DE2002048C3

DE2002048C3 -

Info

Publication number: DE2002048C3
Application number: DE2002048A
Authority: DE
Inventors: Shunichi Kyogo Akiyama; Hideo Osaka Fukuda; Yasuhiro Hyogo Sumino; Takashi Hyogo Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-01-22
Filing date: 1970-01-17
Publication date: 1979-11-22
Also published as: BE744416A; JPS496117B1; US3689359A; DE2002048B2; GB1297243A; FR2028886A1; NL7000842A; IT1055511B; NL168553B; DE2002048A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure.

Für Citronensäure besteht ein großer Bedarf. Sie wird beispielsweise als Säuerungsmittel in Getränken und in *> pharmazeutischen Sirupen verwendet. Für die Herstellung von Citronensäure durch Fermentation sind Verfahren, bei denen Mikroorganismen wie Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus usw. verwendet werden, bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen und Patenten beschrieben. Bei diesen Verfahren ist man jedoch stets auf die Verwendung von Zuckern und anderen teuren Kohlenstoffquellen angewiesen, und die Fermentationsdauer ist sehr lang und beträgt 5 bis Tage. 5)

Es ist bekannt, daß verschiedene Hefen die Fähigkeit haben. Citronensäure in einem Medium anzureichern, das Kohlenwasserstoffe enthält. Diese Hefen verbrauchen jedoch im Laufe der Fermentation allmählich die gebildete Citronensäure, und die endgültige Ausbeute hängt von der Bilanz zwischen Produktion und Verbrauch von Citronensäure ab. Aus diesem Grunde war die auf die eingesetzten Kohlenwasserstoffquellen bezogene Ausbeute an Citronensäure nie so gut, wie dies wünschenswert wäre.

in Untersuchungen des Stoffwechsels von Pilzen der Gattung Candida gelang: der Anmelderin die Isolierung gewisser Mutanten, denen die Fähigkeit fehlt, Citronensäure zu verwerten, und die Kohlenwasserstoffe unter Bildung und Anreicherung von Citronensäure in guter es Ausbeute zu verwerten vermögen. Der Erfindung liegen diese Untersuchungen zugrunde.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert

Die Herstellung von Citronensäure nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile. Vor allem ist die Ausbeute äußerst hoch. Es wird angenommen, daß diese verbesserte Ausbeute der Unterdrückung der Bildung anderer organischer Säuren, hauptsächlich Isocitronensäure, zuzuschreiben ist die andernfalls fast in einer ebenso großen Menge wie die Citronensäure durch Verbrauch der gewünschten Citronensäure gebildet würden. Der zweite Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Fermentation in verhältnismäßig kurzer Zeit beendet ist Drittens ist es äußerst leicht den Zeitpunkt der Ernte zu bestimmen. Die Fermentation kann durchgeführt werden, ohne eine Oberfermentation zu befürchten, da die einmal gebildete Citronensäure vom Mikroorganismus nicht verbraucht wird. Dies sind erhebliche Vorteile in der Fermentationsführung. Ferner wird durch die ungewöhnlich niedrigen Konzentrationen anderer organischer Säuren, die als Nebenprodukte gebildet werden, die Isolierung der Citronensäure in gereinigter Form aus der Kultur stark erleichtert. Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist das Verhältnis von Citronensäure zu Isocitronensäure gewöhnlich nicht niedriger als 9 :1.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure in guter Ausbeute bei leichter Fermentationsführung, Isolierung und Reinigung der gewünschten Citronensäure.

Die gewünschten Mutanten, die Citronensäure nicht zu verwerten vermögen und die oben genannten

3( Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle unter Bildung von Citronensäure zu verwerten vermögen, können durch spontane oder induzierte Mutation erhalten werden. Die Mutation kann beispielsweise durch Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Ko-

3' bait 60, Röntgenstrahlen und anderen energiereichen Radikalen oder durch chemische Behandlung mit Mutagenen wie NaN02, H2O2. N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin und Acryflavin erreicht werden.

