DE1517784A1

DE1517784A1 - Verfahren zur Herstellung von Hefezellen,die eine sehr hohe Menge an Riboncleinsaeure enthalten

Info

Publication number: DE1517784A1
Application number: DE19661517784
Authority: DE
Inventors: Isao Banno; Mitsuzo Kuno; Yoshio Nakao
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-09-02
Filing date: 1966-08-31
Publication date: 1970-01-29
Also published as: NL6612422A; JPS4832350B1; GB1161229A; US3411989A

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, 50. August 1966 St/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27 3 Doshomachi, 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, die.eine g

sehr hohe Menge an Ribonucleinsäure enthalten ™

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur 'Herstellung von Hefezellen, die eine sehr hohe Menge Ribonucleinsäure enthalten.

Ribonucleinsäure ist sehr wichtig als Ausgangsmaterial für die Herstellung von S'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure, die beide weitgehend als Komponenten von Würzen verwendet werden. Im Großverfahren wird Ribonucleinsäure gewöhnlich durch Extraktion der in Hefezellen enthaltenen Ribonucleinsäure gewonnen.

Bei den bisher bekannten Züchtungsverfahren zur Herstellung * von Hefezellen als Rohmaterial für die Extraktion von Ribonucleinsäure werden Kohlehydrate, wie Glucose, Melasse und Stärkehydrolysat, als Kohlenstoffquellen verwendet. Diese bisher bekannten Verfahren sind jedoch im technischen Maßstab nicht durchführbar, da sie diese verhältnismäßig teuren Kohlehydrate erfordern. Es ist daher seit langem erwünscht, für die Erzeugung der Hefe eine Kohlenstoffquelle zu verwenden, die billiger ist als die bekannten Kohlehydrate. Dieser Wunsch wird durch die Erfindung erfüllt, deren Gegenstand ein vorteilhaftes Großverfahren zur Herstellung von Hefe ist, die eine große Menge Ribonucleinsäure enthält. Die Erfindung basiert auf folgenden Erkenntnissen:

909385/0042

Hefen der Gattung Candida vermögen insbesondere Norraalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 zu assimilieren, die unter vielen Arten von Kohlenwasserstoffen verhältnismäßig billig als Kohlenstoffquelle leicht verfügbar sind. Wenn ferner Mutanten, die aus Stämmen der Gattung Candida erzeugt werden und gegen gewisse Farbstoffe einschließlich Thiazinfarbstoff, Oxazinfarbstoff und Acridinfarbstoff resistent sind, in einem Kulturmedium gezüchtet werden, in dem die Kohlenstoffquelle hauptsächlich aus Kohlenwasserstoffen besteht, die die genannten Normalparaffine enthalten, können Zellen erhalten werden, die eine sehr hohe Menge Ribonucleinsäure enthalten. Im scharfen Gegensatz hierzu werden Zellen erhalten, die nur eine begrenzte Menge Ribonucleinsäure enthalten, wenn Wildstämme dieser Hefen in diesem Kulturmedium gezüchtet werden. Ferner wurde gefunden, daß .diese Mutanten, die gegen die genannten Farbstoffe resistent sind, künstlich oder spontan von den natürlich vorkommenden Stämmen erhalten werden können, deren Wachstum durch die Anwesenheit der Farbstoffe gehemmt wird.

Gemäß der Erfindung werden Hefezellen, die eine sehr hohe Menge Ribonucleinsäure enthalten, nach einem Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mutanten der Gattung Candida, der gegen Thiazinfarbstoff, Oxazinfarbstoff und/oder Acridinfarbstoff resistent ist, auf ein Kulturmedium impft, das eine Kohlenstoffquelle, die hauptsächlich aus Kohlenwasserstoffen besteht, die wenigstens 10 % (Vol./Vol.) Normalparaffine einer C-Zahl im Bereich von 14 bis 21 enthalten, und andere zum Wachstum des Mutanten erforderliche Nährstoffe enthält, und das Kulturmedium bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und einem p„-Wert von etwa 4,0 bis 8,0 unter aeroben Bedingungen bebrütet.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden Stämme, die zur Gattung Candida gehören, als ursprüngliche Mikroorganismen verwendet, aus denen die gewünschten Mutanten erzeugt werden

