Verfahren zur Herstellung von Vitamin Bit Es ist bekannt, Vitamin B12 mit Hilfe von Bak terien und Pilzen unter Verwendung verschiedenarti ger Stämme, Nährmedien und Fermentierungsbedin- gungen herzustellen. Die bisher zu diesem Zweck ver wendeten Organismen gehörten alle zu den Arten, welche als psychrophil oder mesophil bezeichnet wer den, die ein optimales Wachstum bei Temperaturen zeigen, welche im Bereich von ungefähr der Körper temperatur des Menschen, das heisst etwa 37 C, bis hinunter auf etwa 15-20 C liegen.
Die Ausbeuten, welche mit Hilfe dieser Arten von Organismen erzielt wurden, waren bescheiden, und da im genannten Temperaturbereiche auch andere, unerwünschte Or- ganismenarten gut gedeihen, musste man in allen Fäl len beim ersten Mal mit sterilisierten Kulturmedien arbeiten und grosse Vorsicht walten lassen, um wäh rend dem Fermentieren sterile Bedingungen aufrecht zuerhalten.
Es wurde nun gefunden, dass zahlreiche Stämme von thermophilen Microorganismen imstande sind, Vitamin B12 in im Vergleich zu den früher verwen deten andern Organismenarten erhöhter Ausbeute zu liefern. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Nährmedium einen Vitamin B12 erzeugenden Stamm eines thermo- philen Microorganismus bei gewöhnlicher oder er höhter Temperatur kultiviert.
Als Vitamin B12 erzeu gende thermophile Mieroorganismen kommen bei spielsweise thermophile Bakterien in Betracht. Diese Bakterien ermöglichen ein optimales Wachstum bei Temperaturen von beträchtlicher Höhe. Im allgemei nen entwickeln sie sich am besten, wenn man sie in dem Kulturmedium bei Temperaturen von etwa 45 bis 75 C züchtet.
Die Verwendung von thermophilen Microorga- nismen für die Herstellung von Vitamin B12 hat den grossen Vorteil gegenüber anderen Organismenarten, welche Vitamin B12 erzeugen, dass sie auch bei höhe ren Temperaturen gedeihen. Dementsprechend ist es bei Anwendung höherer Temperaturen möglich, mit Kulturmedien zu arbeiten, welche keine vorgängige Sterilisation erfordern und bei denen auch während des Züchtens keine sterilen Bedingungen eingehalten werden müssen, wobei trotzdem jegliche Verseuchung unterbleibt.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Ver fahrens liegt darin, dass die zur Erzeugung einer ge gebenen Menge von Vitaminen B12 erforderliche Zeit wesentlich kürzer ist als bei den bisherigen Verfahren.
Die Ausbeute an erfindungsgemäss erhaltenem Vitamin B12/Liter Kulturbrühe ist etwa 8- bis 10mal höher als die mit den bisherigen Verfahren erzielten Ausbeuten.
Vorzugsweise wird der Vitamin B12 erzeugende Stamm des thermophilen Microorganismus submers unter Belüftung bei Temperaturen im Bereich von etwa 45 bis 75 C, vorzugsweise unter Rühren, kulti viert, bis der maximale Gehalt an Vitamin B12 er reicht ist, worauf man aus dem Medium nach üblichen Methoden, z. B. durch Erhitzen, Säurezusatz und Ein dampfen, ein Vitamin-B1.-Konzentrat gewinnt, wel ches als Zusatz zu tierischer Nahrung verwendet wer den kann. Das erhaltene Vitamin B12 kann gereinigt werden, z. B. mittels Adsorptionsverfahren usw.
Geeignete, Vitamin B12 produzierende thermo- phile Mikroorganismen sind Stämme von thermo- philen Bazillenarten, vorzugsweise von Bacillus stea- rothermophilus und Bacillus coagulans.
Von den genannten Arten, welche allgemein un ter die Klassifikation von Bergeys Handbuch fallen, wurden zahlreiche spezielle Stämme isoliert, welche mit . unterschiedlichem Wirkungsgrad Vitamin B12 erzeugen. Ausser den genannten Arten können bei spielsweise auch Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus marcerand und Bacillus sphaericus verwen det werden.