Wenn ein Mikroorganismus unter einigen oder

4i> mehreren der nachstehend genannten Bedingungen nicht zu wachsen vermag, gilt er im Sinne der Erfindung als »unfähig, Citronensäure zu verwerten«, obwohl noch die Möglichkeit besteht, ihn bei weiterer Bebrütung zu züchten.

1) Medium

Trinatriumcitrat

NH₄NO,

NH4CI

KHjPO₄

MgSO₄-711,0

Agar

0,05

0,1

0,05

2,2

Notwendige Nährstoffe, wie Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäurebestandteile usw. werden in Fällen zugesetzt, in denen der untersuchte Mikroorganismus solche Stoffe für sein Wachstum benötigt.

pH 6,5

Kulturbedingungen
Bebrütung 2 Tage bei 28°C.

I
j
ί

3

Zeilen aufzunehmen, t

20 02 048

sind auch solche Mutanten geeignet,

Ursprungsstamm Nr.

Candida sp.

4

•I

einzige Kohlenstoffquelle zur Bildung von Citronensäu

vorstehend genannten Mutanten und ihre

Vergleich zu den Ursprungsstämmen

Candida sp.

I Einigen dieser Mutanten fehlt die

j gewisse Nährstoffe, z. B, verschiedene

daß ihnen die Fähigkeit fehlt, Citronen-

Candida lipolytica

IFO 1461

re zu verwerten vermögen.

mikrobiologischen Merkmale sind in der folgenden

164

1 nensäure in die

Fähigkeit, Citro-

I säure auszunutzen, und daß sie Kohlenwasserstoffe als
<

IFO 1437

Einige der

5 Tabelle im

IFO 1460

\ndere brauchen

1

(ATCC 20114)

aufgeführt.

: Vitamine, Ami-

1

Mutantenstamm Nr.

Candida sp.

Candida tropicalis

Candida sp.

i nosäuren, Nucleinsäurebestandteile usw. für die Zwecke

I

Candida lipolytica

H-22 IFO 1464

IFO 0589

164 K-I IFO 1504

i der Erfindung

L-36 IFO 1463

Rund bis

Candida sp.

(ATCC 20115)

Rund bis ellip

I vorausgesetzt,

I

Rund bis ellip

elliptisch;

IFO 1462

tisch, Anfangs

1

tisch; Pseudo

Pseudomycel,

Candida tropicalis

stadium,

mycel, echtes

echtes Mycel

9 M IFO 1505

Pseudomycel und

I Malzextrakt

Mycel

Candida sp.

Rund bis ellip

echtes Mycel

\ 25 C

FRZ-3 IFO 1465

tisch, Anfangs

i 3 Tage

Elliptisch,

Rund bis ellip

stadium,

Rund bis ellip

*

Elliptisch,

echtes Mycel,

tisch, Anfangs

Pseudomycel und

tisch, echtes

\

echtes Mycel

Pseudomycel

stadium,

echtes Mycel

Mycel und

Pseudomycel

\ Malz-Schräg-

Oval bis

und echtes

Rund bis ellip

I kultur,

Rund bis ellip

• ^:Jiptisch,

Mycel

tisch, echtes

tisch, keine

\ 25'C

tisch, geister

echtes Mycel,

Rund bis ellip

Mycel und

Pellicula ge

I 3 Tage

haft, Mycel ist

keine Pelli

tisch, echtes

Pseudomycel

bildet, Ober

\ Malzextrakt

fragmentiert

cula gebildet;

Mycel und

Rund bis ellip

flächenwachstum

\ 25X,

Trocken mit Fal

Hefering

Pseudomycel

tisch, gelegent

S 17 Tage

ten, in 2-3 Tagen

Rund bis ellip

lich dünne

gebildet, keine

tisch, echtes

Pellicula gebil

Pellicula

Hefering, der

Mycel, dünne

det, Hefering

Dünne Pellicula

Sediment am 17.

zur Ablösung

Pellicula

gebildet.

und 37. Tag fest

neigt; keine

Hefering

gestellt

Pellicula

\ Malzextrakt

Hefering keine

\ 25'C,

Weiß bis

Sedimentations

Trüb, gelb.