903885/0042

können. Das Wachstum von Wildstämmen,·die zur Gattung Candida gehören einschließlich Candida tropicalis Berkhout und Candida prapsilosis Langeron et Talice, wird in Gegenwart von Thiazinfarbstoffe^ wie 3»7-Diaminophenothiazonium~ Chlorid, 317-Bis (diäiethylamino )-phenazathioniumchlorid, Oxazinfarbstoffen, wie Tetramethyldiaminoxanthyliumohlorid, oder Acridinfarbstoffe^ wie 2,8-Bis(dimethylamine)-acridiniumchlorid, 2,8-Diamino-iO-methylacridiniumchlorid und 2,8-Diaminoacridiniumchlorid, gehemmt. Die Mutanten, die gegen diese Farbstoffe resistent sind, können erzeugt werden durch Behandlung von Wildstämmen der Gattung Candida mit ä einem Mutagen, z.B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen oder Behandlung mit salpetriger Säure oder durch Wahl und Isolierung eines Stammes von natürlich und spontan auftretenden Mutanten der Wildstämme. Das Wachstum der so erhaltenen Mutanten wird durch diese Farbstoffe nicht mehr gehemmt. Die gewünschte Mutation eines Wildstammes der Gattung Candida kann nach beliebigen an ''ich bekannten Methoden hervorgerufen werden, die in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben sind, z.B. in "Methods in Medical Research", Band 3» von R.W. Gerard, Year Book Publishers, Ino., Chicago 1950, und »Nature» 183, Seite 1829 (1959) in einer Arbeit von F. Kaudewitz,

Yom Standpunkt des Wachstums und der in den Zellen angereicherten Ribonucleinsäuremenge werden von den so erhaltenen, gegen die genannten Farbstoffe resistenten Mutanten vorzugsweise solche verwendet, die auf einem Kulturmedium zu wachsen vermögen, das die Farbstoffe in wenigstens der 5~fachen Mindestkonzentration enthält, die das Wachstum der Wildstämme, aus denen die Mutanten erhalten wurden, hemmt.

Beispiele solcher Mutanten sind Candida tropicalis Berkhout-Ca3-TH (AICC Nr.20 005 )» ^{eine Heie}» ^äie gegen 3,7-Diaminophenothiaaoniumchlorid resistent ist, Candida tropicalis Berkhout-0a3-iy (ATCC Nr.20 006 ), eine gegen Tetramethyldiaminoxanthyliumohlorid resistente Hefe, Candida tropicalis

909385/0042 _BAD ORIGINAL

Berkhout-Ca3-A0 (ATCC Nr. 20 007), eine gegen 2,8-Bis-(dimethylamino)-äcridiniumchlorid resistente Hefe, lind Candida parapsilosis Längerem et Talice-Ca57-Py (ATCC Nr. 20 008), eine gegen Tetramethyldiaminoxanthylium- · Chlorid resistente Hefe. Die Zahlen hinter der Abkürzung ¹¹ATCC" sind die Zugangsnummern der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im allgemeinen vorzugsweise unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums durchgeführt. Die Kultivierung erfolgt aerob, d.h. unter Belüftung, unter statischen oder submersen Bedingungen. Das gemäß der Erfindung verwendete Kulturmedium muß als Kohlenstoffquelle wenigstens Kohlenwasserstoffe enthalten, die Normalparaffine einer C-Zahl im Bereich von 14 bis 21 enthalten.

Vom Standpunkt des Wachstums des Mutanten und der in den Zellen angereicherten Ribonucleinsäuremenge beträgt die Menge der in den Kohlenwasserstoffen enthaltenen Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 vorzugsweise wenigstens 10 Vol.-#. Die genannten Normalparaffine selbst bilden vorteilhaft zu 100 % die Kohlenstoffquelle beim Verfahren gemäß der Erfindung.

