DE2002048A1

DE2002048A1 - Verfahren zur Herstellung von Citronensaeure

Info

Publication number: DE2002048A1
Application number: DE19702002048
Authority: DE
Inventors: Shunichi Akiyama; Hideo Fukuda; Yasuhiro Sumino; Takashi Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-01-22
Filing date: 1970-01-17
Publication date: 1970-11-26
Also published as: FR2028886A1; JPS496117B1; NL7000842A; US3689359A; GB1297243A; BE744416A; NL168553B; DE2002048B2; IT1055511B; DE2002048C3

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING, KLOPSCH

KÖLN 1, DElCHMANNHAUS

Köln, den 13.1.1970 Kl/Ax/Hz

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27> Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan) Verfahren_zur_Herstellung von Citronensäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Citronensäure anreichernde Hefe der Gattung Candida, die Kohlenwasserstoffe zu verwerten vermag und Oitronensäure nicht zu verwerten vermag, in ein wässriges Kultur medium impft, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül enthältj die Kultur bei einem p_H-Wert von etwa 2 bis^7 bebrütet, bis sich Citronensäure in der Kulturbrühe stark angereichert hat, und die so angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe gewinnt.

Für Citronensäure besteht ein großer Bedarf. Sie wird beispielsweise als Säuerungsmittel in Getränken und in pharmazeutischen Sirupen verwendet. Pur die Herstellung von Citronensäure durch Fermentation sind Verfahren, bei denen Mikroorganismen^wie Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus usw. verwendet werden, bekannt und in zahlreichen VeröffentIichungen undPatenten beschrieben. Bei diesen Verfahren ist man jedoch stets auf die Verwendung

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von Zuckern und anderen teuren Kohlenstoffquellen angewiesen,und die Fermentationsdauer ist sehr lang und beträgt 5 bis 12 Tage.

Es ist bekannt, daß verschiedene Hefen die Fähigkeit haben, Citronensäure in einem Medium anzureichern, das Kohlenwasserstoffe enthält. Diese Hefen verbrauchen jedoch im Laufe der Fermentation allmählich die gebildete Citronensäure, und die endgültige Ausbeute hängt von der Bilanz zwischen Produktion und Verbrauch von Citronensäure ab. Aus diesem Grunde war die auf die eingesetzten Kohlenwasserstoffquellen bezogene Ausbeute an Citronensäure nie so gut, wie dies wünschenswert wäre.

In Untersuchungen des Stoffwechsels von Pilzen der Gattung Candida gelang der Anmelderin die Isolierung gewisser llutanten, denen die Fähigkeit fehlt, Citronensäure zu verwerten, und die Kohlenwasserstoffe unter Bildung und Anreicherung '/on Citronensäure in guter Ausbeute zu verwerten vermögen. Der Erfindung liegen diese Untersuchungen zugrunde·

Die Herstellung von Citronensäure nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile. Vor allem ist die Ausbeute äußerst hoch. Es wird angenommen, daß diese verbesserte Ausbeute der Unterdrückung der Bildung anderer organischer Säuren, hauptsächlich Isocitronensäure, zuzusehreiben ist, die andernfalls fast in einer ebenso großen Menge wie die Citronensäure durch Verbrauch der gewünschten Citronensäure gebildet würden. Der zweite Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Fermentation in verhältnismäßig kurzer Zeit beendet ist. Drittens ist es äußerst leicht, den Zeitpunkt der Ernte zu bestimmen. Die Fermentation kann durchgeführt werden, ohne eine Überfermentation zu befürchten, da die einmal gebildete Citronensäure vom Mikroorganismus nicht verbraucht wird. Dies sind erhebliche Vorteile in der Fermentationsführung· Ferner wird durch die ungewöhnlich niedrigen Konzentrationen anderer

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■■-■; organischer Säuren, die als Nebenprodukte gebildet werden,, die Isolierung der Citronensäure in gereinigter Form aus der Kultur stark erleichtert. Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist das Verhältnis von Citronensäure zu Isocitronensäure gewöhnlich nicht niedriger als 9:1.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Citro- , ^: nensäure in guter Ausbeute bei leichter Fermentationsführung, Isolierung und Reinigung der gewünschten Citronen- -'"'·'""" säure« '■ ■ ■ .-■■.·.■....-■". *...-■■■: . ■" ;

Beim Verfahren gemäß der Erfindung beimpft man ein wässriges Kulturmedium, das als Hauptkohlenstoffquelle wenig-