\ 37 Tage

Unklares Gelb,

gelb, trocken

Hefering,

insel,

leicht faltig.

faltig, trocken,

und filmartig

Sedimentations

Pellicula

feucht

Medium wird

insel, Pelli

ί Malzagar

braun

cula, trübes

Blaßgelb oder

; 17"C

Mutantenstamm

Candida sp.

Medium

weiß bis gelb,

Candida sp. 64 K-I

1 Monat

Candida lipolytica

H-22 IFO 1464

Weiß bis

trocken, »liable«

IFO 1504

L-36 IFO 1463

gelb, trocken

+

und filmartig

-

+

Candida tropicalis

-

+

9 M IFO 1505

S Fermentation

-

Candida sp.

-

I Glucose

-

FRZ-3 IFO 1465

+

-

I Galactose

_

+

I Maltose

-f

+

I Lactose

+

Saccharose

+

20 02 04S

Fortsetzung

Mutantenstamm	Candida sp.	Candida sp.	1465	Candida	tropical is	Candida sp.	64 K-I
Candida lipolytica	H-22 IFO 1464	FRZ-3 IFO		9 M IFO	1505	IFO 1504
L-36 IFO 1463

Assimilation

Glucose

Galactose

Maltose

Lactose

Saccharose

Ausnutzung
von Kaliumnitrat

Lacmusmilch

peptonisiert blau

blau blau

blau

von Esciirin

Säurebildung + + +

Die Kohlenwasserstoffe werden im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Normalparaffine mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül etwa 3 bis 20 VoI.-% des Kulturmediums ausmachen.

Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwer löslich sind, erfolgt die Zugabe zu einem wäßrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei e^;ne Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z. B. ein oberflächenaktives Mittel vom Typ des Polyoxy-Ithylensorbitanmonostearats verwendet werden.

Diese Kohlenwasserstoffe sind als solche als Kohlenstoffquellen geeignet, jedoch können gegebenenfalls gebräuchliche Kohlenstoffquellen, z. B. Kohlehydrate (z. B. Glucose) zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwenoet werden.

Als notwendige Stickstoffquellen können verschiedene anorganische Ammoniumsalze, z. B. NH₄Cl, (NH₄J₂SO₄. (NH₄J₂HPO₄. NH₄OH und NH₄NO₃, Harnstoff, die Ammoniumsalze von verschiedenen organischen Säuren, z. B. Ammoniumacetat, und organische stickstoffhaltige Materialien, z. B. Trockenhefe, Hefeextrakt. Fleischextrakt, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser. Pepton und Brennerreirückständt verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.

Außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kann das verwendete Medium gegebenenfalls beliebige «norganische Salze, die üblicherweise verwendet werden, z. B Salze von Eisen, Mangan, Magnesium und Calcium, und verschiedene Nährstoffe, die für das Wachstum des Mutanten notwendig sind, enthalten.

Der pH-Wert des Mediums kann innerhalb eines weiten Bereichs liegen, der das Wachstum der verwendeten Mutanten ermöglicht. Im allgemeinen liegt der pH-Wert im Bereich von 2 bis 7, wobei ein Wert von 3 bis 6 besonders bevorzugt wird. Wenn im Laufe der Kultivierung der pH-Wert durch die gebildete Citronensäure fällt, ist es zweckmäßig, den pH-Wert des Mediums von Zeit zu Zeit unter Fortsetzung der Kultivierung zu korrigieren. Zu diesem Zweck kann die Kultivierung unter gelegentlicher Zugabe eines Neutralisationsmittels, z. B. CaCO₃, Ca(OH)₂, NH₄OH, NaOH öder Na₂CO₃ durchgeführt werden, Es ist auch möglich, den' Medium eine ausreichende Pufferwirkung zu verleihen, indem beispielsweise CaCO₃ vorher in einer Menge zugesetzt wird, die dem möglichen Abfall des pH-Wertes entspricht

Die Bebrütungstemperatur kann in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Mutanten innerhalb gewisser Grenzen variieren. Sie liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 35° C, insbesondere im Bereich von 25 bis 30⁰C. Da das Verfahren gemäß der Erfindung im allgemeinen unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, kann unter Rühren in einem Tank, der für den Zweck geeignet ist, gearbeitet werden. Wenn eine Schaumbildung verhindert werden muß, ist es zweckmäßig, bekannte Schaumverhütungsmittel wie Poiyoxypropylenderivate, Sojabohnenöl, Siliconöl oder Schmalzöl zuzusetzen.