Die Normalparaffine bestehen entweder nur aus einer Art von C₁^-bis Cp₁-Normalparaffinen oder aus zwei oder mehr Arten von Normalparaffinen, deren C-Zahl jeweils im genannten Bereich liegt. Außer den C₁^- bis C₂₁-Normalparaffinen kann die erfindungsgemäß verwendete Kohlenwasserstoffquelle noch andere Kohlenwasserstoffe enthalten (z.B. verzweigte Paraffine, Olefine, cyclische Paraffine, aromatische Kohlenwasserstoffe, Normalparaffine mit 1 bis IJ oder wenigstens 22 C-Atomen), so lange die C₁^- bis Cg₁-Normalparaffine insgesamt in einer Menge von wenigstens 10 % (Vol./Vol.) vorhanden sind.

Vorzugsweise verwendet man als Kohlenwasserstoffe reines n-Hexadecan, schwere Paraffine, die etwa 90 Vol.-Ji Normalparaffine enthalten, die C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 und

909885/0042

einen Siedebereioh von etwa 262-j549^OC haben, schweres Gasöl, das etwa 17# Normalparaffine einer C-Zahl im Bereich von 15-20 enthält und einen Siedebereich von etwa 272 - 586⁰C hat, und Gasöl, das etwa l4# Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14-17 enthält und einenSiedebereich von etwa I80 - 350⁰C hat. Vom Standpunkt des Wachstums des Mutanten und der in den Zellen angereicherten Menge der Ribonucleinsäure werden die Kohlenwasserstoffe im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Konzentration der Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14-21 im Kulturmedium insgesamt etwa 3-20 Vol.-# beträgt.

Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwerlöslich sind,

/praicfcisch

erfolgt ihre Zugabe'zu einem wäßrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei eine Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z.B. eine oberflächenaktive Substanz vom Typ des Polyoxyäthylensorbitanmonostearats (im Handel unter der Bezeichnung "Tween-oO"), verwendet werden. Diese Kohlenwasserstoffe genügen als solche als Kohlenstoffquelle, jedoch können gegebenenfalls üblicherweise verwendete Kohlenstoff quellen, wie Kohlehydrate (z.B. Glucose), zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwendet werden.

Das Kulturmedium muß eine oder mehrere Stickstoffquellen λ

sowie die Kohlenwasserstoffe als Nährstoffe enthalten. Geeignet sind die bei den bekannten Verfahren verwendeten Stickstoffquellen, beispielsweise Pepton, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder stickstoffhaltige Stoffe, Ferner können anorganische Salze, z.B. Natriumchlorid, Metallsalze, z.B. Zink-, Eisen- und Mangansalze, dem Medium in geringen Mengen zugesetzt werden.

Die Kultivierungsbedingungen, z.B. der p„-Wert des Mediums und die Kultivierungstemperatur, müssen so geregelt werden, daß maximales Wachstum der Zellen im Kulturmedium und maximale

909B85/0042

Anreicherung von Ribonucleinsäure in diesen Zellen erzielt werden. Im allgemeinen wird der Anfangs-p_H~Wert des Kulturmediums auf etwa 4,0-8,0 und die Kultivierungetemperatur auf etwa 20-40⁰O eingestellt. Unter diesen Kultivierungsbedingungen werden Zellen, die eine sehr hohe Ribonuoleinsäuremenge enthalten, im Laufe der Zeit im Kulturmedium gebildet.

Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die maximale Ribonuoleinsäuremenge in den gezüchteten Zellen angereichert ist. Die Zeit, die bis zur maximalen Anreicherung der RibonuOleinsäure erforderlich ist, ist in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren unterschiedlich, jedoch erreicht die Menge der Ribonucleinsäure in den Zellen im allgemeinen das Maximum in etwa 5-36 Stunden nach Beginn der Kultivierung.

Die auf diese Weise erhaltenen Zellen, die eine sehr hohe Menge Ribonucleinsäure enthalten, können von dem Kultivierungsmedium in beliebiger geeigneter Weise, z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt werden.