.,-. stens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 C-Atomen, im Molekül .enthält, mit einer Citronensäure anreichernden Hefe der Gattung Candida, die Kohlenwasserstoffe zu verwerten ver-. mag itnd Citronensäure nicht, zu yerwerten vermag, bebrütet di,e Kultur bei einem pg.-Wer.t- von etwa 2 bis 7, bis Citro-. / nenfäure sich in der Kulturbrühe stark angereichert hat, und isoliert die angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe·

Als. Ursprungs8täiiffiie, von denen die oben genannten Mutanten

v. der Gattung Candida abgeleitet werden können, eignen sich

_<. beispielsweise Hefen wie Candida lipolytica, Candida

. parapsilosis, Candida brumptii, Candida intermedia, Candida

_: trppicalis\und Candida guilliermondii sowie gewisse in der

.25. Natur isolierte. Hefen. .

Die gewünschten Mutanten, die Citronensäure nicht zu verwerten vermögen und die oben genannten Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle unter Bildung von Citronensäure au verwerten vermögen, können durch spontane oder induzierte Mutation erhalten werden.:^:Die Mutation kann beispielsweise durch UltraviolettbeStrahlung, Behandlung mit Kobalt 60, Röntgenstrahlen und anderen energiereichen Radikalen oder durch chemische Behandlung mit Mutagenen wie NaNO₂♦ H₃O₂, N-Hethyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin und

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Acryflavin erreicht werden.

Wenn ein Mikroorganismus unter einigen oder mehreren der nachstehend genannten Bedingungen nicht zu wachsen vermag, gilt er im Sinne der Erfindung als "unfähig, Citronensäure 5 zu verwerten", obwohl noch die Möglichkeit besteht, ihn bei weiterer Bebrütung zu züchten.

1) Medium %

Trinatriumcitrat 0,05

NH₄NO₅ 0,1

NH₄Cl 0,1

KH₂PO₄ 0,1

MgSO₄.7H₂O " 0,05

Agar 2,2

Vitamingemisch 1 ml/1 Biotin 0,1 yug

Calciumpanthothenat 10,0 yug Folsäure ' 0,1 yug

Inosit 50,0 yug

Niacin 10,0 ng p-Aminobenzoesäure 5»0 ;ug

Pyridoxinhydrochlorid 10,0 Jig Riboflavin 5,0 11g

_ Thiaminhydrochlorid 10,0

2) Kulturbedingungent

Bebrütung 2 Tage bei 28⁰C.

Einigen dieser Mutanten fehlt die Fähigkeit, Citronensäure in die Zellen aufzunehmen. Andere brauchen gewisse Nährstoffe, z.B. verschiedene Vitamine, Aminosäuren, Nuclein-30 ßäurebestandteile usw. Für die Zwecke der Erfindung sind auch solche Mutanten geeignet, vorausgesetzt, daß ihnen die Fähigkeit fehlt, Citronensäure auszunutzen, und daß sie Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle zur Bildung von Citronensäure zu verwerten vermögen. 009848/1067

Einige der vorstehend genannten Mutanten und ihre mikrobiologischen Merkmale sind in der folgenden Tabelle im Vergleich zu den Ursprungsstammen aufgeführt.

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Ureprungeetasa Nr.

Candida lipolytica _Ιϊυ 1457

CATCC 20114)

Candida sp. IFO 1461 Candida sp.
IFO 1462

Candida tropicalia IFO 0589
(ATCC 20115)

Candida sp.

IFO 1460

Mutanten- et «am Nr.

Candida lipolytica 1465

Candida ep. Candida sp. H-22 IFO 1464 FKZ-3 IFO 1465

Candida tropioalis

"9B 1505

Candidas 164 K-1 I

1504

ο ο co co

Malzextrakt

25°σ 3 Tage

Bund bis ellip- Rund bis tisch; Fseudomycel, elliptisch; echtes Mycel Pseudomycel,

echtes. Mycel Hund bis ellip- Hund bis elliptisch, Anfangs- tisch, Anfangsstadium, stadium,
Pseudomycel und Pseudomycel und echtes Mycel echtes Mycel

Hund bis elliptisch, Anfangsstadium, Pseudomycel und echtes Mycel

Mais-Schräg- Elliptisch, kultur, echtee Mycel

25⁰C, 3 Tage

Elliptisch, Rund bis ellip echtes Mycel, tisch, echtes Pseudomycel Mycel und

Pseudomycel

Rund bis elliptisch, echtes
Mycel und
Pseudomycel

Rund bis elliptisch, echtes , Mycel und cn Pseudomycel

Malsextrakt Bund bis ellip-

25*0, 17 T

p tisch« geisterhaft» Mycel ist fragmentiert. Trocken mit Falten, in 2-3 Tagen gebildet, keine Pellicula.