Von gewissen Stämmen dieser Arten ist bekannt, dass sie bei Temperaturen oberhalb 450C gedeihen, und sie sind als Thermophile klassifiziert (Allen, M. B. 1953, The thermophilic aerobic spore- forming bacteria, Bacterial Evs. <I>17,</I> Seiten l25-173; Smith, N. R., R. E. Gordon und F. B. Clark, 1952, Aerobic sporeforming bacteria, U.
S. Dept. Agr. Monographie Nr. 16). Einige Stämme der genannten Bakterienarten wurden aus heissen Quellen, Geisern und ähnlichen Fundorten in Thermalgegenden in den Vereinigten Staaten von Amerika und in Cuba iso liert.
Es ist festzuhalten, dass von den oben erwähnten Bazillusarten die Arten Bacillus coagulans und Bacil- lus stearothermophilus besonders spezifische Thermo- phile sind und bei etwas höheren Temperaturen ge deihen als die andern genannten Arten, welche ge legentlich als adaptierte Stämme von mesophilen Bakterien betrachtet wurden, die fähig sind, sich noch bei Temperaturen oberhalb 450 C und bis auf 550 C zu entwickeln.
Die Arten coagulans und stearothermo- philus, welche bei Temperaturen von 60 bzw. 750 C gut gedeihen, weisen gegenüber den andern erwähn ten Arten gewisse Vorteile auf und werden im erfindungs gemässen Verfahren bevorzugt. Von den Arten, welche sich den Entwicklungsbedingungen bei höheren Tem peraturen angepasst haben, hat sich die Art Bacillus circulans und besonders ein spezieller Stamm davon, welcher hiernach noch näher beschrieben werden soll, als äusserst geeignet erwiesen, wobei bei relativ hohen Temperaturen im Bereich von etwa 550 C hohe Ausbeuten an Vitamin B12 erzielt werden konnten.
Zu den thermophilen Bakterien, welche sich für die Darstellung von Vitamin B12 hervorragend eignen, gehören: Bacillus stearothermophilus 194, hinterlegt in der American type culture collection und bezeichnet als ATCC 12986, isoliert aus Schlamm des Yellowstone- Geisers;
Bacillus coagulans 406, hinterlegt in der Ameri- can type culture collection und bezeichnet als ATCC 12989, isoliert aus Schlamm des Yellowstone-Geisers, und Bacillus coagulans 416, hinterlegt in der Ameri- can type culture collection und bezeichnet als ATCC 12990,
isoliert aus Wasser des Geisers von Old Faithful.
Ausserdem wurde gefunden, dass auch thermophile Bakterienstämme, welche aus tierischen Fäkalien iso liert wurden, für die Erzeugung von Vitamin B12 wertvoll sind. Ein hervorragendes Beispiel dieser Art von Organismen ist: Bacillus circulans CI 372, hinterlegt in der Ameri- can type culture collection und bezeichnet als ATCC 12994, isoliert aus Kuhmist.
Die vier oben genannten Stämme vermögen Vit amin B12 in Mengen von 3-6 mg/Liter in nichtsyntheti schem Medium und von 1-2 mglLiter in syntheti schem Medium zu erzeugen. Ausser den oben erwähnten Stämmen wurden zahlreiche weitere Stämme von thermophilen Orga nismen isoliert und untersucht, die zwar weniger wirk sam waren, aber nichtsdestoweniger Vitamin B12 in Mengen von mindestens 0,5 mg!Liter Medium er zeugten.
Zu diesen Stämmen gehören: B. stearothermophilus 1, 27, 32, 35, 63, 67, 72, 79, 90, 109, 137, 148, 149,<B>1</B>50, 152, 155 (ATCC <B>12987),160</B> (ATCC 12988), l67, 189, 195, 197, 202 und 203; B. coagulans Co 413, Co 432, Co 439, Co 467, Co 491; B. subtilis SU-381 (ATCC 12993); B. sphaericus SP-312 (ATCC 12992); B. macerans M-314 (ATCC 12991).
