DE1517785C - Verfahren zum Züchten von Hefen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Hefen unter üblichen Bedingungen in einem n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Hefe Trichosporon japonicum ATCC 20002, ATCC 20003 oder ATCC 20004 einsetzt.

Es ist bereits bekannt, Futter- und andere Nährhefen durch Vergärung von Kohlenhydraten, wie Melassen, Holzhydrolysaten und Sulfitablaugen, herzustellen. In jüngster Zeit wurden bereits Untersuchungen angestellt, Hefen unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffs an Stelle eines Kohlenhydrats als Kohlenstoffquelle zu züchten. Es wurden nun neue Hefeßtämme gefunden, die in einem Nährmedium, welches als Hauptkohlenstoffquelle n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe mit vorwiegend 10 bis 22 Kohlenstoffatomen enthält, wachsen.

Bei diesen neuen Hefestämmen handelt es sich um Trichosporon japonicum, denen die Inc. Nummern 20002, 20003 und 20004 der American Type Culture Collection zugeschrieben wurden.

Aus den folgenden Untersuchungsergebnissen ist es ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Hefestämme eine neue Art darstellen:

1. Befunde in der Malzkultur

25

Wenn die Hefen bei 25° C 3 Tage gezüchtet wurden, waren deren Zellen oval oder länglichoval und von einer Größe von 2,5 bis 4,0 χ 4,0 bis 20,0 Mikron.

Ringförmige oder kleine inselförmige Häutchen wurden an der Oberfläche der Kulturlösungen gebildet, und ein baumwollartiges Sediment bildete sich im unteren Teil der Kulturlösung.

Nach einmonatiger Züchtung bildeten sich an der Oberfläche der Lösung gelbe viskose ausgedehnte Membranen.

2. Befunde in der Malzagarkultur

Wenn die Hefen bei 25° C 3 Tage gezüchtet wurden, war das Aussehen der Zellen das gleiche wie in der obenerwähnten Malzkultur; die Kolonien waren rötlichbraun, cremig und leicht konvex, der Rand war glatt oder wellig. Die Farbe der Kolonien war nicht durch Carotinoide bedingt. '

·-. ■ ..·. 3. Schnittkultur, ■ ■.

Das Pseudomycel entwickelte sich gut; gut ausgebildet waren auch Arthrosporen und Blastosporen.

50 4. Physikalische Eigenschaften

1. Optimale Züchtungsbedingungen: pH 5,2; Temperatur 30⁰C; aerob.

2. Bedingungen, unter denen die Hefen wachsen konnten: pH 4,0 bis 6,8; Temperatur 20 bis 40⁰C;, aerob.

3. Assimilation und Nitratreduktion: keine.

4. Koagulation von Milch: keine.

5. Reduktion von Pigmenten: keine.

6. Osmophilizität (in einem Kulturmedium von 10% NaCl): keine.

7. Verflüssigung von Gelatine: keine.

8. Vitaminbedarf: keiner. .

9. Carotinoidbildung: keine.

5. Assimilation von Stickstoffverbindungen

Die Hefen assimilierten Peptone, Ammoniumsulfat, Asparagin und Harnstoff. *

6. Assimilation von Kohlenstoffverbindungen

Die Hefen assimilierten Glucose, Galactose, Saccharose und Salicin, assimilierten jedoch nicht Mannose, Fructose, Lactose, Maltose, Trehalose, Raffinose, Äsculin, a-Methylglucosid, Dextrin, Stärke, Inulin, Melibiose, Xylose, Arabinose und Rhamnose.

7. Äthylalkohol als einzige Kohlenstoffquelle wurde nicht assimiliert.

8. Kerosin als-einzige Kohlenstoffquelle wurde assimiliert.

9. Lackmusmilchtest: Milch wurde peptonisiert.

10. Sie konnten aus der öligen Phase eines Petroleumtreibstofftanks od. dgl. isoliert werden.

Beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hefestämme mit denen, die in der Literaturstelle J. Lodder et al.·, »The Yeast, a taxonomic study« (1952),-beschrieben sind, wird gefunden, daß die erfindungsgemäßen Hefestämme zu den Trichosporon gehören. In dem genannten Werk ist jedoch kein Stamm erwähnt, der mit den erfindungsgemäßen Hefestämmen identisch ist. Das heißt also, daß die erfindungsgemäßen Hefestämme mit den bekannten Arten Trichosporon sericeum und Trichosporon capitatum verwandt sind, sich von diesen jedoch eindeutig in bezug auf die Assimilation von Saccharose und die Bildung einer nicht carotinoiden rötlichbraunen Farbe unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Hefestämme wurden Trichosporon japonicum genannt.