Die in der Kulturbrühe angereicherte Citronensäure wird nach an sich bekannten Verfahren wie Filtration, Zentrifugieren, Erhitzen, Ausfällung, Kristallisation, Entfärbung und Trocknung sowie Säulenchromatographie isoliert Diese Verfahren können allein oder in Kombination durchgeführt werden. Falls erforderlich, wird der pH-Wert der Kukurbrühe eingestellt. Wenn beispielsweise unlösliches Calciumcitrat in der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es zweckmäßig, die Brühe mit Salzsäure anzusäuern, um das Salz löslich zu machen, worauf die Abtrennung fortgesetzt wird.

Gegebenenfalls vird die Kulturflüssigkeit nach Abtrennung von den Hefezcllen mit Natriumhydroxyd, Calciumcarbonat, Kalkmilch od. dgl. neutralisiert. Die hierbei erhaltene Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 15 bis 30° C) oder unter Erhitzen stehengelassen und anschlicßned filtriert oder zentrifugiert und getrocknet, wobei Calciumcitrat als weißes Pulver erhalten wird. Dieses Pulver wird, falls erforderlich, nach an sich bekannten Verfahren, z. B, durch Neutralisation, weiter gereinigt.

Wenn das Pulver aus einem Gemisch von Citronensäure und ( + )-lsocitronensäure besteht, kann die Trennung beispielsweise wie folgt vorgenommen werden: Das in heißem Wasser gelöste Pulver wird heiß abgenutscht, wobei Calciumsaize der Citronensäuren erhalten werden, worauf neutralisiert und filtriert wird. Das Filtrat wird bis zur Konsistenz eines Sirups

eingeengt und dann der Säulenchromatographie an ,Kieselgel unterworfen, wobei ein Gemisch von n-Bulanol und Chloroform als Elutionsmittel verwendet wird und die Citronensäure und die ( + )-Isocitrohchsäure in verschiedenen Fraktionen abfließen.

Die Citronensäure und ( + )-lsocitronensäure werden nach der Penlabromacctonmethode (S e i k a g a k u, 27, 72 [1955]) und nach der enzymatischen Methode (Methoden der enzymalischeri Analyse von Günther Siebert, Seite318[VerlagChemie])bestimmt.

Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Prozentsätze sind auf der Basis Gewicht/Volumen berechnet. Die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der erzeugten Citronensäure pro Gewichtseinheit des verbrauchten η-Paraffins angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Die Zahlen, die hinter den Namen der Hefen in der obigen Tabelle sowie in den Beispielen nach der Abkürzung »IFO« angegeben sind, sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation. Osaka, Japan.

Beispiel 1

Mit einer Kultur von Candida lipolytica L-36 (IFO 1463), die von Candida lipolytica IFO 1437 abgeleitet worden ist, werden 10 Raumteile eines sterilisierten wäßrigen Mediums (pH 6,0) beimpft, das ein überwiegend aus η-Paraffinen mit 13 bis 15 C-Atomen (2%) bestehendes Kohlenwasserstoffgemisch, 0,2% NHjCI, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ -7 H₂O, 0,001% MnSO₄ · 7 H₂O, 0,001% FeSO₄ ■ 7 H₂O und 0,5% CaCO₅ enthält und dann 48 Stunden bei 28°C unter Rühren und Belüftung bebrütet wird. 10 Raumteile der erhaltenen Vorkultur werden in 100 Raumteile eines Mediums überführt, das 6% der oben genannten n-Paraffine, 0,2% NH₄CI, 0,01% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄ -7 H₂O, 0,001% MnSO₄-7 H₂O, 0,001% FeSO₄ · 7H₂O. 0.1% Trockenhefe und 0,5% CaCO₃ enthält. Das geimpfte Medium wird unter Belüftung und Rühren bei 28°C bebrütet. Am zweiten Tag werden O^I'c CaCQj ""d a~ dritter. Ta" 3% CaCO- ^""trch zugesetzt, um den pH-Wert des Mediums zu korrigieren. Die Kultivierung wird bis zu einer Gesamtdauer von 5 Tagen fortgesetzt. Die Ausbeuten an Citronensäure, die in der Brühe gebildet und angereichert worden ist und an Isocitronensäure, die in der höchsten Konzentration aller als Nebenprodukte gebildeten organischen Säuren vorliegt, sind nachstehend zusammen mit den entsprechenden Ausbeuten genannt, die durch Kultivierung 6es Ursprungsstammes erzielbar sind.