Die für die Gewinnung von Vitamin B1., bevor zugten Stämme werden im folgenden in ihren mor phologischen, züchterischen und biochemischen Eigen schaften näher beschrieben: Bacillus stearotherynophilus <I>194</I> Dieser Bazillus zeigt, wenn er bei 45-70 C ge züchtet wird, folgende Eigenschaften:
Vegetative Stäb chen, 0,5-1,0 ls auf 2-4 li, beweglich, grampositiv, ältere Stäbchen zeigen unterschiedliche Gramfärbung; geschwellte Sporangien; Sporen 1-2 ji auf 1-2 ,<I>11,</I> manchmal oval, Sporenwand gewöhnlich färbbar; beim Züchten auf Agar keine besonderen Kolonien.
In der Nähragarkultur im schräggehaltenen Reagenz glas zeigt sich Opazität und rasche Ausbreitung; die Nährlösung zeigt gleichmässige Trübung; Citratprobe negativ; Hydrolyse von Stärke positiv; Bildung von Acetyl-methylcarbinol negativ; pH der Brühe 5-7, Optimum 6-6,5; Hydrolyse von Gelatine positiv;. Fermentierungstest: Glucose, Säure ohne Gasentwick lung in Gegenwart von Aminosäure.
Zuchttemperatur: gute Entwicklung bei 45-700 C, optimale Entwicklung bei etwa 550 C in chemisch definiertem Medium oder in Nährmedium, das zur Hälfte mit Wasser verdünnt und mit 0,5 % Caseinhydrolysat versetzt ist. Auf- bewahrungsbedingungen:
schräg im Reagenzglas an gelegte Agarkulturen aus 0,5 /e Polypepton (Balti- more Biological Laboratories) plus 0,5 % Fleisch- extrakt plus 2,5 0/a Agar können bei 40 C länger als 1 Jahr gelagert werden, ohne dass die Entwicklungs fähigkeit des Organismus im angegebenen Tempera turbereich beeinträchtigt wird.
Bacillus circulans Cl <I>372</I> Eigenschaften: vegetative Stäbchen 0,3-0,7 l1 auf 1,5-5 ,lt, Enden abgerundet, beweglich, grampositiv, zeitweise unterschiedliche Gramreaktion; geschwellte Sporangien; nierenförmige Sporen; Kolonien sich ausbreitend, opak; schräg im Reagenzglas angelegte Nähragarkulturen sind ausgebreitet und dicht; die Nährlösung ist leicht getrübt; Citratprobe negativ; Stärkehydrolyse positiv;
Bildung von Acetylmethyl- carbinol negativ; Fermentierungsversuch: Säure ohne Gas aus Glucose, Arabinose, Xylose und Sucrose; Hydrolyse von Gelatine positiv; Bildung von Indol negativ; bei Temperaturen von 28-45 C dürftiges Wachstum; gutes Wachstum bei 45-60 C.
Bacillzcs coagulans <I>406 und 416</I> Eigenschaften: vegetative Stäbchen, 0,5-1,5 ,u auf 2-5 l < ., beweglich, grampositiv; geschwellte Spor- angien bei Nr.406, nicht geschwellte bei Nr.416; opake Kolonien; schräg im Reagenzglas angelegte Nähragarkulturen rauh, opak und flach; Citratprobe negativ;
Hydrolyse von Stärke negativ bei 550 C, positiv nach 2wöchiger Inkubation; Fermentierungs- versuche: Säure aus Glucose, ohne Gas aus Glycerin und Saccharose; Hydrolyse von Gelatine schwach; optimales Wachstum beider Stämme bei 45-65 C, schwaches Wachstum bei 37-45 C;
Lagerungsbedin gungen: die Organismen können auf schräg im Rea genzglas angelegten Agarkulturen, welche 0,5 % Poly- pepton, 0,5 % Fleischextrakt und 2,5 % Agar ent- halten, bei 40 C über ein Jahr gehalten werden, ohne dass die Entwicklungsfähigkeit im angegebenen opti malen Temperaturbereich beeinträchtigt wird.
