AT200544B - Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure bzw. deren Salzen durch Fermentation - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure bzw. deren Salzen durch Fermentation 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von   l-Glutaminsäure   bzw. deren Sal- zen durch Fermentation. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Erzeugung und starken Anreicherung von   l-Glutaminsäure   bzw. deren Salze durch Züchtung eines neuen   Mierococcusstammes   in einem ge- eigneten Kulturmedium unter entsprechenden Fermentationsbedingungen. 



   Es ist bekannt, dass bei der Züchtung von Mikroorganismen in einem geeigneten Substrat verschiedene Aminosäuren entstehen können. Die so gebildete Menge ist jedoch sehr klein und es ist bisher noch nicht bekannt geworden, dass durch einen Fermentationsprozess irgendeine bestimmte Aminosäure im Medium in grosser Menge angereichert werden konnte. 



   DerGrund für die ausserordentlichen Schwierigkeiten bei derAnreicherung von Aminosäuren in einem Fermentationsmedium ist darin gelegen, dass Aminosäuren Bestandteile von Proteinetrsind und einein Medium einmal gebildete Aminosäure dazu neigt, Proteine, Polypeptide usw. leicht wieder zurückzübilden oder die Säure wird durch verschiedene biochemische Reaktionen in andere Stoffe übergeführt bzw. zersetzt. Dies ist der Grund, warum ein Fermentationsprozess, also die unmittelbare Ausnützung der biochemischen Aktivität lebender Mikroorganismen, bisher noch nicht für die Biosynthese und Anreicherung von   l-Glutaminsäure   vorgeschlagen wurde. Die bekannte Biosynthese wird in einem enzymatischen System durchgeführt.

   Dabei wird eine bestimmte Enzymart aus Mikroorganismen oder aus gewissen tierischen oder pflanzlichen Geweben extrahiert und mit geeigneten Substanzen in Reaktion gebracht. z. B. mit   a-Ketoglutarsäure   und Ammoniumverbindungen unter sehr engen Reaktionsbedingungen (Deutsche Patentschrift Nr. 931582 bzw. USA -Patentschrift Nr.2, 749,279). 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur direkten Erzeugung von   l-Glutaminsäure   in wesentlicher Menge, durch Kultivierung bestimmter Mikroorganismen in einem flüssigen Medium. 



   Mit dem Verfahren gemäss der Erfindung wird eine grosse Menge   l-Glutaminsäure   im Kulturmedium angereichert. 



   Ausserdem werden mit diesem Verfahren Nebenreaktionen weitgehend unterdrückt, z. B. ein weiterer Umbau der Glutaminsäure bzw. deren Einbau in höhermolekulare Eiweissstoffe oder die Zersetzung der 1-Glutaminsäure während der Züchtung bestimmter Mikroorganismen in einem flüssigen Medium. 



   Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird ein neuer Micrococcusstamm in einem geeigneten Substrat unter entsprechenden Fermentationsbedingungen kultiviert, wobei sich 1-Glutaminsäure im Substrat stark anreichert. 



   Es wurde gefunden, dass ein Mikroorganismus für die direkte Erzeugung einer wesentlichen Menge 1-Glutaminsäure durch einen Fermentationsprozess geeignet ist, wenn er zwei spezifisch biochemische Bedingungen erfüllt, u. zw. muss er erstens die Fähigkeit haben, aus zuckerhaltigen Stoffen    < x-Ketoglutar-   säure zu erzeugen und zweitens muss er eine hohe 1-Gluaminsäure-Dehydrogenase-Aktivität besitzen, besonders eine hohe Aktivität gegen die Umkehrreaktion der oben erwähnten reversiblen Enzymreaktion, d. i. die reduktive Aminierung von   o :-Ketoglutarsäure.   



   Charakteristisch für den Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also die Erzeugung und Anreicherung von   I-Glutaminsäure   in einem Kulturmedium durch die erwähnten, biochemischen Wirkungen während des Wachstums und der Vermehrung des Stammes. Damit ist der wesentliche Unterschied des Verfahrens gemäss der Erfindung gegenüber der erwähnten enzymatischen Erzeugung klargelegt, bei welch 

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 letztereil-Glutaminsäure durch die Reaktion eines extrahierten Enzyms mit spezifischen Substraten synthetisiert wird. 



