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812........... <SEP> 1 <SEP> 23 <SEP> I <SEP> 670 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 22, <SEP> 3 <SEP>
<tb> B <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216........
<SEP> 8 <SEP> 520 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 15, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> ........... <SEP> 3 <SEP> 340 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 1) <SEP> Die <SEP> Zusammensetzung <SEP> der <SEP> Medien <SEP> A <SEP> und <SEP> B <SEP> ist <SEP> die <SEP> gleiche <SEP> wie <SEP> in <SEP> Tabelle <SEP> 3.
<tb>
Tabelle 4 zeigt, dass eine richtige pH-Kontrolle bei der Fermentation für eine starke Anreicherung
EMI5.2
keine Anreicherung erzielt, selbst wenn der
Organismus an sich dafür geeignet wäre.
Wie aus den oben angeführten Versuchen hervorgeht, gibt es viele Mikroorganismenstämme, welche zwei biochemische Bedingungen, nämlich die Fähigkeit zur Erzeugung von < x-Ketoglutar- säure aus zuckerhaltigem Material und eine hohe 1-Glutaminsäure-Dehydrogenase-Aktivität erfüllen und welche unter bestimmten Fermentationsbedingungen 1-Glutaminsäure erzeugen können. Es hat sich nun erwiesen, dass ein Stamm von Torulopsis utilis für die praktische Erzeugung von 1-Glutaminsäure besonders gut geeignet ist.
Der Mikroorganismus Torulopsis-utilis und seine charakteristischen Eigenschaften sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6. Ausgabe, beschrieben.
Wie aus den später angeführten Beispielen hervorgeht, kann als Stickstoffquelle des Nährsubstrates sowohl anorganisch gebundener als auch organisch gebundener Stickstoff dienen.
Die Zucker- und Stickstoffquelle kann verschiedenster Art sein. Es kann als Kohlehydratquelle, Glukose, Fruktose, Mannose, Sukrose, Maltose, Melasse und hydrolysierte Stärke bzw.
Gemische dieser Stoffe verwendet werden. Als Stickstoff enthaltende Substanzen können Ammoniak, Harnstoffe, Ammonchlorid, Ammonazetat oder andere anorganische oder organische Ammoniumsalze, Pepton, Fleischextrakt, Abguss von Getreideweiche, hydrolisiertes Kasein, Fischmehl oder digestiertes Fischmehl, Sojabohnenmehl oder digestiertes Sojabohnenmehl verwendet werden.
Die Fermentationstemperatur kann von 28 C
EMI5.3
Zeitraumes von zwei bis fünf Tagen, u. zw. als Schüttelkulturfermentation oder submerse Fermentation mit Belüftung und Rühren, durchgeführt. Zur Regelung des pH-Wertes des Substrates im Bereich von pH 6 bis 9 werden neutralisierende Substanzen wie beispielsweise
Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumverbindungen bzw. Verbindungen, welche Aminogruppen ent- halten, wie beispielsweise Ammoniumhydroxyd,
Ammoniumkarbonat od. dgl., oder Alkalilaugen, wie beispielsweise Natronlauge, verwendet.
Nach Vollendung der Fermentation werden die Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren vom Substrat abgetrennt und das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert. Auf diese Weise erhaltenes Konzentrat wird mit
5-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3, 2 ein- gestellt und dann in einem kühlen Raum stehen- gelassen, wobei sich Rohkristalle von 1-Glutamin- säure abscheiden.