In einem nichtsynthetischen Kulturmedium erzeugt der Stamm 406 2-3 mg Vitamin B12/Liter, während der Stamm 416 3-6 mgILiter hervorbringt.
Die oben angeführten verschiedenen Stämme sind in ihren allgemeinen morphologischen und biochemi schen Eigenschaften ziemlich ähnlich. Es sind inten sive Aeroben, welche unter anaeroben Bedingungen ziemlich schlechtes Wachstum zeigen. Der optimale Temperaturbereich für ihre Entwicklung liegt zwi schen etwa 45 und 650 C. Bacillus stearothermophilus 194 kann indessen mit Vorteil auch bei Tempera turen von bis zu 750 C gezüchtet werden. Die In kubationszeiten betragen 8-72 Stunden.
Es hat sich herausgestellt, dass ein pH-Bereich von 5-8,5 geeignet ist; für optimale Erzeugung von Vit amin Bit ist ein pH-Bereich von etwa 6-7,5 indiziert, den man gegen das Ende der Brutperiode bis auf' pH 8-8,5 ansteigen lassen kann. Wenn der pH wäh rend der wirksamen Wachstumsperiode nicht im an gegebenen Bereich gehalten wird, so ist die Ausbeute an Vitamin B12 vermindert.
Der genannte pH-Bereich kann durch Zugabe irgendwelcher geeigneter Puffer aufrechterhalten werden; als am zweckmässigsten hat sich ein Puffer aus Aconitsäure und Triäthanolamin erwiesen, da dieser vom Stoffwechsel der Organismen nicht erfasst wird. Aus demselben Grund vermeidet man mit Vorteil die Verwendung von phosphathalti gen Puffern, welche assimiliert würden, eventuell unter Verlust der Pufferwirkung.
Die sterilen Bedingungen, welche sonst für das Züchten von Vitamin Bit erzeugenden Organismen erforderlich sind, brauchen beim Züchten der thermo- philen Organismen gemäss vorliegender Erfindung nicht eingehalten zu werden; gewünschtenfalls kann jedoch unter sterilen Bedingungen gearbeitet werden. Der Einfluss der thermophilen Zuchtbedingungen auf die Vermeidung einer Ansteckung durch Pilze und andere Fremdorganismen lässt sich experimentell zei gen.
Es wurden Versuche durchgeführt, bei denen Nähragar, welches mit Kulturen der genannten Thermophilen besät war, bei Zimmertemperatur einen Tag lang der Luft des Laboratoriums ausgesetzt war. Nach einem Tag wurden die Schalen bei 37, 55 bzw. 750C bebrütet. Nach 18stündiger Inkubation zeigte die bei 370 C gehaltene Schale starkes Wachstum von Pilzen und andern Fremdorganismen. Auf den bei 55 und 75 C gehaltenen Schalen hatten sich nur die Thermophilen und keine Fremdorganismen entwickelt.
Wie erwähnt, können die thermophilen Vitamin B12 erzeugenden Microorganismen sowohl in nicht synthetischen als auch in synthetischen Kulturmedien gezüchtet werden, indem man eine Tauchkultur im ruhenden Medium so stark belüftet, wie es zur Auf rechterhaltung aerober Bedingungen erforderlich ist. In jedem Falle ist es wichtig, dass das verwendete Me dium alle für das Wachstum erforderlichen Kompo nenten, inbegriffen Mineralsalze, Spurenelemente, Aminosäuren und dergleichen, enthält. Diese Kompo nenten können zum Teil durch gebräuchliche Zucht medien geliefert werden.
Als solche Zuchtmedien be vorzugt man Getreideweiche, Gersten-, Kartoffel-, Reis- und andere Getreidekonzentrate.