Oval bis elliptisch, Rund bis elliptisch, echtes

echtee Mycel, Mycel, dünne

keine Pellicula gebildet; Hefering Pellicula

Rund bis elliptisch, gelegent lieh dünne
Pellicula gebil det, Hefering

Rund bis elliptisch, keine Pellicula gebildet, Oberflachenwachstum

Mm3	Lz extrakt	Sediment am	17.	Hefering, der	Hefering,	Hefering, keine	Dünne Pellicula
25		und 37· Tag	fest-	zur Ablösung	Sedimentations	Sedimentations	gebildet,
37	Tage	gestellt		neigt; keine	insel, Pelli	insel,	Hefering
				Pellicula	cula, trübes	Pellicula
					Medium

Malzagar Unklares Gelb, I70Q faltig, trocken, 1 Monat Medium wird braun

Weiß bis Weiß bis gelb, trocken gelb, trocken und filmartig und' filmartig

Blaßgelb oder
weiß bis gelb,
trocken,
"liable*

Trüb, gelb, leicht faltig, feucht

Mutanten	Candida lipolyticä L-56 IFO 1465	Candida sp.	Candida	sp.	Candida tropicalis	Candida	64K-1
stamm		H-^22 IFO 146	4 F&Z-3 Ii	!tri465	9M IFO 1505	IFO 150*
Fermentation		■" . , , ■''.

Glucose , Galactose-Maltose ·, Lactose , Saccharose

+λ/

+■

■♦„«/♦

Assimilation

ο Glucose Galactose ■.; "Maltose'. ^:' ' Lactose ' ^ν Saccharose

Ausnutzung von Kaliumnitrat	-	— '	blau	-	blau
Lacmusmilch	peptonisiert	blau	■ ' V. ' ' + ' ■' ■	blau	+ "
Zersetzung von Escurin	*ν + ■ ;.'■■ .: .;■**	+	, ■ ■+■' · '	+
Säurebildung		■ ,' +	.;+■■'

Das beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Medium sollte nach den Jeweils zu verwendenden Mutanten etwas modifiziert werden, jedoch können n-Alkane mit 9 biß 20 C-Atomen im Molekül, z.B. n-Nonan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan, n-Octadecan, n-Nonadecan und n-Eicosan sowie ihre Gemische, und Erdölfraktionen wie Gasöl, schweres Gasöl und Leuchtpetroleum (Kerosin) vorteilhaft als Kohlenstoffquellen . verwendet werden. Die Kohlenwasserstoffe werden im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Normal paraffine mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül etwa 3 bis 20 Vol.-% des Kulturmediums ausmachen·

Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwer löslich sind, erfolgt die Zugabe zu einem wässrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei eine Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z.B. ein oberflächenaktives Mittel vom Typ des Folyoxyäthylensorbitanmonostearats verwendet werden·

Diese Kohlenwasserstoffe sind als solche als Kohlenstoffquellen geeignet, Jedoch können gegebenenfalls gebräuchliehe Kohlenstoffquellen, z.B. Kohlehydrate (z.B. Glucose) w zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwendet werden.

Als notwendige ßtickstoffquellen können verschiedene anorganische Ammoniumsalze, z.B. NH^Cl, (NH^gSO^, (NH^^- HKL» NH4OH und NIL· NO,, Harnstoff, die Ammoniumsalze von verschiedenen organischen Säuren, z.B. Ammoniumacetat, und organische stickstoffhaltige Materialien, z.B. Trokkenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, SoJabohnenmehl, Maisquellwasser, Fepton und Brennereirück stände verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.

Außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kann das verwendete Medium gegebenenfalls beliebige anorganische

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Salze, die üblicherweise verwendet werden, z.B. Salze von Eisen, Mangan, Magnesium und Calcium, und verschiedene , Nährstoffe, die für das Wachstum des Mutanten nötwendig sind, enthaltene ,?-"■-■- , ·'

5" Der PjT-W0rt des Mediums kann innerhalb eines weiten Bereichs liegen,, der das Wachstum der verwendeten Mutanten ,ermöglicht. Im allgemeinen liegt der PrrrV/ert im Bereich von 2 bis7»wobei ein Wert von 3. bis, 6 besonders bevorzugt wird. Wenn im Laufe der Kultivierring der p.jj-V/ert durch, die gebildete Citronensäure fällt, ist es .zweckmä-, Big, den Pg-Wert des Mediums von Zeit zu Zeit -unter Portsetzung der Kuitivieru^ zu korrigieren* Zu diesem, Zweck kann die Kultivierung unter gelegentlicher Zugabe eines - Neuträlisationsmittel^, z.B. CaCO,, Ca(OH)₂V ^%OH^ NaOH oder NapCO, durchgeführt werden. Es ist auch möglich, dem Medium eine ausreichende Pufferwirkung zu verleihen, indem beispielsweise CaCO^ voirher in einer Menge- zugesetzt wird, die dem möglichen Abfall des pU-Wertes entspricht.

Die Bebirütuiigstemperatur kann in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Mutanten innerhalbi gewisser Grenzen . variieren. Sie liegt im ailgemeinen im Bereich von 20 bis 55⁰G» insbesondere im Bereich von 25 bis 5O⁰C. Da das Verfahren gemäß der Erfindung im allgemeinen unter aeroben Bedingungen durchgeführt wi^, kann unter Rühren in einem : Tank^ der für= den .Zweck geeignet ist, gearbeirtet; werden. ._; Wenn eine Schäumbi^ ^;;.;;

zweqjcmäßig, bekannte Schaumv^r^hütxingsmit^ei wie_;iOlyoiy-

Sojebohnenöl^ _% Sili<?onÖl oder ^chmalzöl

Die in vier Kiilturbrühef'■'■änge'telöhärtö· 6iibrb^:tt<6.neäTir%"%iM ■ nach an sich "bekannten Verf iahren "wie Filtration, Zentrifugieriing^ Euhitzen, Ausfüllung; KristöilisätionV Ent- ° färbtjng imd Trocknung sowie Saulenchrbmatögraphie isoliert . Diese Verfahren können allein oder,in Kombination durchgeführt werden. Falls erforderlich, wird der, p„-Wert

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der Kulturbrühe eingestellt. '.Venn beispielsweise unlösli-„ ches Galciumcitrat in der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es zweckmäßig, die Brühe mit Salzsäure anzusäuern, um das Salz löslich zu machen, worauf die Abtrennung fortgesetzt wird.

Gegebenenfalls wird die Kulturflüssigkeit nach Abtrennung von den Hefezellen mit Natriumhydroxyd, Calciumcarbonat, Kalkmilch oder dergl. neutralisiert. Die hierbei erhaltene Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 15 bis 30⁰C) oder unter Erhitzen stehengelassen und anschließend filtriert oder zentrifugiert und getrocknet, wobei Oalciumcitrat als weißes Pulver erhalten wird. Dieses Pulver wird, falls erforderlich, nach an sich bekannten Verfahren, z.B. durch Neutralisation, weiter gereinigt.

Wenn das Pulver aus einem Gemisch von Citronensäure und (+)-Isocitronensäure besteht, kann die Trennung beispielsweise wie folgt vorgenommen werdent Das in heißem Wasser gelöste Pulver wird heiß abgenutscht, wobei Calciumsalze der Citronensäuren erhalten werden, worauf neutralisiert und filtriert wird. Das Filtrat wird bis zur Konsistenz eines Sirups eingeengt und dann der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei ein Gemisch von n-Butanol und Chloroform als Elutionsmittel verwendet wird und die Citronensäure und die (+)-Isocitronensäure in ver-

25 schiedenen Fraktionen abfließen.

Die Citronensäure und (+)-Isocitronensäure werden nach der Pentabromacetonmethode (Seikagaku 22, 72 (1955) und nach der enzymatisehen Methode (Methoden der enzymatisehen Analyse von Günther Siebert» Seite 318 (Verlag Chemie) bestimmt.

Zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Prozentsätze sind auf der Basis Gewicht/Volumen berechnet. Die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der erzeugten Citronensäure pro

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Gewichteeinheit des verbrauchten η-Paraffine angegeben. Gewichteteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Die Zahlen, die hinter den Namen der Hefen in der obigen Tabelle sowie in den Beispielen nach der Abkürzung "IFO" angegeben sind, sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

Beispiel 1 Mit einer Kultur von Candida lipolytica L-36 (IFO 1437),

die von Candida lipolytica IFO 1437 abgeleitet worden iet, werden 10 RäumteiIe eines sterilisierten wässrigen Mediums (Pfl 6,0) beimpft, das ein überwiegend aus n-Paraffinen mit 13 bis 15 C-Atomen (2%) bestehendes Kohlenwasserstoffgemisch, 0,236KH₄Cl, 0,05% KH₂FO₄., 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,001% MnS0₄*7H₂0, 0,001% FeS0₄.7H₂0 und 0,5^¹CaCO₅ enthält und dann 48 Stunden bei 28°C unter Rühren und Belüftung bebrütet wird. 10 Raumteile der erhaltenen Vorkultur werden in 100 Hausteile eines Mediums überführt, das 6% der oben genannten n-Paraffine, 0,2% NH₄Cl, 0,01% EH₂PO₄, 0,05% MgSO₄^H₂O, 0,001% MnSO₄.7H₂O, 0,001% FeS0₄.7H₂0, 0,1% Trockenhefe und 0,5% CaCO, enthält. Das geimpfte Medium wird unter Belüftung und Rühren bei 28⁰C bebrütet. Am zweiten Tag werden 0,5% CaCO, und am dritten Tag 3% CaCO, aseptisch zugesetzt, um den pg-Wert des Mediums zu korrigieren· Die Kultivierung wird bis zu einer Gesamt dauer von 5 Tagen fortgesetzt. Die Ausbeuten an Citronensäure, die in der Brühe gebildet und angereichert worden ist und an Isocitroneneäure, die in der höchsten Konzentration aller als Nebenprodukte gebildeten organischen Säuren vorliegt, sind nachstehend zusammen mit den entsprechenden Ausbeuten genannt, die durch Kultivierung des Ursprungsstammes erzielbar sind.

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Ursprungsstamm Mutant

Citronensäure	22,8	69,8
Ausb eu te, mg/ml	38	115,4
Auf Kohlenstoffquelle bezogene Ausbeute, %
Isocitronensäure	27	1,36
Ausbeute, mg/ml	45	2,1
Auf Kohlenstoffquelle bezogene Ausbeute, %

Ein Teil der vorstehend beschriebenen Kultur wird weitere 3 Tage bis zu einer Gesamtdauer von 8 Tagen bebrütet. Nach dieser Zeit erreicht die vom Mutanten angesammelte Citronensäure 69,1 mg/ml. Im Gegensatz hierzu fällt die angesammelte Menge beim Ursprungsstamm auf 13,2 mg/ml.

Am 5· Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur abgenommen und durch.Zusatz von 3n-HCl auf p„ 2,0 eingestellt, worauf zur Entfernung der Zellen zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 5n-IIaOH auf P_H 6,8 eingestellt und 30 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach Abkühlung der Flüssigkeit wird das Sediment abfiltriert und in strömender Luft getrocknet. Hierbei wird Calciumcitrat erhalten, das 6,3 Gew.-Teile Citronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteilen Wasser suspendiert und mit 5n-HoS0^ neutralisiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 1 Gew.-Teil Aktivkohle versetzt und anschließend filtriert.

Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Konsistenz eines Sirups eingeengt. (Wenn Calciumhydroxyd ausgefällt wird, wird es während der Einengung abfiltriert) Das Konzentrat wird im Kühlschrank stehengelassen, wobei 5,7 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) gebildet werden.

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^Λ 2002U4&

Beispiel 2

Ein von Candida sp. IFO 1461 abgeleiteter Mutant H-22 (IFO 1464), der Citronensäure nicht verwertet (und L-Milchsäure ebenfalls nicht zu verwerten vermag) wird verwendet, um 100 Raumteile eines sterilisierten Mediums CPtj6,5);-z.u impfen, das 8% eines Gemisches von n-Paraffi- , nen mit 12 bis 18 C-Atomen (Reinheit 92^), 0,3^ NH₄Cl, 0,01% KH₂PO₄, 0,0% MgSO₄.7H₂O, 0,0% FeS0₄.7H₂0 un/ϊ 0,5^ CaCO, enthält. Die Bebrütung wird 3 Tage bei 28⁰C vorgenommen. Von Zeit zu Zeit wird eine 14%ige NH₄OH-Lösung zugesetzt, um die geiblichgrüne Fajc*be des Mediums ^ aufrechtzuerhalten (d.h. den pg-Wert zwischen 4 und 5 * zu halten). Die Ergebnisse sind nachstehend zusammenmit den Ergebnissen genannt, die bei Verwendung des Ursprungs-