Bie in den so erhaltenen Hefezellen enthaltene Ribonucleinsäure kann von den Hefezellen nach Belieben als Ribonuoleinsäure oder als Oligonuoleotid nach beliebigen Methoden gewonnen werden, die für diesen Zweck bekannt sind. Beispielsweise kann die Ribonucleinsäure durch eine Extraktionsbehandlung gewonnen werden, bei der man die Hefe, die in einer 5-i5?Sigen wässrigen Natriumchloridlösung suspendiert ist, 0,5 bis 100 Stunden auf eine Temperatur von etwa 60-9O⁰C erhitzt und den flüssigen Anteil vom festen Anteil abtrennt(siehe "Biochemical Journal», II, Seite 319 (1917))» Oligonucleotid ₍ kann gewonnen werden, indem die wässrige Hefesuspension bei P₁₁ 7-8,0 für eine Dauer von 0,5-10 Stunden auf eine Temperatur von etwa 80-13O⁰G erhitzt und der flüssige Anteil vom festen Anteil abgetrennt wird (si*he japanisohe Patentveröffentliehung 9 991/1962).

909385/0042

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, in denen die Prozentsätze sich auf Volumen/Volumen beziehen, falls nicht anders angegeben. Hierbei verhalten sich Gewicht8-teile zu Raumteilen wie Gramm zu Milliliter.

Beispiel 1

10 ml Kulturmedium der nachstehend in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung werden nach Zugabe von 400 Mikrogramm Tetramethyldiaminoxanthyliumohlorid pro ml mit Candida tropicalis Berkhout beimpft. Das Medium wird 4 Tage bei 28⁰O unter Schütteln bebrütet. λ

Tabelle 1 Saccharose HatriumgIutamat Ammoniumsulfat

KH₂PO₊

MgSO₊.7 H₂O

NaGl OaCl₂

Biotin

Caloiumpantothenat

Inosit Nicotinsäure p-Aminobensoesäure

Pyridoxinhydrochlorid Riboflavin ThiaminhydroChlorid

A-JL

Aus der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan gebildete Mutanten isoliert, die gegen TetramethylAiaminoxanthyliumehlorid resietent Bind. Von diesen isolierten Mutanten wird ein Stamm (von den Erfindern als Candida tropiealie Berkhout- Oa3-Py bezeichnet) (ATCC Nr. 20 006) in 50 Baumteile eines Kulturmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung ge impft. Das Medium wird 24 Stunden bei 28⁰C geeohüttelt.

908885/0042

50	»
3	ti
25	ti
1	5 ^M
ο,	1 ^M
0,	1 «
ο,	/ig/1
CM	Il
400	Il
2000	η
400	η
200	Il
400	η
200	" Pt₁ 5,8
400

Tabelle 2

Schwere Paraffine*

NH₊NO₃ KH₂PO₊ K₂HPO₊ MgSO₊.7	H₂O
MnSO₊ .4	H₂O
ZnSO₊.7 PeSO₊.7	H₂O H₂O
Maisquellwasser
Wasser

Gewichtsteile

100

10

20

10

0,01 0,01 0,0t 10

1000 Raumteile P_H-Wert 6,0

a)Zusammensetzung:

"Ί 4~^21 "^⁰ r^lP⁸·³^ £i^ne C₁^C₁.,-Normalparaffine

Il IJ

C₂₂-C₂O-Normalparaffine b)Siedebereich: 262-349⁰O

90,7* 8,5*

Mit der erhaltenen Kulturbrtihe werden 1000 Haumteile des Kulturmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 20 Stunden bei 28⁰C geschüttelt wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 24 öewiohteteile (als Trookensubstane) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 12* Ribonuoleinsäure enthalten. Die Zellen werden in 250 Raumteilen einer auf p„ 8,0 eingestellten 0,5-molaren Natriumchloridlösung suspendiert· Die Suspension wird 30 Minuten auf 90⁰C erhitzt, um die Ribonuoleinsäure zu extrahieren. Anschließend werden die Zellen abfiltriert· Zum erhaltenen Piltrat werden 100 Raumteile Äthanol gegeben, wobei 2,2 Gewichtsteile Ribonuoleineäure erhalten werden«

Wenn ein Wildstamm von Candida tropicalis Berkhout an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 20 Gewichtsteile (als Trockensubstanz)

9(; 885/0042

Zellen erhalten, die,, bezogen auf daa Gesamtgewicht, nur RibonuOleinsäure enthalten.