Das von den erfindungsgemäßen Hefestämmen assimilierte Nährmedium soll reich an n-Paraffin-Kohlenwasserstoffen sein; n-paraffinische Kohlenwasserstoffgemische, die andere Kohlenwasserstoffe, wie naphthenische und aromatische Kohlenwasserstoffe, enthalten, können jedoch auch verwendet werden.

Im allgemeinen greifen naphthenische und aromatische Kohlenwasserstoffe in das Wachstum von Hefen im Wachstumsprozeß nicht ein. Destillate von Rohölen,, wie Gasolin, Kerosin, Gasöl, Schweröl, oder irgendwelche andere Fraktionen können verwendet werden. Vorzugsweise werden solche Fraktionen verwendet, deren Gehalt an n-Paraffm-Kohlenwasserstoffen durch Molekularsiebtrennung angereichert y wurde.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Hefestämme liegt der Vorteil darin, daß sie bei Temperaturen von 30 bis 40° C gezüchtet werden können. Der calorische Wert der Kultur ist bei der Kohlenwasserstoffvergärung so hoch wie bei der Kohlenhydratvergärung. Bei der industriellen Herstellung von Zellen durch Vergärung von Kohlenwasserstoffen bei üblichen Gärtemperaturen ist daher eine Kühlvorrichtung mit Kühlwasserzirkulation von niedriger Temperatur erforderlich. Wo derartiges Kühlwasser von niedriger Temperatur nicht verfügbar ist, ist es unmöglich, die Zellen in industriellem Maßstab herzustellen.

Da aber die erfindungsgemäßen Hefestämme eine hohe optimale Wachstumstemperatur, wie 35 bis 4O⁰C, aufweisen, ist das Problem der Kühlung des gärenden Nährmediums sehr gering und somit die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur industriellen Herstellung von Hefezellen gegeben, denn keine andere

η-Paraffin-Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe weist eine derartige Hitzebeständigkeit auf.

Der Einfluß der Bebrütungstemperatur auf das Züchten von Hefekulturen soll hier an einem Vergleich der Züchtungsbedingungen für Trichosporon japonicum ATCC 20002 und der bekannten Art Candida gezeigt werden, deren Züchtung in der britischen Patentschrift 914 568 und in den USA.-Patentschriften 3 268 413, 3 268 414 und 3 268 419 beschrieben wird. Allgemein beobachtet man beim Züchten von Hefe mit Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle in einem Fermenter eine exotherme Reaktion. Ohne Kühlung würde die Temperatur des gärenden Nährmediums im Fermenter die optimale Bebrütungstemperatur der Hefe übersteigen. Man muß also Kühlwasser durch eine Tankummantelung oder eine Kühlschlange schicken.

Bei dem Vergleich von Trichosporon japonicum (Bebrütungstemperatur 38⁰C) mit Candida (Bebrütungstemperatur 30° C) bei gleicher Eingangstemperatür des Kühlwassers (26⁰C), wobei die Kühlwasser-Ausgangstemperatur für Trichosporon japonicum 32° C und die für Candida 28° C beträgt, zeigt sich unter Berücksichtigung der jeweiligen Bebrütungstemperatur und des Wärmeübertragungskoeffizienten, daß bei Candida eine dreimal so große wärmeaufnehmende Kühlfläche erforderlich ist wie bei den erfindungsgemäßen Stämmen von Trichosporon japonicum. Weiterhin folgt aus diesen Vergleichen, daß man beim Züchten der erfindungsgemäßen Stämme von Trichosporon japonicum nur mit einem Drittel der für Candida benötigten Kühlwassermenge auskommt.

	Sich erwärmende Fläche	Notwendige Kühlwasser menge
Erfindungsgemäße Stämme von Trichosporon japoni cum	1 3,01	1 3,0
Candida-Stämme des Stands der Technik

Das Nährmedium weist vorteilhafterweise einen Gehalt von 0,5 bis 20 Volumprozent Paraffin-Kohlen-Wasserstoffe auf. Es ist notwendig, dem Nährmedium einen Wachstumsfaktor und auch anorganische Salze zuzusetzen. Als Wachstumsfaktor wird eine geringe Menge eines üblichen Hefeextrakts, Maisquellwasser, Reiskleieextrakt, Melasse oder irgendein anderes industrielles Produkt, das reich an Vitaminen der Gruppe B ist, oder auch direkt Vitamine der Gruppe B eingesetzt. Die zugefügte Menge beträgt etwa 0,01 bis^v 0,5% des gesamten Nährmediums. Sie kann jedoch auch in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen der Hefe nach Belieben eingestellt werden.