   Es wurde ein neuer, zur Familie Micrococcus gehörender Stamm entdeckt, der als Micrococcus'glutamicus bezeichnet wurde. Eine Kultur dieses Micrococcus wurde unter Nr. 13032 bei der American Type Culture Collection in Washington hinterlegt. Im folgenden wird eine allgemeine Charakteristik für diesen Stamm gegeben. Die meisten Teste wurden übereinstimmend mit dem" Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" (Society of American Bacteriologists,   9th edition) durchgeführt.   



   A Morphologische Feststellungen :
I. Mikroskopische Beobachtungen: (Nähragar. 37 C,18 Stunden)
1. Form : Micrococci, einzeln, in Paaren oder unregelmässig massiert auftretend, kugelig oder leicht elliptisch. Grösse überwiegend zwischen 0,6 und 1, 2 Mikron. 



   2.   Bewegungsfähigkeit : keine  
3. Sporen : keine
4.   Gram-Färbung :   positiv. 



   II.   Agar-Strichkultur :   (Nähragar, 370 C. 18 Stunden)
1. Wachstum : mässig
2. Wachstumsform : famartig
3. Glanz : matt
4. Farbbildung : milchig weiss bis schwach gelbweiss
5. Geruch : fehlt
6.   Konsistenz : butterartig   bis wenig klebrig   7.   Farbe des Mediums : unverändert. 



   III.   Agarkoloniem (Nähragar, 370   C, 20 Stunden)
1. Form : kreisförmig
2.   Oberfläche : glatt  
3. Rand : vollständig
4. Elevation : schwach erhaben
5. Optische Eigenschaft : opak. 



   IV. Agar Stichkultur : (Nähragar, 370 C, 20 Stunden)
1. Wachstum : am besten an der Spitze. 



   V.   Nährbrühe (370   C, 18 Stunden) :
1.   Oberflächenwachstum :   Ring
2.   Trübung :   schwach
3. Geruch : fehlt
4. Sediment : flockig, spärlich
B. Physiologische Eigenschaften : 
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 schen 27-370 C, Optimum etwa 30  C 2. Sauerstoff : streng aerob 3. Nitratreduktion : stark 4. Indolproduktion : fehlt 5. Schwefelwasserstoff : wird nicht erzeugt 6. Indikatorreduktion : Methylenblau, 2, 6-Dichlorphenolindophenol, Janusgrün, 2,3, 5-Triphenyl- tetrazolchlorid werden reduziert. 



  7.   Gelatinverflüssigung : negativ   oder sehr schwach 8.   Caseindigestion :   schwach 9.   Voges-Proskauer-Reaktion :   negativ 10. Methylrot-Reaktion : leicht sauer 11.   Zitronensäureausnützung : negativ   12.   Stärkeverflüssigung :   keine 13. Milch : keine Änderung oder schwach alkalisch 14. Katalase : sehr schwach 15. Urease: stark 
 EMI2.2 
 

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 EMI3.1 
 
Glutaminsäure- Dehydrogenase - Aktivität : sehr starkSäuren 18.

   Zuckerfermentation : 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Säure <SEP> Gas
<tb> Arabinose <SEP> 
<tb> Xylose
<tb> Glucose <SEP> +
<tb> Fruktose <SEP> +
<tb> Galaktose
<tb> Mannose <SEP> +
<tb> Laktose
<tb> Dextrin
<tb> Glycerin
<tb> Sukrose <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Trehalose
<tb> Raffinose
<tb> Melecitose
<tb> Stärke
<tb> Mannitol
<tb> Sorbitol
<tb> Salien
<tb> Inulin
<tb> Glykogen
<tb> 
 
Auf Grund dieser Eigenschaften und Beobachtungen wurde erkannt, dass der untersuchte Stamm eine neue Art der Familie Micrococcus ist, nachdem er mit keinem der in Bergey's Manual verzeichneten Stämme identifiziert werden konnte. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist nun im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass   der als   Micrococcus glutamicus bezeichnete Microorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Kohlehydrat und anorganisch bzw. organisch gebundenen Stickstoff, sowie gegebenenfalls anorganische Salze enthaltenden Substrat kultiviert wird und der PH-Wert des Substrates durch Zusatz neutralisierender Agentien zwischen 6 und 9, gehalten wird, wonach die gebildete   1-Glutaminsäure   bzw. deren Salze in bekannter Weise vom Substrat abgetrennt werden. 