Zur Zubereitung eines nichtsynthetischen Kultur mediums wird vorzugsweise Getreideweiche verwen det. Solche Getreideweiche besitzt im allgemeinen fol genden Vitamingehalt: Riboflavin 5 y/g Nikotinsäure 819 y/g Pantothensäure 23,8 y/g Pyridoxin 19,1 y/g Biotin 0,125 y/g Sie enthält ferner folgende Aminosäuren:
EMI0003.0070
Aminosäure
<tb> Aminosäure <SEP> (hydrolysiert)
<tb> Leucin <SEP> 4,78
<tb> Isoleucin <SEP> 2,77
<tb> Valin <SEP> 2,81
<tb> Glutaminsäure <SEP> 7,28
<tb> Threonin <SEP> 2,54
<tb> Lysin <SEP> 1,80
<tb> Arginin <SEP> 2,23
<tb> Histidin <SEP> 2,18
<tb> Prolin <SEP> 3,39
<tb> Phenylalanin <SEP> 2,10
<tb> Methionin <SEP> 0,00
<tb> Asparaginsäure <SEP> 1,39
<tb> Cystin <SEP> 0,91
<tb> Alanin <SEP> 15,33
<tb> Tyrosin <SEP> 0,78
<tb> Ammoniak <SEP> 1,34 Ein nichtsynthetisches Medium, welches sich für die Zucht von -thermophilen Bakterien eignet, kann wie folgt zusammengestellt werden:
Getreideweiche 5 cm3 Natriumcyanid 2 mg Cobaltion (als CoS04 ' 7H20) 4 mg Zitronensäure 100 mg Triäthanolamin 300 mg Kaliumhydroxyd bis auf pH 6,0 destilliertes Wasser bis auf<B>100</B> cm3 Obwohl eine Sterilisation nicht nötig ist, kann das verwendete Medium sterilisiert werden, indem man es 30 Minuten lang bei einem Überdruck von 1 kglcm2 auf etwa 118-120 C erhitzt.
Ein weiteres geeignetes Kulturmedium basiert auf Hefeextrakt oder L-Glutaminsäure als Aminosäure quelle, wobei man die Spurenelemente in Form eines Gemisches von Metallverbindungen der folgenden Zu sammensetzung beigibt: Äthylendiamin-tetraessigsäure 2,5 g ZIIS04 7 1-120 17,6 g MilS04 H20 9,22 g CuS04 - 5 H20 0,98 g FeSO4(NH4)2S04 ' 6H20 0,7 g H3B03 0,571 g COS04 * 7H20 0,19 g destilliertes Wasser auf 1000 cm3 <I>Beispiel 1</I> Es wurde ein Medium hergestellt,
indem man 800 cm-' der oben beschriebenen Brühe in 4 Roux- Kolben von je 4 Liter Fassungsvermögen gab und mit Bacillus coagulans 416 (ATCC <B>12990)</B> impfte. Es wurde unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Rühren war nicht erforderlich, wenn die Kolben so gestellt wurden, dass sie eine maximale Luftoberfläche boten. Nach 18stündigem Züchten bei 55 C stellte man den pH mit Citronensäure auf 4,5.
Nach Beendigung der Brutperiode und Einstellen des pH wie angeführt, setzte man 1,0 mg Natriummetabisulfitlcm3 Kultur brühe zu, um zum Schutze des freigesetzten, an Pro tein gebundenen Vitamins B12 reduzierende Bedin gungen zu schaffen. Das an Protein gebundene Vit amin B12 wird dann freigesetzt, indem man die bazil- lenhaltige Brühe 30 Minuten lang im Autoklaven auf 118 C erhitzt. Der Gehalt an Vitamin B12 wurde nach einer gegenüber der vorgeschlagenen USP- Methode (U.
S. Pharmacopöe, XIV, 3. Ergänzung, 15-19) abgewandelten Methode bestimmt unter Ver wendung von drei verschiedenen Testorganismen zu Vergleichszwecken. Diese Organismen waren Lacto- bacillus leichmannü ATCC 4792, Euglenia gracilis (Z-Stamm) und Ochromonas malhamensis (Prings- heim-Stamm). Die mittlere Ausbeute betrug zwischen 3 und 6 mg Vitamin B"/Liter Kulturmedium.