15 Mikroorganismus erreichbar sind.

.Ursprungsstamm Mutant Citronensäure

Ausbeute, mg/ml ' 49 112

Auf Kohlenstoff quelle
bezogene Ausbeute, % 61,2 138

Isocitronensaure

■".-■■. (das in größter Menge vorhan dene Nebenprodukt)

Ausbeute, mg/ml 52 1,3 ' - μ

Auf Kohlenstoffquelle Ii

bezogene Ausbeute, % 65 1j7

Ein Teil der vorstehend beschriebenen Kultur wird weitere 2 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Ausbeute an Citronensäure,die durch den Mutanten gebildet worden ist, 109 mg/ml erreicht. Es ist bemerkenswert, daß die entsprechende Zahl·,für den Ursprungsstamm nur 25,4 mg/ml beträgt.

Am dritten Tag wird die vorstehend beschriebene Kultur zur Entfernung des Mikroorganismus filtriert. Das Filtrat wird durch Zusatz von Ca(OH)₂ auf p_H 7,0 eingestellt und 30 Minuten unter leicht vermindertem Druck gekocht.

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Nach dem Kochen wird das Sediment abfiltriert und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Hierbei werden 9,3 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten·

5 Beispiel 3

Der von Candida sp. IFO 1412 abgeleitete Mutant Candida sp. FRZ-3 (IFO 1462) wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Am dritten Tag der Kultivierung wird die Kultur auf Citronensäure und als Nebenprodukt gebildete Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Ursprungsstamm Mutant

Citronensäure	31,5	86
Ausbeute, mg/ml	39,4	107,5
Auf Kohlenstoffquelle bezogene Ausbeute, %
Isocitronensäure	39	0,8
Ausbeute, mg/ml	48,7	1,0
Auf Kohlenstoffquelle bezogene Ausbeute, %

Die vorstehend beschriebene Kultur wird weitere 3 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Citro-™ nensäure, die durch den Mutanten gebildet worden ist, 84 mg/ml, d.h. sie ist gegenüber der Zahl am dritten Tag im wesentlichen unverändert. Im Gegensatz hierzu fällt die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Ursprungsstamm gebildet worden ist, auf I9 mg/ml.

Am dritten Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur des Mutanten abgenommen und auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, wobei 7,4 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten werden.

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Beispiel· 4

Candida sp.K-1 (IFO 1504) (von Candida sp.164 IFO 1460 abgeleitet) Und Candida tropicalia 9M (IFO 1505) (von Candida tropicalia (IFO 0589) abgeleitet)werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Jim dritten Tag der Kultivierung werden die Kulturen auf Citronensäure und Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind nachstehend im Vergleich zu den mit den Ursprungsstämmen erhaltenen Ergebnissen genannt. ■-.■--

	81	Auf Kohlen-, stoffquelle bezogene Ausbeute· fi	Isocitrönensäure	Auf Kohlen stoff quelle bezogene Auebeute. %
Citronensäure		100,1	Ausbeute mg/ml	11,2
~ Ausbeute mg/ml	.32		9
Candida βρ.Κ-1 (IFO 1504)		30		20
Candida	88		16
sp.164 (IFO 1460)		110		2,5
Candida			2
tropicalia	46	... .-.---
9M (IFO 1505)	57,5		-_; 40
Candida	32
troplcalia

^IFO O509;

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Claims

ι, I)' Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Citronensäure anreichernde Η<·[>: der Gattung Candida, die Kohlenwasserstoffe zu verweHen
vermag und Citronensäure nicht zu verwerten vermag, in eir wäßriges Kulturmedium impft, das als hauptsächliche Kühlenstoffquelle wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bin ',}'■ Kohlenstoffatomen enthält, die Kultur bei einem p„-Wert vmi
etv/a 2 bis 7 bebrütet, bis sich Citronensäure in der KuI-
*;urbrühe stark angereichert hat, und die so angereicherte
Citronensäure aus der Kulturbrühe gewinnt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daP man die Züchtung bei Temperaturen zwischen 20 und 3"5⁰C vornimmt,
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den p„-Wert des Kulturmediums zwischen 3 und 6 hält.
^) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida lipolytica verwendet.
5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida tropicalis verwendet.
6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida sp. H22 IFO 1464 verwendet.
7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida sp. FRZ-J5 IPO 1465 verwendet.
8) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida sp. 164 K-I IPO 1504 verwendet.

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