Ursprungsstamm

Mutant

Citronensäure	22,8
Ausbeute, mg/ml	38
Auf Kohlenstoff-
quelle bezogene
Ausbeute, %
Isocitronensäure	27
Ausbeute, mg/ml	45
AufKohlenstoff-
quelle bezogene
Ausbeute. %

69,8
115,4

1,36
2,1 Ein Teil der vorstehend beschriebenen Kultur wird 'weitere 3 Tage bis zu einer Gesamtdauer Von 8 Tagen bebrütet. Nach dieser Zeit erreicht die vom Mutanten angesammelte Citronensäure 69.1 mg/ml. Im Gegensatz hierzu fällt die angesammelte Menge beim Ursprungsstamm iiuf 13,2 mg/ml.

Am !Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur abgenommen und durch Zusatz von 3 n-HCI auf pH 2,0 eingestellt, worauf zur Entfernung der Zellen zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 5 ti-NaOH auf pH 6,8 eingestellt und 30 Minuten aul^r 100°C erhitzt. Nach Abkühlung der Flüssigkeil wird da.·, Sediment abfiltriert und in strömender Luft getrocknet. Hierbei wird Calciumcilral erhalten, das 6,3 Gcw.-Tcilc-Citronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteiler! Wasser suspendiert und mit 5 n-H₂SO₄ neutralisiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 1 Gew.-Teil Aktiv kohle versetzt und anschließend filtriert.

Das erhaltene Fillral wird unter vermindertem Druck zur Konsistenz eines Sirups eingeengt. (Wenn Calcium hydroxyd ausgefällt wird, wird es während der Einengung abfiltriert.) Das Konzentrat wird im Kühl schrank stehengelassen, wobei 5.7 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) gebilde· werden.

Beispiel 2

Ein von Candida sp. IFO 1461 abgeleiteter Mutant H-22(!FO 1464), der Citronensäure nicht verwertet (und L-Milch:iäure ebenfalls nicht zu verwerten vermag) wird verwendet, um 100 Raumleile eines sterilisierten Mediums (pH 6,5) zu impfen, das 8% eines Gemisches von η-Paraffinen mit 12 bis 18 C-Atomen (Reinheit 92%), 0.3% NH₄Cl, 0,01% KH₂PO₄. 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0.05% FeSO₄ · 7 H₂O und 0,5% CaCO₃ enthält. Die Bebrütung wird 3 Tage bei 28°C vorgenommen. Von Zeit zu Zeit wird eine 14%ige NH₄OH-Lösung zugesetzt, um die gelblichgrüne Farbe des Mediums aufrechtzuerhalten (d.h. den pH-Wert zwischen 4 und 5 zu halten). Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit den Ergebnissen genannt nie* kai 1/οηιιαηπιιη(τ H«c I If*cr»mtn«Tc-K^il^i-/>/%rrror*!crr,iic ~~. ._..., , _o «_.— , _r. _o„ .,..._fc.^_._oi

erreichbar sind.