Die im Substrat erzeugte l-Glutaminsäure bzw. deren Salze wird auf irgendeine geeignete Art, beispielsweise mittels eines lonenaustauschharzes, abgetrennt. In den folgenden Beispielen sind
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Beispiel 1 : Es wurde ein Nährsubstrat auf folgende Weise hergestellt : 50 g Glukose, 5 g Pepton, 5 g Harnstoff, 1, 0 g K2HP04 und 0, 1 g MgSO. 7 H O wurden in Leitungswasser aufgelöst und die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 1 1 gebracht. Der pH-Wert des
Substrates betrug ungefähr 7, 5. Es wurden je 30 cm3 dieses Substrates in einem 250 cm3Erlenmeyer-Kolben eingebracht und 10 Minuten lang einer Temperatur von 110 C unterworfen. Das sterilisierte Substrat in einem dieser Kolben wurde mit 3 cm3 einer Impfflüssigkeit von Torulopsis utilis angeimpft, welche auf Glukosebouillon in einer Schüttelkulturvorrichtung bei 28 C 24 Stunden lang gezüchtet worden war.
Es wurde hiezu ein Stamm von Torulopsis utilis verwendet, welcher fähig ist, ct. - Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigem Material zu erzeugen und welcher weiters eine hohe 1-Glutaminsäure- Dehydrogenase-Aktivität besitzt. Kulturen eines derartigen Stammes sind in verschiedenen Kultursammlungen, z. B. im Institute of Applied Microbiology (I. A. M.) der Universität Tokio hinterlegt. Eine derartige Kultur kann auch auf einfache Weise mittels der üblichen Auslese-
<Desc/Clms Page number 6>
verfahren aus natürlichen Materialien erhalten werden. Eine identifizierende Beschreibung derartiger Mikroorganismen ist beispielsweise in dem Werk The Yeast, A Taxonomic Study" von J. Lodder und Mitarbeiter, herausgegeben von der North-Holland Publishing Co., Amsterdam, gegeben.
Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von Torilopsis utilis Nr. 812 ist im Institute of Applied Microbiology der Universität von Tokio unter der Bezeichnung TH-9 hinterlegt. Die Fermentation wurde in einer Schüttelkulturvorrichtung bei 280 C durchgeführt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 bis 1, 0 cm3 10%iger NH4OH in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf einen Wert zwischen 6-9 gehalten. Nach 4 Tagen wurde das fermentierte Substrat zentrifugiert und die Bakterienzellen entfernt. Der l-Glutaminsäuregehalt der überstehenden Flüssigkeit wurde unter Verwendung von 1-Glutaminsäure-Decarboxylase auf enzymatischem Wege mit 87, 1 mg/cm3 bestimmt.
Die überstehende Flüssigkeit wurde im Vakuum auf 1/5 ihres ursprünglichen Volumens eingedampft und der pH-Wert dieses Konzentrates wurde mittels 5-n HC1 auf 3, 2 eingestellt. Die Lösung wurde in einem kühlen Raum so lange stehengelassen, bis eine wesentliche Menge von roher Glutaminsäure auskristallisiert war. Aus l l des fermentierten Substrates erzielt man 6, 0 g rohe 1-Glutaminsäure.
Beispiel 2 : Es wurde das in Beispiel 1 angegebene Verfahren wiederholt, jedoch wurde als Neutralisationsmittel (NHJCOg verwendet. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 cm3 10%iger (NILCOg-Lösung in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf 6-9 eingestellt. Nach einer Fermentationsdauer von 4 Tagen enthielt das Substrat 6, 5 mg 1-Glutaminsäure pro cm3.
Beispiel 3 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch das auf folgende Weise hergestellte Substrat verwendet wurde. 50 g Glukose, 8 g Harnstoff, 0, 5 g K2HP04, 0, 1 g MgS04. 7 H20 und 5 mg Fecal3. 6 H20 wurden im Leitungswasser aufgelöst und die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 1 l gebracht. Der pH-Wert des Substrates betrug ungefähr 7, 5. Nach der Sterilisation und Abkühlung wurde das Substrat mit demselben Mikroorganismus wie in Beispiel 1 beschrieben geimpft und die Fermentation wurde submers unter Belüftung und Rühren bei einer Temperatur von 28 C durchgeführt. Während
EMI6.1
Lösung, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf 6 bis 9 eingestellt.
Nach einer Fermentationsdauer von 4 Tagen enthielt das Substrat 6, 8 mg 1Glutaminsäure pro cm3.