Beispiel 2

/^a
Mit Candida prapsilosis Längerem et Talioe werden 10 ml des Kulturmediums der in Tabelle 1 τοη Beispiel 1 genannten Zusammensetzung, dem 400 ng Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid pro ml zugesetzt worden waren, geimpft« Das Medium wird 4 Tage "bei 28⁰O geschüttelt. Von der erhaltenen Kulturbrühe werden Bpontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen Tetramethyldiaminoxanthyliumohlorid resistent sind. Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der als Candida parapsilosis Langeron et Talioe~Ca37-Py (ATCC Nr. 20 008 ) bezeichnet wird, in 50 Eaumteile des in der folgenden Tabelle3 genannten Kulturmediums geimpft, das 24 Stunden unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet wird.

Tabelle 3 Gewichtsteile

Gasöl* 300

ITH₄NO₃ 10

KH₂PO₄ 20

K₂HPO₄ 10

MgSO₄.7 H₂O 1

MnS0₄«4 H₂O 0,01

ZnS0₄»7 H₂O 0,01

FeSO₄.7 H₂O 0,01

MaisquelLfwasser 10

Wasser IOOO Baumteile

Pg-Wert 6,0

* a) Zusammensetzung:C₁₄-C₁ γ-Normalparaffine 13,556

C₁₂-O₁ τ -Normalparaffine Verzweigte Paraffine 1θ?ί Monoeyolisohe Paraffine 25?ί Dicyelisohe Paraffine 20?ί Monoaromatisohe Kohlen-

909885/0042 "T^ _TM ^"

Diaromatische Kohlenwasserstoffe 8j6

. b) Siedebereich: 180-350°C
ο) Flammpunkt etwa 71⁰O

Die erhaltene Kulturbrühe wird zu 1000 Raumteilen des Kulturmediums der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung gegeben, worauf 24 Stunden bei 28⁰O geschüttelt wird» Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 22 Gew.-Teile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die 11,8ft (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonucleineäure enthalten. Die Zellen werden in 250 Raumteilen einer auf t P_H 8,0 eingestellten 0,5-molaren wässrigen Natriumehloridlösung suspendiert» Die Suspension wird 30 Minuten auf 90⁰O erhitzt, wobei die Ribonuoleinsäure extiäaiert wird. Naoh Entfernung der Zellen durch -Filtration werden zum erhaltenen Filtrat 100 Raumteile Äthanol gegeben, wobei 2,1 Gew.-Teile Ribonuoleinsäure erhalten werden.

Wenn an Stelle des genannten Mutanten ein Wlldstamm von Candida parapsilosis Langeron et Talice unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 21 Gew.-Teile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten, die nur 3»5 Gev/.-# (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonucleinsäure enthalten.

Beispiel 3

Mit Candida tropicalie Berkhout werlen 10 ml les Kulturmediums der in Tabelle 1 von Beispiel 1 genannten Zusammensetzung beimpft, dem 400yug 2,8-Bis(dimethylamino)acridiniumchlorid pro ml zugesetzt worden waren. Das Medium wird 4 Tage bei 28⁰O unter Schütteln bebrütet. Von der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen 2,8-Bis(dimethylamino)acridiniumehlorid resistent sind.

Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der von den Erfindern als Candida tropioalia Berkhout-Ca3~A0 (ATCC Nr.$0007 ) bezeichnet wird, in 50 Baumteile des Kulturmediums der in der folgenden Tabelle 4 genannten Zusammensetzung

^309385/0042 BADOKIGINAL

rer

geimpft. Das Medium wird 24 Stunden unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet.