Als anorganische Salze werden verwendet: Magnesiumsulfat, Natriumdihydrogenphosphat und Käliumdihydrogenphosphat als Magnesium- und Phosphorquellen und Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, ■ Diammoniumhydrogenphosphat, Harnstoff, flüssiger Ammoniak und Ammoniakwasser als Stickstoffquellen und Kaliumchlorid als Kaliumquelle. ·

Der pH-Wert des Nährmediums wird im Bereich von 4 bis -7 gehalten. Im allgemeinen erniedrigt sich der pH-Wert der Kulturlösung mit dem Wachstum der Hefe. Wenn jedoch Harnstoff als Stickstoffquelle verwendet wird, erniedrigt sich der pH-Wert nicht.

Im Bedarfsfalle kann irgendein entsprechendes Ammoniumsalz — auch kontinuierlich — zur Korrektur des pH-Wertes dem gärenden Nährmedium zugesetzt werden.

Da n-Paraffin-Kohlenwasserstoff an Stelle eines Kohlenhydrats als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, muß der für das Zellwachstum erforderliche Sauerstoff dauernd in das gärende Nährmedium eingeblasen werden. Für diesen Zweck kann Luft verwendet werden. Diese kann in das gärende Nährmedium nach irgendeiner bekannten Methode eingebracht und dispergiert werden.

Um eine Schaumbildung im Fermenter zu unterbinden, kann irgendein allgemein bekanntes Antischaummittel verwendet werden.

Die Bebrütungszeit beträgt meistens weniger als 3 Tage. Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.- · '

Um die Hefe vom vergorenen Nährmedium abzutrennen,, können die bekannten Methoden des Zentrifugierens angewandt werden.

Um jedoch die Kohlenwasserstoffe von der erhaltenen Hefe vollständig zu entfernen, muß die Hefe wiederholt mit irgendeinem bekannten Waschmittel gewaschen werden.

Wenn außerdem die noch Kohlenwasserstoffe enthaltende Hefe mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert und anschließend durch Zugabe eines Waschmittels und schließlich mit Wasser gewaschen wird, ist es möglich, eine Hefe herzustellen, die auch keinen Geruch nach Kohlenwasserstoffen, mehr aufweist. .

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Das Eiweiß, Fett, die Vitamine, Nucleinsäuren und die Kohlenhydrate der erfindungsgemäß gewonnenen Hefen sind vergleichbar mit den Bestandteilen in einer bekannten üblichen Hefe. Die erfindungsgemäß gewonnenen Hefen enthalten einen hohen Gehalt an Wachstumsfaktoren und stellen somit eine gute. Energiequelle für Nahrungs-und Futtermittel dar.

Beispiell

Jeder der drei der n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefestämme Trichosporon japonicum ATCC 20002, ATCC 20003 und ATCC 20004 wurde zunächst einzeln in einem Malz-Agar-Nährmedium gezüchtet. Dann wurde der jeweilige Hefestamm in ein normales n- Paraffin-Agar-Nährmedium eingeimpft, das hergestellt wurde durch Lösen von 2 g Ammoniumchlorid, 0,4 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0;5g Magnesiumsulfat, 2 g Natriumchlorid und 1 g Hefeextrakt in 11 Leitungswasser, Lösen von 20 g Agar in diesem Gemisch, Einstellen ..des pH-Wertes auf 5 und anschließende Zugabevon 30 Volumprozent n-Paraffin-Kohlenwasserstoffen mit 15 bis 22 Kohlenstoffatomen zu diesem Gemisch. Nach anschließendem üblichem Sterilisieren und Koagulieren .wurde bei 30° C bebrütet, um eine Gewöhnung der. Hefestämme an die n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe zu erzielen/Diese Arbeitsweise wurde fünfmal wiederholt. Auf diese Weise erlangten die an die n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe gewöhnten Hefestämme eine stabile Eigenschaft zur Assimilierung von n-Paraffin-Kohlenwasserstoffen.

Die weitere Züchtung — als Schüttelkultur — wurde wie folgt durchgeführt.

Es wurden 50 ml Kulturlösung hergestellt, indem 4 g Harnstoff, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2 g Magnesiumsulfat, 0,01 g Ferrosulfat und 1 g Melasse in 11 Leitungswasser gelöst wurden. Der pH-Wert dieses Ausgangsmediums wurde auf 5 eingestellt. Hinzugegeben wurden des weiteren 2 Volumprozent n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe (ein Gemisch aus C₁₅ bis C₂₂). Das Ganze wurde in einen Schüttelkolben von 500 ml Volumen geschüttelt und sterilisiert. Die an das obenerwähnte η-Paraffin-Agarnährmedium gewöhnten und in ihm gezüchteten Hefestämme wurden in dieses Nährmedium übergeimpft und das beimpfte Nährmedium 45 Stunden geschüttelt. Die Ausbeuten an trockener Hefe bei Bebrütungstemperaturen von 30, 35 und 37° C wurden bestimmt, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Als Kontrollen wurden die Ausbeuten an trockener Hefe bei 30, 35 und 37° C an jeder der n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefearten Candida rugosa und Candida tropicalis bestimmt, die an ein n-Paraffin-Agarnährmedium in genau der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gewöhnt und in ihm gezüchtet wurden.