Das Vitamin B12 wurde aus der Kulturbrühe nach üblichen Verfahren isoliert. Beispielsweise kann man das aus dem Autoklaven kommende Material auf dem Trom meltrockner bei 40 C trocknen zur Gewinnung eines Tierfutter-Zusatzes. Es sei festgehalten, dass während der Zucht und Ausbeute ihr Maximum nach 8 Stun den zu erreichen beginnt. Zu dieser Zeit liegt der pH immer noch wie ursprünglich bei 6. Nach 12 Stunden ist die Erzeugung von Vitamin B12 leicht höher als nach 8 Stunden, und der pH der Brühe ist auf 7,5 angestiegen.
Die Ausbeute erreicht ihr Maximum nach etwa 18 Stunden, nachdem der pH 8 bis 8,2 erreicht hat. Das Züchten kann bis zu 72 Stunden lang fortgesetzt werden, wobei man aber den pH nicht auf über 8,2 ansteigen lassen soll, damit maximale Ausbeute erreicht wird.
<I>Beispiel 2</I> Es wurde ein Medium hergestellt, indem man 800 cm?, der oben beschriebenen Brühe in 4 Roux- Kolben von je 4 Liter Fassungsvermögen gab und mit Bacillus stearothermophilus 194 (ATCC 12986) impfte. Das Züchten erfolgte unter aeroben Bedin gungen. Rühren war nicht nötig, wenn die Kolben so gestellt wurden, dass sie eine maximale Luftoberfläche boten. Nach 18stündigem Züchten bei 65 C wurde die Brühe mit Citronensäure auf pH 4,5 gestellt.
Nach Beendigung der Brutperiode und nach Einstellen des pH wie angegeben, setzte man 1,0 mg Natriummetabi- sulfit/em3 Kulturbrühe zu, um zum Schutze des freige setzten proteingebundenen Vitamins B12 reduzierende Bedingungen zu schaffen. Das proteingebundene Vit amin B12 wurde dann freigesetzt, indem man die bazillenartige Brühe 30 Minuten lang im Autoklaven auf 118 C erhitzte. Der Gehalt an Vitamin B12 wurde nach einer gegenüber der vorgeschlagenen USP- Methode (U.
S. Pharmacopöe, XIV, 3. Ergänzung, 15-19) modifizierten Methode bestimmt unter Ver wendung von drei verschiedenen Testorganismen zu Vergleichszwecken. Bei diesen Organismen handelte es- sich um Lactobacillus leichmannii ATCC 4792, Euglenia gracilis (Z-Stamm) und Ochromonas mal- hamensis (Pringsheim-Stamm). Die mittlere Ausbeute betrug 2-3 mg Vitamin B12/Liter Kulturmedium.
Das Vitamin B12 wurde aus der Brühe nach üblichen Ver fahren isoliert.
<I>Beispiel 3</I> Es wurde ein Medium hergestellt, indem man 800 cm3 der oben beschriebenen Brühe in 4 Roux- Kolben von je 4 Liter Fassungsvermögen gab und mit Bacillus coagulans 406 (ATCC 12989) impfte. Das Züchten erfolgte unter aeroben Bedingungen. Rühren war unnötig, wenn die Kolben so gestellt wurden, dass eine maximale Luftoberfläche bestand. Nach 18stün- digem Züchten bei 55 C wurde die Brühe mit Citro- nensäure auf pH 4,5 gestellt.
Nach Beendigung der Brutperiode und Einstellen des pH wie angegeben, fügte man 1,0 mg Natriummetabisulfit;cm3 Kultur brühe zu, um zum Schutze des freigesetzten protein gebundenen Vitamins B12 reduzierende Bedingungen zu schaffen. Das proteingebundene Vitamin B12 wird dann freigesetzt, indem man die bazillenhaltige Brühe 30 Minuten lang im Autoklaven auf 118 C erhitzt. Der Gehalt an Vitamin B12 wurde nach einer gegen über der vorgeschlagenen USP-Methode (U. S. Pharmacopöe, XIV, 3.