Tabelle 4

Schweres Gasöl*

HH. liO-j 4 3

KH₂PO₄

MgSO₄.7 H₂O MnSO₄.4- H₂O ZnSO₄»7 H₂O PeSO₄.7 H₂O Maisquellwasser Wasser

GewichtBteile

200 10

0,01 0,01 0,01 10

1000 Raumteile P_H-Wert 6,0

⁺ a) Enthält 20?f O₁ C-C₂₀-No rra^rja raff Ine

b) Siedebereioh 272-380⁰G

o) Flammpunkt etwa 140⁰O

d) Spezifisches Gewicht 0,866

Mit der erhaltenen Kulturbrühe werden 1000 Raumteile des Kulturmediums der in Tabelle 4 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 20 Stunden bei 28⁰O geschüttelt wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 22 Gew.-Teile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, frejsogen auf das Gesamtgewicht, 11,5J* RibonuOleinsäure enthalten. Die Aufarbeitung der Zellen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ergibt 2,3 Gew.-Teile Ribonucleinsäure.

Berkhout Wenn ein Wildetamm von Gantida tropioalie'an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 22 Gew.-Teile (gerechnet als Trookensubstan«) Zellen erhalten, die nur 3,3?6 (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonuoleinsäure enthalten.

909885/00A2

Beispiel 4

Nach Bestrahlung mit Ultraviolettlioht (15 W) für eine Dauer von 30 Sekunden aus einer Höhe von 50 om werden mit Zellen von Candida tropicalis Berkhout 10 ml des Kulturmediums der in Tabelle 1 von Beispiel Ϊ genannten Zusammensetzung geimpft, dem 500 ng 3,7-Diaminophenothiazoniumohlorid pro ml zugesetzt worden waren, worauf 4 Tage bei 28⁰O geschüttelt wird. Ton der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen 3,7-Diaminophenothiazoniumchlorid resistent sind.

Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der von den Erfindern als Candida tropicalis Berkhout-Ca3-TH bezeichnet wird (ATCC Nr.20 005 ), in 50 Raumteile eines Kulturmediums geimpft, das die in Tabelle 2 von Beispiel 1 genannte Zusam-r mensetzung hat, jedoch an Stelle der schweren Paraffine reines n-Hexadecan enthält. Anschließend wird 24 Stunden bei 28⁰C geschüttelt.

Mit der erhaltenen Kulturbrühe werden 1000 Raumteile des Kulturmediums beimpft, das die vorstehend Kenannte Zusammen-

' _n /untter !schütteln

eetzung hat, worauf 22 Stunden bei 28 (J bebrütet wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 25 Raumteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 12,2^ Ribonucleineäure enthalten. Die Zellen werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,5 G-ew.-Teile Ribonucleinsäure erhalten werden«,

Wenn ein Wildstamm von Candida tropiealie Berkhout an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 22 Gew.-Teile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten, die nur 3 »45* Ribonucleineäure enthalten.

C-: 385/0042

Beispiel 5

Mit dem gegen 3,7-Diamino-phenothiaaoniumchlorid resistenten Mutanten Oandida tropioalis Berkhout-Ca3-TH (AiDCO Nr. 20 005 ) werden 1000 Haumteile des Kulturmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weise geimpft, wobei 24 Gew.-Ieile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 11,4$ EibonuOleinsäure enthalten.

Pie Zellen werden in 250 Raumteilen einer Matriumhydroxydlösung suspendiert, deren p^y-Wert 8,0 beträgt. Die Suspension wird 60 Minuten auf 13O⁰G erhitzt. Zur Suspension werden 50 Gew.-Teile eines im Handel erhältlichen Filterhilfsmittel gegeben. Das erhaltene Gemisch wird unter Druck filtriert. Zum Filtrat werden 1000 Haumteile Äthanol gegeben, wobei 23 Gew.-Teile Oligonucleotid erhalten werden*

Isolierung und Selektion der verwendeten Mutanten

Mit Zellen der Mikroorganismen werden 10 ml eines Kulturmediums geimpft, das hergestellt wird, indem das Kulturmedium der in Tabelle 1 genannten .Zusammensetzung durch die ent-