   Das Substrat kann eine der für die Züchtung eines Micrococcus bekannte : Zusammensetzung haben. 



  Als Kohlehydrate können irgendwelche der in der Tabelle angeführten fermentierbaren Zuckersorten verwendet werden. Als Beispiele für derartige fermentierbare Zuckersorten seien besonders genannt : Glukose, Fruktose, Sukrose, Maltose, Xylose und hydrolysierte Stärke. Die Auswahl der Stickstoff enthaltenden Substanzen und anderer Nährstoffe ist nicht so eng begrenzt, wie etwa die der Kohlenstoffquellen. Um einen kräftigen Kohlehydratmetabolismus der Kultur zu erzielen, können verschiedene organisch bzw. anorganisch gebundenen Stickstoff enthaltende Substanzen, wie z. B. Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, Pepton, Amine, Abguss von Getreideweiche, hydrolysiertes Kasein, Fischmehl, Fleischextraktund Sojabohnenmehl verwendet werden und dem Kulturmedium können verschiedene, vom Organismus verlangte mineralische Stoffe zugesetzt werden.

   Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei 27-300 C inokuliert und vermehrt. Organische Säuren neigen dazu, sich während der Fermentation anzureichern und das Medium sauer zu machen. Es wurde gefunden, dass die Bildung von 1-Glutaminsäure vom PH-Wert während der Fermentation wesentlich beeinflusst wird. Die Bildung von   1-Glutaminsäure   wird gefördert, wenn der PH-Wert zwischen 6,0 und 9,0 gehalten wird, das Optimum dürfte bei einem PH-Wert von etwa 7,0 bis 8,5 liegen. Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird der PH-Wert durch Zusatz einer Verbindung, die ein basisches Stickstoffradikal enthält, wie z. B. eines Ammoniumsalzes, eines Amins oder eines Aminderivates, auf einen Bereich von 6,5 bis 8,5 eingestellt und auf dieser Höhe gehalten.

   Auf diese Weise wird unter der katalytischen Wirkung der stark reduktiven Aminierung der im Stamm enthaltenen   1-Glutaminsäure-Dehydrogenase   die   einmal gebildete (x-Ketoglutarsäure   mit dem vom'zugesetzten basischen Stickstoffradikal   herkommenden Ammoniumion reagieren, wobei 1-Glutaminsäure entsteht.   Zufolge der stark reduktiven A minierungswirkung der   1-Glutaminsäure-Dehydrogenase   des erfindungsgemäss verwendeten Stammes und durch die Erhaltung des pH-Wertes im optimalen Bereich werden störende Nebenreaktionen weitgehend zurückgedrängt, so dass die   l-Glutaminsäurebildung   die Nebenreaktionen über- 

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 wiegt und sich diese Säure stark anreichert. 



   Für die Neutralisierung des Kulturmediums sind verschiedene Verfahren verwendbar. In einem Falle wird dem Medium die erforderliche Menge Ammoniumionen zugeführt ; auch die Zufuhr einer Kombination von Ammoniumsalzen und Alkalien ist möglich. Für alle Fälle dürfen die bei der Kultivierung eingehaltenen Bedingungen sich nicht zu stark von jenen entfernen, die für das Wachstum des verwendeten Stammes geeignet sind. 



   Die im Substrat angereicherte   1-Glutaminsäure   oder ihre Salze werden aufbekannteweise gewonnen, z. B. mit einem ionenaustauschenden Harz. Derartige Verfahren bilden keinen Teil der Erfindung. 



   Die nachfolgend angeführten Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung. 



     Beispiel l :   Schüttelkultur-Fermentation mit einem synthetischen Medium. 
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 tung geschüttelt. Das Fermentationsmedium hatte folgende   Zusammensetzung :  
Glukose 50 g, Harnstoff 8 g,   KHPO     0,   5 g,   MgS04'7H20   0, 1 g und FeCI. 6H20 5 mg/l. 