Tabelle I

Hochtemperaturkultur von Trichosporon japonicum

(Menge an trockener Hefe in mg/100 ml Kulturlösung)

30

	300C	35°C	37°c
Trichosporon japonicum
ATCC 20002	1550	1533	1583
ATCC 20003	1465'	1508	1527
ATCC 20004	1503	1588	1591
Candida rugosa	1119	703	358
Candida tropicalis ....	956	316	128

35

Die Analysenergebnisse der Zellzusammensetzung von Trichosporon japonicum ATCC 20002, die nach den obigen Versuchen erhalten wurden, sind im folgenden wiedergegeben:

Tabelle II

Analysenwerte

Feuchtigkeit 9,3%

Rohprotein 45,4%

Rohfett . 6,9%

Rohfasern 4,4%

Rohasche -.. 5,5%

Stickstofffreier Extrakt 28,5%.

Tabelle III

Aminosäurezusammensetzung (g Aminosäure/100 g Protein)

Tryptophan 2,41

Lysin 7,81

Histidin 1,83

Arginin 4,78

Asparaginsäure 3,87

Threonin 6,76

Serin 2,16

Glutaminsäure 4,41

Prolin '.... 1,89

Glycin 4,99

Alanin 2,62

Valin 5,50

Methionin 1,20

Isoleucin 5,07

Leucin 7,45

Tyrosin 1,91

Phenylalanin ,. 6,23

B e i s ρ i e 1 2

1 einer Kulturlösung des n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefestammes Trichosporon japonicum ATCC 20002 wurde durch Schütteln der Kultur in einem Kolben in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten, außer daß die Züchtungstemperatur 37⁰C betrug. Diese Kulturlösung wurde dann als Impfstoff in einen Fermenter mit einer Kapazität von 201 geschüttelt und belüftet. eines-Nährmediums, das hergestellt wurde durch Lösen von 0,61% Ammoniumsulfat, 0,04% Natriumdihydfogenphosphat, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat und 5 Volumprozent Reiskleie-Extrakt und Einstellen des pH-Wertes auf 5, waren in üblicher Weise vorher in dem Fermenter sterilisiert worden. Das obenerwähnte Impfgut wurde steril zu diesem Nährmedium gegeben. Die Züchtung erfolgte, als Schüttelkultur bei 450 UpM, durch Belüftung niit einer Geschwindigkeit von 5 l/Min, und bei einer Temperatur von 37° C. Das Nährmedium enthielt. außerdem ml n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe (C₁₁ bis C₁₉), die aus Gasöl durch die Molekularsiebmethode abgetrennt worden -waren.

Die Züchtung erfolgte über einen Zeitraum von Stunden. Dann wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren von der Kulturlösung getrennt, gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 153 g.

Tabelle IV

Analysenwerte der nach Beispiel 2 erhaltenen Hefe

. Feuchtigkeit 8,8%

Rohprotein 56,4%

Rohfett 6,3%

Rohfasern 4,5%

Rohasche 8,4%

Stickstofffreier Extrakt 15,6%

Tabelle V

Aminosäurezusammensetzung (g Aminosäure/100 g Protein)

Tryptophan ...

Lysin

Histidin ......

Arginin

Asparaginsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure

Prolin

Glycin

Alanin

Valin

Methionin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin ..

2,12 7,33 1,71 4,49 4,30 6,21 3,00 5,20 2,73 14,24 3,06 5,61 1,10 4,78 6,95 2.73 4,87

Beispiel 3

Der n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefestamm Trichosporon japonicum ATCC 20004 wurde in einem Fermenter nach derselben Verfahrensweise wie im Beispiel 2 gezüchtet, außer daß die Zusammensetzung des Nährmediums 0,65 % Ammoniumchlorid, 0,24% Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,35% Maisquellwasser betrug. Der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt, und die Bebrütungstemperatur betrug 37° C.

Der pH -Wert wurde mit flüssigem Ammoniak ein-

gestellt. Als Kohienstoffquelle wurden 3 Volumprozent n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe (C₁₁ bis C₂₂) zugesetzt. Nach 18stündiger Züchtung wurden 210 g trockene Hefe erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zum Züchten von Hefen unter üblichen Bedingungen in einem n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Trichosporon japonicum ATCC 20002,

   -■-. ATCC 20003 oder ATCC 20004 einsetzt.

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