/(in Konzentration; sprechend bemessene Menge/aes Farbstoffs ergänzt wird, worauf das Medium 4 Tage bei 28°0 geschüttelt wird. Im Gegensatz zu Zellen von Wildstämmen, die praktisch nicht wachsen, sind die Mutantenzellen in der Lage, au wachsen. Die erhaltene Kulturbrühe wird auf der Oberfläche einer synthetischen Agarplatte ausgebreitet, die die entsprechend bemessene Menge des Farbstoffs enthält, woduroh die Zellen des Mutanten auf der Oberfläche der Agarplatte während der Bebrütung für eine Dauer von 3-7 Tagen zu Kolonien heranwachsen können. Diese Kolonien, die aus Mutantenzellen bestehen, die gegen den Farbstoff resistent sind, werden voneinander isoliert. Mit jedem dieser Mutanten wird das eynthetische flüssige Medium ' beimpft, worauf unter den in jedem Beispiel genannten Bedingungen kultiviert wird. Die Trübungen der Kulturbrühe werden gemessen, um die Fortpflanzung der Mutanten zu ermitteln.

309885/0042

-H-

Won diesen Mutanten wird der Stamm, der eine hohe Dichte ergibt, für die Erzeugung in der beschriebenen Weise ausgewählt,»

909885/0042

Claims

- 15 - 50.8.1966

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, die eine sehr große Menge an Ribonucleinsäure enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutanten der Gattung Candida, der gegen Thiazinfarbstoffe, Oxazinfarbstoffe und Acridinfarbstoffe resistent ist, auf ein Kulturmedium impft, das eine Kohlenstoffquelle, die hauptsächlich aus Kohlenwasserstoffen besteht, die wenigstens 10 % (Vol./Vol.) η-Paraffine mit 14 bis 21 Kohlenstoffatomen enthalten, und andere zum Wachstum des Mutanten erforderliche Nährstoffe enthält, und das Kulturmedium bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C und einem p„-Wert von etwa 4,0 bis 8,0 unter aeroben Bedingungen bebrütet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff 3,7-Diaminophenothiazoniumohlorid, Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid oder 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid und als Mutant Candida tropicalis Berkhout oder Candida i

parapsiloßis Langeron et Talice verwendet.

J3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutanten verwendet, der befäHgt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das den Farbstoff in einer Konzentration von mindestens der 5-fachen Mindestkonzentration enthält, die zur Inhibierung des Wachstums der wilden Stämme des Mutanten erforderlich ist.

151 778 A

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium etwa 3 bis 20 % (Vol./Vol.) der n-Parai'fine enthält.

Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mutant zu Candida tropicalis Berkhout gehört und befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das mindestens 450 -ug/ml 3,7-Diaminophenothiazoniumchlorid enthält.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mutant zu Candida tropicalis Berkhout gehört und befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das mindestens 150/Ug/ml Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mutant zu Candida tropicalis Berkhout gehört und befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das mindestens 300 ,ug/ml 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mutant zu Candida parapsilosis Langeron et Talice gehört und befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das mindestens 150/Ug/ml Tetramethyl diaminoxanthyliumchlorid enthält-.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutant Candida tropicalis Berkhout-Ca3-TH (ATCC Nr. 20 005) verwendet.

0 CU /

BAD ORIGINAL

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutant Candida tropicalis Berkhout~Ca3-Py (ATCC Nr. 20 006) verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutant Candida tropicalis Berkhout-Caj3-A0 (ATCC Nr. 20 007) verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutant Candida parapsilosis Langeron et Talice-Ca57-Py (ATCC Nr. 20 008) verwendet.

13· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoffe schwere Paraffine, die etwa 90 % (Vol./Vol.) der η-Paraffine enthalten und einen Siedebereich zwischen etwa 2Ö2 und 349⁰C haben, verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein schweres Gasöl verwendet, Λ das etwa 17 % (Vol./Vol.) η-Paraffine mit 15 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält und das einen Siedebereich zwischen etwa 272 und 386⁰C hat.

15. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein Gasöl verwendet, das etwa 14 % (Vol./Vol.) n-Paraffine mit 14 bis L7 Kohlenstoffatomen enthält und das einen Siedebereieh zwischen etwa 180 und 350 C hat.

Lo. Verfahren nach Anspruch 1 bis j5> dadurch gekennzeichnet,, daß man als Kohlenwasserstoff n-Hexadecan verwendet, 9 0 M ι G 5 / 0 Π /, ? _BAD