Ergänzung, 15-19) modifi zierten Methode bestimmt unter Verwendung von drei verschiedenen Testorganismen zu Vergleichszwecken. Bei diesen Organismen handelte es sich um Lacto- bacillus leichmannii ATCC 4792, Euglenia gracilis (Z-Stamm) und Ochromonas malhamensis (Prings- heim-Stamm). Die mittlere Ausbeute betrug zwischen 2 und 3 mg Vitamin B12/Liter Kulturmedium. Das Vitamin B12 wurde aus der Brühe nach üblichen Ver fahren isoliert.
<I>Beispiel 4</I> Es wurde ein Medium hergestellt, indem man 800 cm3 der oben beschriebenen Brühe in 4 Roux- Kolben von je 4 Liter Fassungsvermögen gab und mit Bacillus circulans CI 372 (ATCC 12994) impfte. Das Züchten erfolgte unter aeroben Bedingungen. Rühren war nicht erforderlich, wenn die Kolben so gestellt wurden, dass sie eine maximale Luftoberfläche boten. Nach 18stündigem Züchten bei 55 C wurde die Brühe mit Citronensäure auf pH 4,5 gestellt.
Nach Beendigung der Brutperiode und Einstellen des pH wie angegeben, setzte man 1,0 mg Natriummeta- bisulfit/cm3 Kulturbrühe zu, um zum Schutze des freigesetzten proteingebundenen Vitamins B12 redu zierende Bedingungen zu schaffen. Das proteingebun dene Vitamin B12 wird dann freigesetzt, indem man die bazillenhaltige Brühe 30 Minuten lang im Auto klaven auf 118 ' C erhitzt. Der Gehalt an Vitamin B12 wurde nach einer gegenüber der vorgeschlagenen USP- Methode (U.S. Pharmacopöe, XIV, 3.
Ergänzung,<B>15</B> bis 19) modifizierten Methode bestimmt unter Verwendung von drei verschiedenen Testorganismen zu Vergleichs zwecken. Bei diesen Organismen handelte es sich um Lactobacillus leichmannii ATCC 4792, Euglenia gracilis (Z-Stamm) und Ochromonas malhamensis (Pringsheim-Stamm). Die mittlere Ausbeute betrug 3-6 mg Vitamin B12/Liter Kulturmedium. Das Vit amin B12 wurde aus der Brühe nach üblichen Verfah ren isoliert.
<I>Beispiel S</I> Als synthetisches Medium wurde folgendes Ge misch verwendet: Äthylendiamin-tetraessigsäure 0,05 g KH"P04 0;02 g Mg904 ' 7 H20 0,05 g Mo (als Ammoniummolybdat) 1,0 mg Lösung des Gemisches von Metallverbindungen 1,5 cm3 NH4C1 0,03 g Ca-Ion (als CaC12) 1,0 mg Aconitsäure (trans) 0,5 g Triäthanolamin 1,0 g Natriumacetat - 3 H20 0,04 g Glycerin 1;
0 g Kaliumgluconat 0,5 g NaCN 0,2 mg Natriummetabisulfit 0,1 g Bernsteinsäure 0,05 g destilliertes Wasser 10.0 cm3 Diesem Gemisch kann L-Glutaminsäure in Men gen von 0,01 bis 1,0 g/100 cm3 des Mediums zu gesetzt werden. Anderseits kann man Hefeextrakt in einer Menge von etwa 0,5 g/100 cm3 Medium zu geben. Es können auch zusätzliche Mengen Na- triumcyanid und Cobaltion zugefügt werden.
Unter Verwendung von etwa 800 mg dieses syn thetischen Mediums, welchem man 1,0 g Glutamin säure/100 cm3 zusetzte und das man mit Bacillus circulans CI 372 impfte und zunächst bei einem pH von etwa 6,5 hielt, welcher dann gegen Ende der Brutperiode auf etwa pH 8 anstieg, erhielt man Vit amin B12 in einer Ausbeute von 1 mgJLiter Medium.