Ursprungsstamm

Mutant

60

₆₅ Citronensäure
Ausbeute, mg/ml 49 112

Auf Kohlenstoff- 61,2 138

quelle bezogene

Ausbeute, %
Isocitronensäure
(das in größter Menge
vorhandene Nebenprodukt)

Ausbeute, mg/ml 52 1,3

Auf Kohlenstoff- 65 1,7

quelle bezogene
Ausbeute, %

Ein Teil der vorstehend beschriebenen Kultur wird weitere 2 Tage bebrütet Nach dieser Zeit hat die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Mutanten gebildet worden ist 109 mg/ml erreicht Es isi bemerkenswert, daß die entsprechende Zahl für den Ursprungsstamm nur 25,4 mg/ml beträgt

Ursprungs-

ctamm

Mutant

Citronensäure

Ausbeute, mg/ml 31,5 86

Auf Kohlenstoff- 39,4 107,5

quelle bezogene
Ausbeute, %

Isocitronensäure

Ausbeute, mg/ml 39 0,8

Auf Kohlenstoff- 48,7 1,0

quelle bezogene
Ausbeute, %

Die vorstehend beschriebene Kultur wird weitere 3 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Mutanten gebildet worden ist, 84 mg/ml, d. h. sie ist gegenüber der Zahl am dritten Tag im wesentlichen unverändert. Im Gegensatz hierzu fällt die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Ursprungsstamm gebildet worden ist, auf 19 mg/ml.

Am dritten Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur des Mutanten abgenommen und aut aie in Beispiel l DeschneDene Weise behandelt, wobei 7.4 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten werden.

Am dritten Tag wird die vorstehend beschriebene Kultur zur Entfernung des Mikroorganismus filtriert. Das Filtral wird durch Zusatz von Ca(OH)2 auf pH 7,0 eingestellt und 30 Minuten unter leicht vermindertem Druck gekocht. Nach dem Kochen wird das Sediment abfiltriert und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Hierbei werden 9,3 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten.

Beispiel 3

Der von Candida sp. IFO 1462 abgeleitete Mutant Candida sp. FRZ-3 (IFO 1465) wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Am dritten Tag der Kultivierung wird die Kultur auf Citronensäure und als Nebenprodukt gebildete Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Beispiel 4

Candida sp. K-I (IFO 1504) (von Candida sp. 164 IFO 1460 abgeleitet) und Candida tropicalis 9M (IFO 1505) (von Candida tropicalis [IFO 0589] abgeleitet) werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Am dritten Tag der Kultivierung werden die Kulturen auf Citronensäure und Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind nachstehend im Vergleich zu den mit den Ursprungsstämmen erhaltenen Ergebnissen genannt.

Citronensäure

Isocitronensäure

Ausbeute

Aüi Koh-

lenstoff-

qucllc

bezogene

Ausbeute

iüg/iiii

Ausbeute

mg/ η

Auf Koh-

lenstolT-

quelle

bezogene

Ausbeute

Candida 81 100,1 9 11,2

sp. K-I
(IFO 1504)

Candida 32 30 16 20

sp. 164
(IFO 1460)

Candida 88 110 2 2,5

tropicalis
9 M (IFO 1505)

Candida 46 57,5 32 40

tropicalis

(IFO 0589)

aus BE-PS 7 16 247

Wie man aus den Zahlenwerten ersieht, sind sowohl

die Ausbeuten als auch die auf Kohlenstoffquelle Bezogenen Ausbeuten bei den Mikroorganismen gemäß ^: der Erfindung überraschend erheblich höher bei sehr verringerter Ausbeute an Isocitronensäure als bei dem !Mikroorganismus gemäS der BE-FS 7 !6 247. Darin

liegt der erhebliche technische Fortschritt der vorliesenden Erfindung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Citronensäure anreichernde Hefe der Art Candida lipolytica oder Candida tropicalis oder Candida sp. H 22 (IFO 1464), Candida sp. FRZ-3 (IFO 1465) oder Candida sp. 164 K-I (IFO 1504), die Kohlenwasserstoffe zu verwerten und Citronensäure nicht zu verwerten vermag in ein wäßriges Kulturmedium impft, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 7 bebrütet bis sich Citronensäure in der Kulrurbrühe stark angereichert hat, und die so angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen zwischen 2Q und 35° C YQmini^mt

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Kulturmediums zwischen 3 und 6 hält

4. Verfahren nach Ansprüchen 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida lipolytica L-36 (IFO 1463) verwendet

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida tropicalis 9 M(IFO 1505) verwendet.