   Tabelle I zeigt die analytischen Ergebnisse : 
Tabelle I 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Kultivierungs- <SEP> Kultivierungs- <SEP> pH <SEP> Restglukose <SEP> 1-Glutaminsäure <SEP> Ausbeute, <SEP> betemperatur <SEP>  C <SEP> dauer <SEP> Tag <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> zogen <SEP> auf
<tb> verbrauchte
<tb> Glukose <SEP> %
<tb> 33 <SEP> 1 <SEP> 8,6 <SEP> 2,8 <SEP> 660 <SEP> 30,0
<tb> 2 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 700 <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 28 <SEP> 2 <SEP> 8, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 610 <SEP> 22, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 3 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 810 <SEP> 21, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> 4 <SEP> 8,7 <SEP> 0,2 <SEP> 1130 <SEP> 23,5
<tb> 
 B e i s p i e l 2: Schüttelkulturfermentation mit komplexem Medium. 



  Inokulum und Verfahren waren die gleichen wie in Beispiel 1. Das Fermentationsmedium hatte fol- 
 EMI4.3 
 



  Tabelle II zeigt die analytischen Ergebnisse :
Tabelle Il 
 EMI4.4 
 
<tb> 
<tb> Kultivierungs- <SEP> pH <SEP> Restglukose <SEP> 1-Glutaminsäure <SEP> Ausbeute <SEP> in <SEP> %,
<tb> dauer, <SEP> Tage <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> bezogen <SEP> auf
<tb> verbrauchte
<tb> Glukose
<tb> 1 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 370 <SEP> 13,6
<tb> 2 <SEP> 8,2 <SEP> 5,5 <SEP> 1280 <SEP> 28,4
<tb> 3 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 1960 <SEP> 30,1
<tb> 4 <SEP> 6,2 <SEP> 2,9 <SEP> 2480 <SEP> 35,2
<tb> 
 
Die angeführten Beispiele sind nur illustrativ. Es können auch verschiedene andere Zuckerarten sowie verschiedene organische oder anorganische, Stickstoff enthaltende Substanzen verwendet werden.

   Z.B. können an Stelle der angegebenen Nährstoffe für das in Beispiel 2 angeführte Fermentationsmedium nachfolgende Substanzen verwendet werden: Ammoinak, Ammoniumsalze wie Ammonchlorid, -sulfat, -kar- 

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 boat, -azetat usw., ferner Peptone, digestiertes Sojabohnenmehl, digestiertes Fischmehl, hydrolysiertes Casein, Abguss von Getreideweiche (Corn-steep-liquor) usw. 



   Aus den Ausführungen geht hervor, dass sowohl in einem Medium, welches anorganisch gebundenen Stickstoff als auch in einem Medium, welches organisch gebundenen Stickstoff enthält,   20-30o   konsumierter Zucker in   1-Glutaminsäure   übergeführt werden kann. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung von   1-Glutaminsäure   bzw. deren Salzen, durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass ein neuer als Micrococcus glutamicus definierter Stamm (Nr. 13032 ATCC) unter aeroben Bedingungen in einem Kohlehydrat und anorganisch bzw. organisch gebundenen Stickstoff, sowie gegebenenfalls anorganische Salze enthaltenden Substrat kultiviert wird und der pH-Wert des Substrates durch Zusatz neutralisierender Agentien zwischen 6 und 9 gehalten wird, wonach die gebildete   1-luta-   minsäure bzw. deren Salze in bekannter Weise vom Substrat abgetrennt wird.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat wenigstens eines der folgenden Kohlehydrate enthält : Glukose, Fruktose, Sukrose, Maltose, Xylose : hydrolysierte Stärke.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat als Stickstoffquelle wenigstens eine der Substanzen Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, Pepton, Abguss von Getreideweiche, hydrolysiertesCasein, digestiertes Fischmehl, Fleischextrakt, digestiertes Sojabohnenmehl, enthält.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Neutralisationsmittel Ammoniak verwendet wird.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Neutralisationsmittel Harnstoff verwendet wird.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Neutralisationsmittel ein Ammoniumsalz, ein Amin oder ein Aminderivat verwendet wird.

   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Neutralisationsmittel ein Alkalihydroxyd verwendet wird.